Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Микроскопические грибы рода Fusarium. Учебное пособие по дисциплине «Микробиология» для студентов по специальности 36.05.01 «Ветеринария»
.pdf
31
Ключ к определению гриба F. oxysporum
Морфология колоний – быстрорастущие, обильный воздушный
мицелий.
Микроконидии овально- цилиндрические с одинаковым диаметром.
Конидиогенные клетки: не имеют перетяжки, верхушка имеет вид
сосочка. Хламидоспоры обильно образуются в мицелии (оболочка
многослойная, имеет наружный покров).
32
Глава 9 Виды мицелиальных грибов F. moniliforme
Микроконидии F. moniliforme разнообразные в виде цепочки, могут
образовываться на ответвлениях мицелия одиночно и в виде ложных головок,
склеиваться около конидиеносца (Рисунок 39).
Рисунок 39 – Микроскопия мазка F. moniliforme. Микроконидии F.
moniliforme по форме овальные или яйцевидные (х40)
Рисунок 40 – Микроскопия мазка F. moniliforme (х40)
Ключ к определению гриба F. moniliforme
Колонии быстрорастущие, обильный мицелий, белый, розовый.
Макроконидии образуются в спородохиях.
Микроконидии обильные, обратно-овально-яйцевидные, имеют
булавовидную форму, суженную у основания.
33
Глава 10 Виды мицелиальных грибов Секция Lateritium
F. lateritium (Gibberella baccata) распространен повсеместно,
характерен на древесных и кустарниковых пород (Рисунок 40-42).
Рисунок 40 – Культура гриба
F. lateritium на среде Чапека,
рост при температуре 24
0
С, 7 суток
Рисунок 41 – Единичная
колония гриба F. lateritium на среде
Чапека, рост при температуре 240 С,
7 суток
Рисунок 42 – Микроскопия препарата F. lateritium (х40)
Ключ к определению гриба F. lateritium
Морфология: колонии медленно растущие.
Мицелий бархатисто- пушистый, белый, бледно-персиковый
Спородохии обильные, кремовые, оранжевые.
34
Глава 11 Практическая работа с грибами Fusarium
Выделение грибов субэпидермальной микобиоты зерен.
При работе с культурами необходимо строго соблюдать правила
асептики для предупреждения заражения воздуха помещения спорами грибов.
Перед посевом зерен проводят дезинфекцию их поверхности 3%-ным
составом раствора формалина, зерна заворачивают в марлевую салфетку,
размером 10х10 см и помещают в химический стакан вместимостью 100 см
3
.
Наливают дезинфицирующий раствор в таком количестве, чтобы зерна были
полностью погружены в раствор. Через 1,5 мин дезинфектант должен быть
полностью слит, марлевый мешочек с зерном отжат, после чего зерна
двукратно промывают стерильной водой, к которой предварительно для
нейтрализации формалина добавляют 4 мл 5%-ного раствора водного аммиака
(раствор готовят на стерильной воде) на 1000 мл воды. Промывную воду
сливают, оставляя зерна завернутыми в марлю.
Подготовленное зерно высевают на агаризированную среду Чапека, для
микологического исследования (Рисунок 43).
Рисунок 43 – Подготовка зерна для выделения грибов
субэпидермальной микобиоты
35
Метод накопления грибов рода Fusarium.
Используют для выделения грибов из зерна, силоса, грубых и
мучнистых кормов. Исследуемый образец зерна выращивают в чашках Петри
на увлажненной фильтровальной бумаге. Следует помнить, что излишнее
увлажнение может задерживать рост грибов. На 3 слоя фильтровальной
бумаги (с предварительно разложенным пораженным зерном) в чашки Петри
выливают 5 мл дистиллированной воды, термостатируют 3 суток при
температуре 24
0
С, делают препарат и микроскопируют с целью
идентификации (Рисунок 44).
Рисунок 44 – Отбор зерна для микологического анализа
Микроскопия грибов рода Fusarium.
Частицы мицелия со спороношением, взятые микологическим крючком
помещают на предметное стекло и наносят небольшую каплю фиксирующей
жидкости для препаратов, при этом используя вторую иглу, для расправления
мицелия.
36
Покрывают препарат покровным стеклом, слегка надавливают на него,
стараясь не загрязнить сверху, избыток жидкости следует убрать с помощью
фильтровальной бумаги (Рисунок 45).
Рисунок 45 – Микроскопия препарата гриба вида F. sporotrichioides
(х40)
Фиксирующей жидкостью для приготовления препаратов грибов из
родов Fusarium, Aspergillus, Penicillium является лактофенол Аммана
(дистиллированная вода – 1 часть, молочная кислота – 1часть, глицерин – 2
части, фенол – 1 часть).
Прежде чем поместить материал в эту жидкость, его следует
кратковременно (до 30 секунд) обработать 70
%-ным этиловым спиртом для
смачивания спор и удаления их избытка, препятствующего изучению
характера спороношения (Рисунок 46).
37
Рисунок 46 – Отбор мицелиальной культуры с помощью
микологического крючка
Выделение грибов и чистой культуры
Родовую и видовую принадлежность грибов устанавливают в
первичном посеве, однако чаще, род и вид гриба определяют после выделения
его в чистую культуру, для этого применяют два метода: метод
непосредственного пересева и метод разделения. Получение чистых культур
необходимо так же для дальнейшего изучения их токсигенных, патогенных и
других свойств.
Метод непосредственного пересева применяют в том случае, если в
первичном посеве выросли изолированные колонии. Пересевают маленький
кусочек мицелия или часть колонии, для чего осторожно берут их
микологическим крючком и помещают на поверхность питательной среды.
При наличии обильного спороношения микологическим крючком,
предварительно увлажненным в агаре той чашки или пробирки, куда будет
проведен пересев, лишь касаются спороносящей поверхности колонии,
перенося при этом минимальное количество спор. Для длительного
поддержания культур их пересевают один раз в год, хранят при температуре
4-5
0
С; ватные пробки при этом должны быть защищены колпачками из
фильтровальной бумаги или фольги.
38
Пересев грибов с целью их идентификации следует проводить на
агаровые пластинки чашки Петри; с целью поддержания культур для
длительного хранения их в качестве эталонов или для дальнейшего изучения
их биологических свойств – на скошенный агар в пробирки.
При использовании пробирок материал помещают в нижней трети
косяка, чашки во время инокуляции, а также дальнейшей инкубации держат
кверху дном для предотвращения рассеивания спор по всей агаровой
пластинке.
Биотестирование микроскопических грибов на кроликах
В случае токсичности изолята гриба можно дополнительно провести
биотестирование на кроликах методом кожной пробы.
Для этого у кролика выстригают волосяной покров на 2-х участках в
области бедра размером примерно 6х6 см. В один участок втирают суспензию,
приготовленную из мицелиальной пленки гриба, а во второй – раствор 0,9 %
NaCl (контроль). С целью предупреждения слизывания экстракта,
нанесенного на кожу, на время эксперимента на шею кролика надевают
воротник (Рисунок 47).
Рисунок 47 – Биотестирование мицелиальной суспензии на кроликах
Оценку результатов биотестирования проводят через 24, 48 и 72 часа.
Критерии оценки результата:
39
(–) нулевая степень – отсутствие видимых изменений на коже;
(+) первая степень – покраснение, повышение чувствительности и/или
шелушение; (++) вторая степень – болезненность, утолщение кожи и/или
мелкая сыпь в виде пузырьков темноватого цвета;
(+++) третья степень – выраженное утолщение кожи, болезненность и
складчатость, поверхностный некроз и/или образование струпа;
(++++) четвертая степень – сильный отек в виде валика на нижней
границе участка, сухой некроз и/или сплошной толстый струп.
Биотестирование на инфузориях Paramecium caudatum
Токсичность выделенных мицелиальных грибов можно определить
методом биотестирования на простейших P. caudatum. Для извлечения
токсических веществ из культур, выросших на питательной среде, готовятся
водные экстракты. Выросшие на поверхности агара колонии мицелия
аккуратно снимают и помещают в пробирку, предварительно измельчив до
кашицеобразного состояния, с добавлением дистиллированной воды в
соотношении 1:1 по объему, с последующим взбалтыванием в течение 10
минут при 160 об/мин. Готовую суспензию помещают в холодильник на 24
часа при 100 0С.
На обезжиренное предметное стекло наносится две капли
мицелиального экстракта с добавлением одной капли жидкой среды (раствор
Лозина-Лозинского следующего состава: NaCl – 0,01 %; KCl – 0,001 %; CaCl2
2-водный – 0,001 %; MgCl2 6-водный – 0,001 %; NaHCO3 – 0,002 %) с
простейшими.
Оценка поведения парамеций проводится микроскопически. Если в
течение 3-5 минут простейшие не погибают, то их переносят в чашку Петри
на смоченную водой фильтровальную бумагу (чтобы предотвратить
высыхание) и продолжают наблюдение.
40
Критерием для определения чувствительности парамеций к
токсическим веществам считается время от начала воздействия испытуемого
экстракта до гибели простейших.
Учет результатов биотестирования проводят в течение 2 часов.
Критерии оценки биотестирования: токсичный – выживших 0-39 %;
слаботоксичный – выживших 40-69 %; нетоксичный – выживших 70-100 %.
Биотестирование на личинках восковой моли Galleria mellonella
Дополнительным методом оценки токсичности выделенных полевых
изолятов является биотестирование на личинках восковой моли. Для
обнаружения токсических веществ из грибного мицелия, выросших на
питательной среде, готовят водную суспензию на дистиллированной воде в
соотношении 1:1 по объему, с последующим взбалтыванием в течение 10
минут при 160 об/мин. Готовый экстракт помещают в холодильник на 24 часа
при 10
0
С
По форме чашки Петри вырезается фильтровальный круг, который
помещается внутрь чашки. Фильтровальный круг пропитывают суспензией
мицелиального гриба в количестве 3-5 мл. Оценку поведения Galleria
mellonella проводят визуально.
Критерием для определения чувствительности личинок Galleria
mellonella к токсическим веществам считается время от начала воздействия
испытуемого экстракта до гибели личинок (Рисунок 48).
Учет результатов биотестирования проводят в течение 2-х суток.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]