Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биотехнология. Учебно-методическое пособие для студентов института ветеринарной медицины и зоотехнии по специальности 36.05.01 Ветеринария, профиль Бо
.pdf
21
ТЕМА № 6
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА. ВТОРИЧНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
Вид занятия: практическое.
Время: 90 минут.
Место проведения: учебная аудитория.
Цель занятия: изучить понятие, роль и значение моноклональных антител
и вторичных соединений.
Литература: 1, 2, 3.
Материальное обеспечение: учебно-методическое пособие.
Формы и методы контроля: устный опрос и проверка выполненных заданий.
Содержание и методика проведения занятия
Организационные вопросы (учет наличия студентов, формулирование
темы и цели занятия) - 5 минут.
Контрольные вопросы и сообщения – 60 минут:
1. Понятие моноклональных антител.
2. Применение моноклональных антител.
Моноклональные антитела (МА) - это антитела, выра-батываемые иммунными клетками, принадлежащими к од- ному клеточному клону, т. е. произошедшими из одной клетки-предшественницы. Они могут быть выработаны по- чти
на любое вещество, которое антитело будет специфиче-ски связывать. Их можно
далее использовать для обнару-жения этого вещества или его очистки.
Моноклональные антитела широко применяют в биохимии, молекулярной
биологии и медицине. Если их используют в качестве лекарства, то название последнего оканчивается на mab (от англ. monoclonal antibody).
Впервые методика получения моноклональных антител с помощью гибридомной технологии была опубликована в 1975 г. Ж. Келером и С. Мильштейном,
которые в 1984 г. получили за ее создание Нобелевскую премию. Именно они,
предварительно введя в организм антиген и вызвав та- ким образом иммунный
ответ, извлекли лимфоидную клетку, продуцирующую соответствующие антитела, и объединили ее с клеткой опухоли (миеломы) (рис. 6.15). В результате получился непрерывно делящийся клеточный гибрид (гибридома), способный синтезировать антитела с заданной специфичностью. Гибридома унаследовала от
нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой - бессмер-тие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту.
С появлением моноклональных антител в биологии и медицине началась
эпоха современных исследований высочайшей точности. Специфичность антител делает их мощ-ными диагностическими инструментами, которые позволя-ют
определить наличие минимального количества искомых субстанций. В настоящее время моноклональные антитела используют для:
обнаружения загрязнителей окружающей среды;
проверки пищевых продуктов на наличие опасных микроорганизмов;
распознавания злокачественных клеток среди нормальных;
22
аналитических целей как иммунологический микроскоп с чрезвычайно высоким разрешением;
диагностики инфекционных заболеваний человека, животных и растений,
а также в биотехнологии в качестве лигандов для аффинной хроматографии.
Современная диагностика злокачественных новообразований крови немыслима без моноклональных антител. Их используют для определения иммунного статуса пациентов, диагностики и контроля эффективности лечения он-кологических заболеваний, диагностики бактериальных и вирусных инфекций (гепатиты А и С, простой герпес, клещевой энцефалит, цитомегаловирусная инфекция, ВИЧ), для определения биологически активных веществ - белков крови, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и др.
Существуют также моноклональные антитела для лечения аутоиммунных
заболеваний и реакций отторжения трансплантата. В этих случаях действие моноклональных антител направлено против клеток иммунной системы, участвующих в патологических процессах; другие иммунные механизмы при этом не
страдают.
Предпринимаются попытки связать моноклональные антитела с противоопухолевыми препаратами, такими, как доксорубицин или рицины. Это обеспечит адресную доставку токсичного препарата к опухолевым клеткам, позволит
прицельно (направленно) обнаруживать и уничтожать их, не повреждая здоровые ткани.
Таким образом, работы по получению новых моноклональных антител в
целях создания на их основе лекарственных и диагностических средств очень
перспективны. Они позволят вывести практическую медицину на качественно
новый уровень. Терапия с помощью моноклональных антител эффективна, очень
специфична, т.е. нацелена только на определенный патологический механизм,
являющийся причиной заболевания, и, следовательно, сравнительно безопасна.
Подведение итогов занятия: выставление оценок по теоретической части, проверка выполнения практической части, задание для подготовки к следующему занятию – 5 минут.
23
ТЕМА № 7
БИОСЕНСОРЫ. БИО-ЧИПЫ
Вид занятия: практическое.
Время: 90 минут.
Место проведения: учебная аудитория.
Цель занятия: изучить применение биосенсоров и биочипов.
Литература: 1, 2, 3.
Материальное обеспечение: учебно-методическое пособие.
Формы и методы контроля: устный опрос и проверка выполненных заданий.
Содержание и методика проведения занятия
Организационные вопросы (учет наличия студентов, формулирование
темы и цели занятия) - 5 минут.
Контрольные вопросы и сообщения – 60 минут:
1. Понятие биосенсоров. Их разновидности.
2. Биочипы. Принципы работы. Применение биочипов.
Биосенсоры - это аналитические устройства, в которых чувствительный
слой, содержащий биологический материал, реагирует на присутствие определяемого компонента и генерирует электрический сигнал, функционально связанный с наличием и концентрацией этого вещества. Биоматериалом могут служить
ферменты, ткани, бактерии, дрожжи, антигены/антитела, липосомы, органеллы,
рецепторы, ДНК, а также клетки, которые иммобилизованы на физических датчиках. Следовательно, биосенсорная технология сочетает в себе достижения
биологии и современной микроэлектроники.
Принципы конструирования биосенсоров. Конструктивно биосенсор представляет собой устройство, состоящее из двух преобразователей, или трансдьюсеров - биохимического и физического, находящихся в тесном контакте друг с
другом.
Биохимический преобразователь сигнала (или биотрансдьюсер, биоселектор) выполняет функцию биологического элемента распознавания, преобразуя
определяемый компонент (а точнее, информацию о химических связях) в физическое или химическое свойство или сигнал. В этом качестве выступают все
типы биологических структур: ферменты, антитела, рецепторы, нуклеиновые
кислоты и даже живые клетки.
Разновидности биосенсоров и их применение. Разработка биосенсоров относится к наукоемким технологиям и представляет собой одну из ветвей современной биотехнологии. Существует несколько типов биосенсоров, среди которых наибольшее развитие получили ферментные и клеточные биосенсоры.
Ферментные биосенсоры могут быть представлены ферментными электродами, ферментными микрокалориметрическими датчиками, биодатчиками на основе хеми- и биолюминесценции.
Ферментные (или безреагентные) электроды - устройства основаны на при-
менении электрохимического способа определения веществ, образующихся в
24
ходе ферментативного превращения. Представляют собой электрод с нанесенным поверхностным слоем (каким-либо природным полимером), содержащим
один или несколько иммобилизованных ферментов (иногда фермент может
находиться в растворенном состоянии в приэлектродном слое, окруженном мембраной).
Ферментные микрокалориметрические датчики устройства основаны на
использовании теплового эффекта ферментативной реакции.
Хеми- и биолюминесцентные датчики - регистрируют световое излучение
с различной длиной волны, испускаемое продуктами ферментативной реакции,
находящимися в возбужденном состоянии. Конструкция включает колонку с иммобилизованными на носителе ферментами (пероксидазой) и светоприемное
устройство.
Клеточные биосенсоры. Одно из достижений биотехно-логии связано с
развитием методов включения живых клеток в полимеры и твердые носители
различной природы и применением такого рода материалов для решения задач
медицины и управляемого биосинтеза.
Методы иммобилизации клеток - физические и химические - сходны с
методами иммобилизации отдельных ферментов. Стабильность иммобилизованных клеток определяется их метаболизмом, свойствами носителя и среды.
Биосенсоры можно использовать также для:
- измерения пищевой ценности, свежести и безопасности продуктов питания;
- экспресс-анализа крови непосредственно у кровати больного;
- обнаружения и измерения степени загрязнения окружающей среды;
- детекции и определения количества взрывных веществ, токсинов и воз-
можного биологического оружия;
- извлечения металлов из сточных вод;
- изготовления водородных солнечных элементов;
- очистки природных и сточных вод.
Биочип и принцип его работы. Существует несколько разновидностей био-
чипов - матричные (с иммобилизованной ДНК), микрофлюидные (капиллярные)
и биочипы с использованием микросфер с цветовой кодировкой.
У современных микрочипов размеры ячеек лежат в пределах 50-200 микрон; характерные объемы, относящиеся к отдельной ячейке, составляют примерно от 1 нл до 1 мкл; значения концентраций анализируемых макромолекул
находятся обычно в пределах до 10 мкМ. Общее число ячеек на чипе составляет
103- 105, а его линейные размеры со-ставляют приблизительно 1 см.
ДНК-микрочипы, применяют с целью практического использования информации, полученной в результате секвенирования геномов человека и других
живых организмов, а именно для:
идентификации мутаций в генах, связанных с различными заболеваниями;
наблюдений за активностью генов;
диагностики инфекционных заболеваний и определения наиболее эффективного метода терапии;
идентификации генов, важных для продуктивности сельскохозяйственных
культур;
25
скрининга микроорганизмов, как патогенных, так и полезных, например
используемых для восстановления за-раженных органическими отходами почв.
Чтобы использовать известные последовательности генов и геномных
карт, необходимо определить функции входящих в их состав генов. Без белковых
микрочипов эта работа очень трудоемка.
Применение биочипов. Биочипы применяют как для исследовательских
целей, так и в практической медицине. Они помогают в поиске и установлении
функций различных генов. За короткий промежуток времени становится возможным проанализировать генетические мутации и вы- явить предрасположенность
человека, например, к онкозаболеваниям (она выявляется у 60 % больных раком). В настоящее время в процессе сертификации находится биочип для диагностики лейкемии.
Разрабатываются также биочипы для диагностирования различных форм
туберкулеза.
Биочипы можно применять для контроля за некоторыми смертельно опасными бактериями (так, есть биочипы, позволяющие определять возбудителей сибирской язвы, оспы, чумы и бруцеллеза), а также для диагностики гриппа и определения его штаммов.
Подведение итогов занятия: выставление оценок по теоретической части, проверка выполнения практической части, задание для подготовки к следующему занятию – 5 минут.
26
ТЕМА № 8
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ
И ДНК-ТЕХНОЛОГИЙ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ
Вид занятия: практическое.
Время: 180 минут.
Место проведения: учебная аудитория.
Цель занятия: изучить основные задачи генной инженерии, ее связь с дру-
гими науками, узнать основные способы получения генов. Ознакомиться с технологией получения рекомбинантной молекулы ДНК.
Литература: 1,4,5.
Материальное обеспечение: таблицы, учебно-методическое пособие,
схемы получения рекомбинантной ДНК, список рестриктаз и участков узнавания, видео-фильм по генной инженерии, учебно-методическое пособие.
Формы и методы контроля: устный опрос и проверка выполненных заданий.
Содержание и методика проведения занятия
Организационные вопросы (учет наличия студентов, формулирование
темы и цели занятия) - 5 минут.
Контрольные вопросы и сообщения (75 минут):
1. Понятие о генной инженерии, история развития.
2. Основные направления и задачи генной инженерии на современном этапе.
3. Получение генов. Химический и ферментативный синтез. Выделение
генов с помощью ферментов рестрикции и трансдуцирующих фагов.
4. Рестриктазы и их значение.
5. Рекомбинантная ДНК. Векторы и их использование для переноса гене-
тического материала.
6. Метод электрофорезного анализа ДНК в агаровом геле и метод блот-
гибридизации ДНК по Саузерну. Секвенирование ДНК. Полимеразная цепная
реакция (ПЦР) и ее применение в практике.
7. Методы введения генов в бактериальные клетки. Экспрессия чужерод-
ных генов.
8. Способы получения генов.
9. Конструирование рекомбинантной ДНК (ферментативный синтез).
10. Самостоятельная подготовка студентов (сообщения по теме).
Генетическая инженерия – это конструирование in vitro функционально ак-
тивных генетических структур (рекомбинантных ДНК) и наследственно измененных организмов.
Генную инженерию используют для изучения структуры, функций и регуляции генов, также для изучения структуры хромосом. Датой возникновения генной инженерии считается 1972 год, когда в США ученый П. Берг с сотрудниками
создали первую рекомбинантную молекулу ДНК, состоящую из фрагмента ДНК
обезьяньего вируса SV-40 и бактериофага с галактозным опероном Е. сoli.
Области применения генной инженерии на современном этапе.
- получение генноинженерных вакцин;
27
- получение искусственных белков с заданными свойствами;
- получение гормонов, ферментов;
- диагностика и лечение заболеваний.
Способы получения генов:
1) выделение генов из ДНК;
2) химико-ферментативный синтез;
3) ферментативный синтез.
Рестриктазы и их значение
Рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы) – это ферменты, способ-
ные разрезать молекулу ДНК в строго определенных местах с образованием липких концов.
Рестриктазы были открыты в 1968 году.
Например, рестриктаза Е. соli под названием ЕсоRI узнает последовательность и разрезает ее на участках, помеченных стрелками. В результате, кольцевая
молекула ДНК станет линейной. По краям молекулы образуются липкие концы,
с одной стороны ААТТ, с другой – ТТАА. При наличии липких концов, молекула
ДНК может опять замкнуться в кольцо.
Рестриктазы могут узнавать различные последовательности нуклеотидов. Рестриктаза Е. соli под названием ЕсоRI узнает последовательность ЦЦГГ. Соединение разрывов цепей ДНК после обработки рестриктазами производится ферментом лигазой.
Векторы и их использование для переноса генетического материала
Вектор – это молекулы ДНК, которые способны переносить чужеродные
гены и обеспечивать их репликацию в клетке – хозяине.
Типы векторов:
1) векторы для клонирования;
2) экспрессионные векторы;
3) векторы для трансформации.
Общие свойства вектора:
1) иметь свойство репликона.
2) содержать сайты рестрикции, т.е. участки узнавания для рестриктаз.
При этом места разрезания и введения другой ДНК не должны влиять на репликацию вектора.
3) иметь один или несколько маркирующих генов, по которым его можно
обнаружить.
4) содержать специфические для данной клетки промоторы и термина-
торы транскрипции.
Методы введения генов в бактериальные клетки:
1) трансформация;
2) трансфекция;
3) трансдукция.
Метод электрофорезного анализа ДНК в агаровом геле
Принцип метода:
1) ДНК обрабатывают рестриктазами и помещают в лунки застывшего
агарового геля, который затем помещается в камеру для электрофореза.
28
2) под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают переме-
щаться в геле, скорость их перемещения зависит от длины фрагмента. Короткие
фрагменты движутся быстрее, при этом цепочки ДНК различной длины отделяются друг от друга, но не повреждаются.
3) после электрофореза гель окрашивают красителем этидиум бромидом,
который связывается с ДНК.
4) гель помещают под ультрафиолетовый свет и на нем хорошо видны
окрашенные в красный цвет светящиеся фракции ДНК.
В результате электрофорез позволяет разделить, а затем извлечь любые
фрагменты ДНК в чистом виде.
Секвенирование ДНК
Секвенирование — это определение последовательности нуклеотидов в
фрагменте ДНК. В результате секвенирования определяется также аминокислотная последовательность белка в соответствии с нуклеотидной последовательностью в соответствующем гене.
Используются 2 метода:
1) химическое секвенирование;
2) ферментативное секвенирование путем терминации цепи.
Полимеразная цепная реакция – современный метод молекулярной биоло-
гии. Этот метод разработан Кэри Мюллисом (Нобелевская премия в 1993 году).
Использование ПЦР позволяет амплифицировать (размножать) ДНК или ее
фрагменты in vitro, увеличивая число копий в миллионы раз за несколько часов.
Полимеразно-цепная реакция протекает в 3 стадии:
1. Денатурация. Смесь, в которой содержится ДНК, нагревают до t0 900 С.
В течение 15 секунд происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК и образуется 2 одноцепочечных ДНК из одной двухцепочечной.
2. Гибридизация праймеров. Температуру снижают до 500 С. При этом
происходит гибридизация цепей ДНК с праймерами в течение 30 секунд.
3. Полимеризация. Смесь с ДНК нагревают до температуры 700 С. При
этом Tag - полимераза удлиняет оба праймера с их 3`- концов. Праймеры дорастают до размеров матрицы. Процесс протекает 90 секунд и в результате количество ДНК удваивается. Фермент Tag -полимераза был выделен из термофильных
бактерий и отличается устойчивостью к высоким температурам. За 20 циклов
амплификации количество копий ДНК возрастает в 106 раз. ПЦР- реакция происходит в специальном приборе-амплификаторе.
Этот метод позволяет получать точные данные по структуре генов и фрагментов ДНК при наличии минимального количества материала, используется
для диагностики наследственных болезней человека, при дактилоскопии и идентификации индивидуумов, для направленного получения мутаций.
Рекомбинантные ДНК – это искусственно созданные молекулы ДНК,
включающие ген и вектор.
Ферментативный способ получения рекомбинантной ДНК
Система для ферментативного синтеза генов представляет собой раствор,
в котором содержатся все 4 нуклеотида, ионы магния, фермент обратная транскриптаза и матричная РНК, на которой будет синтезироваться ДНК.
29
Для конструирования рекомбинантной ДНК необходим ряд ферментов:
1) рестрикционные эндонуклеазы – находят и разрезают молекулы ДНК в
сайтах с определенными последовательностями, которые узнает только определенная рестриктаза;
2) обратная транскриптаза (ревертаза), которая осуществляет синтез ДНК
на матрице РНК;
3) ДНК – полимераза – катализирует синтез ДНК на матрице ДНК;
4) ДНК – лигаза – склеивает молекулы ДНК, образуя связи между дезокси-
рибофосфатами нуклеотидов;
5) терминальная трансфераза – досинтезирует к концам двойной спирали
ДНК пу- риновые или пиримидиновые нуклеотиды;
6) эндонуклеаза фага – отщепляет однонитчатые концы 3 - конца двойной
спирали ДНК;
7) нуклеаза – сокращает двойную спираль ДНК с обоих концов.
Полученный ген не содержит интронов, промоторов и других элементов,
регулирующих генную активность. Такие гены подключаются к промоторам
прокариот и экспрессируются в прокариотах.
Для введения рекомбинантной ДНК в клетку, клетка должна быть компетентной, компетентности можно добиться при использовании CaCl2 и теплового
удара. Для облегчения проникновения ДНК в клетку бактерий, их обрабатывают
лизоцимом, который гидролизирует мукопептиды, входящие в состав клеточной
стенки бактерий. Клетки эукариот обрабатывают ферментами, которые разрушают полисахариды оболочки. Также для облегчения проникновения ДНК в
клетку эукариот, используют диэтиламиноэтилдекстран и полиэтиленгликоль.
Клетки дрожжей обрабатывают солями лития или электроимпульсами.
Практическая часть –75 минут:
Задание 1. Заполнить таблицу:
Таблица 5 – Основные этапы развития генетической инженерии
Год
Автор
Содержание открытия
Задание 2. Изучить историю развития биотехнологии:
30
Таблица 6 – История развития биотехнологии
Дата
Событие
1917
Карл Эреки ввел термин «биотехнология».
1943
Произведен пенициллин в промышленном масштабе.
1944
Эвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что генетический материал представлен ДНК.
1953
Уотсон и Крик определили структуру молекулы ДНК.
1961
Учрежден журнал «Biotechnology and Bioengineering».
1961-1966
Расшифрован генетический код.
1970
Выделена первая рестриктирующая эндонуклеаза.
1972
Корана и др. синтезировали полноразмерный ген тРНК.
1973
Бойер и Коэн положили начало технологии рекомбинантных ДНК.
1975
Келер и Мильштейн описали получение моноклональных антител.
1976
Изданы первые руководства, регламентирующие работы с рекомбинантными ДНК.
1976
Разработаны методы определения нуклеотидной последовательности ДНК
1978
Фирма Genentech выпустила человеческий инсулин, полученный
с помощью E. coli.
1982
Разрешена к применению в Европе первая вакцина для животных, полученная по технологии рекомбинантных ДНК.
1983
Для трансформации растений применены гибридные плазмиды.
1988
Создан метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
1990
В США утвержден план испытаний генной терапии с использованием соматических клеток человека.
1994-1995
Опубликованы подробные генетические и физические карты
хромосом человека.
1996
Ежегодный объем продаж первого рекомбинантного белка
(эритропоэтина) превысил 1 млрд. дол.
1997
Клонировано первое млекопитающее из дифференцированной
соматической клетки.
Задание 3. Зарисовать схему получения рекомбинантной ДНК:
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]