Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Сжатая ZIP-папка / ЛК_ген_7

.doc
Скачиваний:
17
Добавлен:
21.03.2015
Размер:
62.98 Кб
Скачать

ЛЕКЦИЯ 8 - ГЕНЕТИКА

ЛЕКЦИЯ 8

СЦЕПЛЕНИЕ ПРИЗНАКОВ И КРОССИНГОВЕР.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ, ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И

РЕСТРИКЦИОННЫЕ КАРТЫ ХРОМОСОМ

Принципы генетического анализа, использованные в предыдущих лекциях, предполагали, что независимое комбинирование признаков может осуществляться лишь при условии, что гены, определяющие такие признаки, находятся в разных хромосомах. Следовательно, число пар признаков, по которым наблюдается независимое наследование, ограничено числом пар хромосом организма.

С другой стороны, число признаков значительно превышает число пар хромосом, т.е. каждая хромосома содержит по множеству генов, определяющих многие признаки.

В предыдущей лекции мы говорили о явлении наследования, сцепленного с полом, точнее, с половыми хромосомами. Поэтому в целом признаки, определяемые генами любой одной хромосомы, обусловливают явление сцепленного наследования этих признаков. В связи с этим совместное наследование генов, ограничивающее их свободное комбинирование, и называют сцеплением генов.

Изучение наследования ряда признаков показало, что при скрещивании гетерозигот по двум признакам с двойной гомозиготой по рецессивным аллелям в анализирующем скрещивании наблюдали расщепление 1:1. Этот феномен можно было объяснить только тем, что оба изучаемых признака кодируются генами одной хромосомы. Т.е., если у обычной гетерозиготы по двум признакам (АаBb) образуется 4 сорта гамет (AB, Ab, aB, ab), и в анализирующем скрещивании получаем соотношение потомков по фенотипу в соотношении 1:1:1:1, то при сцепленном наследовании, по-видимому, может образовываться у такой гетерозиготы только два вида гамет, напр., АВ и аb.

Тогда полная запись анализирующего скрещивания по двум признакам имеет следующий вид:

Р АаBb x aabb

Гаметы AB

Ab

aB x ab

ab

F1 AaBb, Aabb, aaBb, aabb (1:1:1:1)

В рассматриваемом случае сцепленного наследования нужно обратить внимание на соответствующую запись для обозначения генотипа и гамет:

Р AB/ab x ab/ab

Гаметы AB

ab x ab

F1 AB/ab, ab/ab (1:1)

Однако написанное отношение часто отклонялось от экспериментально полученного. Так, полное совпадение сочетания родительских аллелей (напр., AB и ab) наблюдали у потомков лишь в 70-80% случаев. В других случаях среди потомков наблюдали иное сочетание аллелей (напр., Ab и aB). Эти результаты экспериментов свидетельствовали как бы о неполном сцеплении признаков.

Исследования в лаборатории Т.Моргана и его школы показали, что такое неполное сцепление может быть вызвано тем, что в гомологичной паре хромосом происходит обмен генами, в результате чего нарушается сочетание аллелей, наблюдаемых у родительских организмов. Явление обмена идентичными участками гомологичных хромосом с содержащимися в них генами назвали перекрёстом хромосом или кроссинговером.

Цитологически это явление было открыто ещё в 1909 году исследователем Янссенсом. Изучая мейоз в процессе сперматогенеза у земноводных Янссенс обнаружил, что после конъюгации пары гомологичных хромосом при расхождении они образуют фигуры, напоминающие вид греческой буквы «хи», и названные поэтому – хиазмами.

Опираясь на эти наблюдения Т.Морган предположил, что образование хиазм приводит у гомологичных хромосом к обмену участками, несущими блоки генов. И таким образом он объяснил экспериментальные результаты генетического анализа в случаях неполного сцепления признаков.

Необходимо отметить, что кроссинговер можно обнаружить лишь в том случае, если гены находятся в гетерозиготном состоянии, напр., AB/ab или Ab/aB. При гомозиготном состоянии генов (AB/AB, ab/ab) перекрёст хромосом обнаружить невозможно, поскольку обмен идентичными участками не даёт новых комбинаций аллелей в гаметах и у потомков.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДОКАЗАТЕЛЬСТВА ПЕРЕКРЁСТА ХРОМОСОМ

В одном из классических опытов Т.Моргана скрещивали серых мух с рудиментарными крыльями (b+ vg // b+ vg) с чёрными мухами с нормальными крыльями (b vg+ // b vg+). В первом поколении все дигетерозиготы были серыми с нормальными крыльями (b+ vg // b vg+ ). При анализирующем скрещивании ожидалось расщепление 1:1:

Р b+ vg // b vg+ x b vg // b vg

Гаметы b+ vg , b vg+ x b vg

F1 b+ vg // b vg, b vg+ // b vg

Однако, если в качестве анализатора брали самца, то в потомстве наблюдали иное расщепление. Кроме родительских комбинаций признаков появились новые типы мух с чёрным телом и короткими крыльями, а также мухи с серым телом и нормальными крыльями. Следовательно, в указанном эксперименте сцепление генов нарушалось.

Окончательные цитологические доказательства явления кроссинговера были получены в 30-х годах ХХ века в экспериментах по изучению морфологии хромосом.

В целом число групп сцепления соответствует числу пар гомологичных хромосом. Определение групп сцепления – чрезвычайно трудоёмкая работа, требующая большого числа скрещиваний, наблюдений, мутантных форм организма по разным признакам. Понятно, что чем больше хромосом у вида, тем труднее определить группы сцепления.

Также следует заметить, что эффект полного сцепления признаков не всегда связан с присутствием соответствующих генов в одной хромосоме. Иногда он обусловлен явлением плейотропии, при котором несколько признаков определяются действием единичного гена.

ВЕЛИЧИНА ПЕРЕКРЁСТА И ЛИНЕЙНОЕ РАСПОЛОЖЕНИЕ ГЕНОВ В ХРОМОСОМАХ

В случае кроссинговера числовые соотношения особей с разным фенотипом, полученные при расщеплении признаков, подчиняются неким закономерностям. При этом величина кроссинговера измеряется как отношение числа кроссоверных особей (т.е. тех, у которых наблюдают новое сочетание признаков за счёт кроссинговера) к общему числу особей в потомстве анализирующего скрещивания и выражается в процентах.

Поскольку рекомбинация происходит реципрокно (взаимно) между родительскими хромосомами, то подсчёт кроссоверных классов рассматривают и подсчитывают как результат одного события. Величина перекрёста хромосом отражает силу сцепления генов в хромосоме: чем больше величина перекрёста, тем меньше сила сцепления.

Если предположить, что гены расположены в хромосомах линейно, то частота кроссинговера будет отражать относительное расстояние между этими генами. Т.е. чем чаще происходит кроссинговер, тем дальше отстоят друг от друга гены и, наоборот, чем реже кроссинговер, тем гены расположены ближе друг к другу.

Вернёмся к эксперименту с мухами. В последнем примере говорилось о том. что если в качестве линии-анализатора используют самца, гомозиготного по рецессивным признакам, то в поколении появляются новые типы мух с чёрным телом и нормальными крыльями. Такие мухи составляли в эксперименте около 17% от общего числа потомков анализирующего скрещивания. В этом случае говорят, что рекомбинация генов чёрного цвета тела и коротких крыльев у дрозофилы происходит с частотой 17%. Эта величина характеризует расстояние между данными генами в хромосоме.

На основе многочисленных генетических исследований Т.Морган задолго до открытия двойной спирали сформулировал гипотезу линейного расположения генов в хромосоме.

В качестве подтверждения этой гипотезы рассмотрим один из классических экспериментов Т.Моргана. Самки, гетерозиготные по трём сцепленным рецессивным аллелям генов, определяющим жёлтую окраску тела – у, белый цвет глаз – w и вильчатые крылья – bi были скрещены с самцами, гомозиготными по всем рецессивным аллелям генов.

В потомстве было получено 1,2% мух, кроссоверных от перекрёста между генами y и w, 3,5% - от кроссинговера между генами w и bi, и 4,7% - между генами y и bi. Изобразив полученные результаты в виде схемы:

Жёлтое тело

Белые глаза 1,2% 4,7%

3,5% Вильчатые крылья

видно, что расстояние между генами y и bi равно 4,7%, что совпадает с суммой расстояний между отдельными генами (y-w) + (w-bi). Воспроизводимость этих результатов в повторных опытах указывает на то, что местоположение генов вдоль хромосомы строго фиксировано, т.е. каждый ген занимает своё определённое место – локус.

Утвердившись в правильности своих предположений, Т.Морган пошёл дальше. Он допустил, что перекрёст между гомологичными хромосомами может происходить сразу в нескольких точках, т.е. кроссинговер может быть одинарным, двойным, тройным, т.е. множественным. В таком случае число потомков, кроссоверных, напр., по генам А и В и генам В и С, может не совпадать с числом особей, кроссоверных по генам А и С (даже в случае последовательного расположения генов А, В и С). Такие результаты могут говорить о, напр., двойном кроссинговере, который можно доказать экспериментально, анализируя потомство по разным генам, и учитывая их взаимное расположение в хромосоме.

В результате исследований также было установлено, что кроссинговер, происшедший в одном месте хромосомы, подавляет кроссинговер в близлежащих районах. Это явление получило название интерференции. При двойном перекрёсте интерференция проявляется особенно сильно. Величина этого явления может быть экспериментально измерена отношением наблюдаемого числа двойных перекрёстов к теоретически ожидаемому и выражается в процентах.

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГЕНА И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ

Первая задача этого направления исследований состоит в том, чтобы определить, в какой хромосоме находится нужный ген, также – какие ещё гены находятся в этой же хромосоме. Т.е. необходимо выявить группу сцепления, число которых у каждого вида соответствует гаплоидному набору хромосом.

Исследование частоты кроссинговера (числа особей с сочетанием признаков, не предусмотренных теоретически ожидаемым) позволяет определить расстояние между генами, определяющими такие признаки. Во всех ранних опытах было показано, что при рассмотрении трёх сцепленных генов величина перекрёста между двумя генами всегда равна сумме или разности величин перекрёста между двумя другими.

Напр., известно, что гены А, В и С находятся в одной хромосоме. В результате экспериментов установлено, что величина кроссинговера между генами А и В составляет 5,1%, а между генами В и С – 2,9%. Для выявления последовательности расположения генов необходимо провести определение кроссинговера между генами А и С. Было установлено, что оно равно 2,2%. Сравнивая полученные результаты делаем вывод о том, что ген С находится между генами А и В (АВ=АС+ВС).

Для определения местоположения следующего гена в хромосоме проводят анализирующее скрещивание и вычисляют процент кроссинговера между новым геном и тремя уже известными. В результате может быть построена генетическая карта каждой хромосомы. Она представляет собой линию с перечислением порядка расположения генов на расстояниях, соответствующих величинам кроссинговера.

Очевидно, что составление таких карт требует выявление множества мутантных генов и проведение огромного числа скрещиваний, что возможно в результате работы многих коллективов генетиков. Такие карты построены для дрозофилы (у которой изучено более 500 генов), кукурузы (имеющей в 10 хромосомах свыше 400 генов), нейроспоры, помидоров и многих других организмов.

При этом следует обратить внимание на то, что на построенных таким образом генетических картах некоторые гены могут располагаться друг от друга на расстоянии до 100 и даже 150% длины хромосомы. Однако частота кроссинговера фактически не может превышать 50% (максимальный взаимный обмен между хромосомами не может превысить их половинок). Поэтому следует всегда помнить о том, что те проценты кроссинговера, которые определены в эксперименте, вовсе не отражают физические проценты длины хромосомы. Поэтому было принято называть выявленные в эксперименте проценты кроссоверных особей новыми единицами измерения, получившими название морганид.

Рассмотрение генетических карт приводит к выводу о неравномерном распределении генов по длине хромосомы. Где-то они расположены часто, другие участки оказываются генетически неактивными. Действительно ли это так? И можно ли найти доказательства выявленной картины иными способами?

Прямые доказательства обмена участками хромосом были получены в 30-х годах ХХ столетия с помощью цитологического метода. Так, Г.Крейтону и Б.МакКлинток удалось получить у кукурузы линию, у которой две гомологичные хромосомы различаются морфологически. Одна была нормальной, а другая имела утолщение на конце одного плеча, а второе плечо было удлинено. Эти особенности в строении пары хромосом легко обнаруживались при цитологических исследованиях.

Нормальная хромосома несла рецессивный ген отсутствия окраски эндосперма зерна и доминантный ген крахмалистого эндосперма.

Изменённая хромосома несла доминантный ген окрашенного эндосперма и рецессивный ген восковидного эндосперма.

Дигетерозиготу с изменённой хромосомой скрещивали с линией, рецессивной по обоим признакам, и имеющей нормальные хромосомы.

В потомстве получили кроссоверные и некроссоверные зёрна. Цитологическое исследование показало, что кроссоверные зёрна всегда содержали хромосому с обменявшимися участками, т.е. нормальной длины с утолщением, либо – удлинённую без утолщения.

Аналогичные доказательства на дрозофиле были получены К.Штерном.

Таким образом, был создан фундамент учения о наследственности и изменчивости организмов, которые обусловлены хромосомами и их отдельными участками – генами.

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ КАРТЫ

Представления о линейности расположения генов в хромосомах и составление генетических карт, с одной стороны, и появление цитологических доказательств кроссинговера – с другой, привело к необходимости построения цитологических карт для их сопоставления с генетическими, полученными путём учёта кроссоверных особей, а также для визуального подтверждения тех закономерностей, которые были выявлены с помощью генетического анализа.

Один из методов сопоставления генетических и цитологических карт основан на использовании хромосомных перестроек – транслокаций. Это явление состоит в том, что при образовании разрывов у двух негомологичных хромосом полученные фрагменты присоединяются к противоположным хромосомам. Сравнение с нормальными хромосомами позволяет выявить точки разрывов и измерить величины новых фрагментов хромосом. В результате генетически учитывается частота кроссинговера, а цитологически – непосредственно измеряется величина переместившихся фрагментов.

Описанный метод позволил Ф.Добжанскому составить первые цитологические карты хромосом и сопоставить их с генетическими. Цитологические карты полностью подтвердили расположение генов, установленных методом генетического анализа. Проведённое исследование также подтвердило, что неравномерность частоты перекрёста генов обусловлена величиной участка хромосомы. Изучение гигантских хромосом позволило уточнить расположение целого ряда генов. При этом окрашенные хромосомы представляют собой чередующуюся последовательность тёмных и светлых участков (дисков) хроматина. Сравнение цитологической картины у нормальных и кроссоверных особей позволяет выявить соответствие определённых участков конкретным генам.

Таким образом, теоретические представления генетического анализа нашли полное подтверждение с помощью цитологического метода

РЕСТРИКЦИОННЫЕ КАРТЫ

Дальнейшее развитие генетики стало затруднительным в связи с тем, что большинство многоклеточных организмов имеют длительные циклы развития, медленно размножаются, имеют небольшое число потомков, обладают значительным числом хромосом и определяемых ими признаков. Кроме того, не все организмы имеют гигантские хромосомы. Всё это дополнялось необходимостью расширения экспериментальной базы и значительных финансовых вложений в развитие науки с неясностью скорой практической отдачи, несмотря на то, что генетический анализ был доведён до высокого совершенства.

Изложенное выше объясняет то, что внимание генетиков всё больше стали привлекать микроорганизмы и вирусы. Они позволяют исследовать от 10 6 до 10 11 потомков, тогда как многоклеточные организмы позволяют изучать всего 10 2 – 10 5 потомков двух особей. Микроорганизмы характеризуются большим разнообразием хорошо различимых биохимических и физиологических свойств. При этом понятие признака и биохимического свойства у них часто совпадает, благодаря чему удаётся проследить все этапы на пути от гена к признаку.

Впервые это было показано в опытах американских исследователей Д.Бидла и Э.Татума с плесневым грибом Neurospora crassa в 1941 году. Этот гриб способен синтезировать все белковые аминокислоты и витамины из неорганических веществ и жить на питательной среде в отсутствие экзогенных аминокислот и витаминов.

В результате воздействия внешних факторов у гриба появляются мутантные (ауксотрофные) формы, не способные синтезировать какую-либо аминокислоту или витамин. Биохимически это объясняется отсутствием специального фермента, необходимого для синтеза такой аминокислоты или витамина.

На основании таких экспериментов Бидл и Татум сделали вывод о том, что способность продуцировать какое-либо соединение является специфической функцией определённого гена, управляющего синтезом определённого фермента. В результате была сформулирована одна из важнейших гипотез, о которой мы уже говорили, - «один ген – один фермент». По гипотезе – каждый ген определяет синтез одного фермента. А поскольку все ферменты – это белки, то было сделано предположение о том, что синтез всех белков определяется соответствующими генами.

Так были заложены основы молекулярной генетики. Однако построение рестрикционных карт стало возможным значительно позже благодаря развитию методов органической химии и биохимии.

В каждом организме присутствуют специфические ферменты – эндонуклеазы, способные расщеплять молекулы ДНК в строго определённых местах (последовательностях ДНК). Их называют рестриктазами. Эти ферменты способны расщепить молекулу ДНК на относительно небольшие фрагменты, содержащие от одного до нескольких генов.

К настоящему времени известно более 200 типов рестриктаз, каждая из которых имеет своё название. Напр., рестриктаза EcoRI выделена из кишечной палочки – Escherichia (первая буква названия фермента) coli (две другие буквы названия), R – название штамма микроорганизма, из которого выделен фермент, римская цифра указывает порядковый номер фермента в ряду аналогичных рестриктаз, выделенных из этого же организма.

Каждый такой фермент узнаёт определённую 4-7-членную последовательность нуклеотидов в двухцепочечной структуре ДНК. Разрезание ДНК по этим участкам (сайтам) приводит к образованию многих кусочков различной длины, которые можно разделить методом электрофореза в геле. Таким образом можно получить последовательности, соответствующие по своей структуре некоторым генам.

Изучая нуклеотидную методом секвенирования последовательность таких отрезков ДНК, полученных с помощью самых разных рестриктаз, и сопоставляя полученные результаты, можно определить нуклеотидную последовательность всех генов хромосомы. Исследование ДНК всего организма позволяют создавать его геномную библиотеку.

Таким образом, рестрикционные карты представляют собой нуклеотидные последовательности отдельных генов.

6

Соседние файлы в папке Сжатая ZIP-папка