Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Серологические реакции в диагностике инфекционных заболеваний. Учебное пособие для СПО
.pdf
31
назначения реакции, первая группа животных, куриных эмбрионов
или тканевых культур заражается смесью либо живого вирусного диагностикума с испытуемой сывороткой (при серодиагностике), либо
смесью чистой культуры вируса, выделенного от больного, с заведо-
мо известной иммунной видоспецифической противовирусной сыво-
роткой (при сероидентификации). Вторая группа заражается либо
живым вирусным диагностикумом (при серодиагностике), либо чи-
стой культурой определенного вируса, выделенного от больного (при
сероидентификации).
Положительный результат РН будет проявляться отсутствием
в первой группе и наличием во второй группе следующих эффектов:
1 — на животных — цитопатогенного эффекта (ЦПЭ), гемадсорбции куриных эритроцитов пораженной вирусов тканью;
2 — на курином бульоне — гемагглютинации куриных эритроцитов аллантоисной или амниотической жидкостью;
3 — на культуре тканей — цитопатогенного эффекта (ЦПЭ), гемадсорбции куриных эритроцитов пораженной вирусом тканью.
При отрицательном результате РН перечисленные выше эффекты
будут отмечаться и в первой, и во второй группах зараженных объектов.
РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ИЛИ ЗАДЕРЖКИ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
(РТГА ИЛИ РЗГА)
РТГА или РЗГА является своеобразной разновидностью РН
и широко применяется для сероидентификации вирусов и серодиагно-
стики вирусных инфекций. Все вирусы, кроме вируса полиомиелита,
несут в своем капсиде фермент — гемагглютинин, который вызывает
агглютинацию куриных эритроцитов (прямая гемагглютинация). То
есть РТГА(РЗГА) ставится при всех вирусных инфекциях за исклю-
чением полиомиелита.
32
Сущность РТГА (РЗГА) реакции заключается в том, что в при-
сутствии специфических АТ вирус нейтрализуется ими и теряет спо-
собность агглютинировать куриные эритроциты. Технически РТГА
выполняется таким образом: в специальных пластиковых лунках го-
товятся последовательные разведения кратные двум в объеме 0,25 мл
либо испытуемой сыворотки (при серодиагностике), либо диагностической видоспецифической противовирусной сыворотки (при серои-
дентификации). Затем в каждую лунку добавляют по 0,25 мл вирусного
диагностикума (при серодиагностике) или раствора идентифицируемо-
го вируса (при сероидентификации). Через 30 мин пребывания смесей
в термостате при 37 оC в каждую лунку добавляют по 0,5 мл 1–2 % взвеси куриных эритроцитов в физиологическом растворе.
К опыту ставится контроль, содержащий вирусный ингредиент +
+ физиологический раствор + куриные эритроциты.
Результат РТГА оценивается после двухчасового отстаивания
при комнатной температуре путем регистрации гемагглютинации ку-
риных эритроцитов в контрольной лунке (рыхлой хлопьевидный оса-
док, называемый «зонтиком», и отсутствие таковой в лунках, где осу-
ществилась нейтрализация вируса сывороточными АТ и произошло
торможение (задержка) гемагглютинации (компактный осадок эрит-
роцитов, называемый «пуговкой»).
РТГА с целью серодиагностики ставится с парными сыворотка-
ми и считается положительной, если произошло нарастание титра ан-
тител не менее, чем в 4 раза.
ОПСОНОФАГОЦИТАРНАЯ РЕАКЦИЯ (ОФР)
Фагоцитарную активность лейкоцитов крови оценивают по ин-
тенсивности захвата ими тест-бактерий. Многих микробов лейкоциты
способны фагоцитировать самостоятельно. Наиболее же вирулентные
33
микробы фагоцитируются только при участии АТ-опсонинов (нор-
мальные АТ) и бактериотропинов (Ig M или Ig G). Опсонины содер-
жатся в неиммунной и иммунной сыворотке, бактериотропины —
только в иммунной. Под влиянием опсонинов происходит изменение
поверхности микробных тел, в частности их электрического потенци-
ала, вследствие чего они легко подвергаются фагоцитозу. Опсонины
обуславливают специфическую сенсибилизацию, повышенную чув-
ствительность бактерий к фагоцитозу. Во всех случаях присутствие
иммунной сыворотки способствует усилению фагоцитоза настолько
закономерно, что по степени фагоцитоза судят о состоянии защитной
способности организма.
Для количественной оценки фагоцитарной активности лейкоци-
тов рассчитывают фагоцитарный показатель — среднее количество
захваченных бактерий одним лейкоцитом и процент фагоцитирую-
щих клеток. О наличии опсонинов в сыворотке крови судят по повы-
шению ее фагоцитарной активности, о чем свидетельствует опсони-
ческий индекс — отношение фагоцитарного показателя иммунной
сыворотки к фагоцитарному показателю нормальной сыворотки.
Диагностическое применение ОФР огpаничено вследствие ее трудоемкости. В основном ее применяют при серодиагностике бруцеллеза.
Для определения опсонического индекса необходимо:
1 — лейкоциты животного, полученные из дефибринированной
крови;
2 — густая взвесь тест-бактерий, в качестве которой используют
культуру возбудителя соответствующей инфекции;
3 — исследуемая сыворотка;
4 — нормальная сыворотка.
В небольших пробирках готовят все смеси, каждая из которых
содержит по три ингредиента: 1 — тест-бактерии + лейкоциты + испытуемая сыворотка; 2 — тест-бактерии + лейкоциты + нормальная
34
сыворотка (контроль). Смеси ингибируют в термостате при 37 °С в течение 30 мин, затем делают мазки, фиксируют смесью Никифорова
10 мин, окрашивают по Романовскому-Гимзе.
При микроскопии мазок передвигают в одном направлении, под-
считывая число фагоцитированных бактерий не менее, чем в 50 лейко-
цитах. Затем определяют среднее количество фагоцитированных бакте-
рий одним лейкоцитом — фагоцитарный показатель. После подсчета
фагоцитарного показателя для исследуемой сыворотки больного и для
нормальной (контрольной) сыворотки здорового определяют их отно-
шение, которое характеризует величину опсонического индекса.
Например, если в мазках с иммунной сывороткой обнаружится
300 микробных клеток на 100 лейкоцитов, то фагоцитарный показатель ее будет равен 300 : 100 = 3. При обнаружении в мазках с нормальной сывороткой 150 микробов на 100 лейкоцитов показатель ее
будет 150 : 100 = 1,5. Отсюда опсонический индекс для данного примера равен 3 : 1,5 = 2. Чем выше опсонический индекс, тем активнее
исследуемая сыворотка и, следовательно, выше иммунитет. Показа-
тель опсонического индекса при заболевании должен быть больше 1.
РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ИЛИ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
(РНГА ИЛИ РПГА)
Под непрямой или пассивной гемагглютинацией понимают ре-
акцию, в которой АТ агглютинируют АГ, адсорбированный на различных субстратах. В качестве иммуносорбентов могут применяться
специально обработанные убитые микробные клетки, частицы латек-
са, нитроцеллюлезы. Чаще всего для этих целей используют эритро-
циты животных или человека, предварительно обработанные тани-
ном. Такие эритроциты, нагруженные АГ, склеиваются под действи-
ем иммунной сыворотки, содержащей АТ к данному АГ (РНГА).
35
В некоторых случаях пользуются обратным вариантом, то есть ад-
сорбируют не АГ, а АТ на эритроцитах или иных частицах. РНГА от-
личается высокой чувствительностью и является экспресс-методом,
который используется для серодиагностики и сероидентификации
возбудителей инфекционных заболеваний. Она позволяет выявлять
сравнительно небольшие концентрации АТ в исследуемых сыворот-
ках и АГ в исследуемом материале.
Методика постановки РНГА
Для постановки РНГА с целью серодиагностки и необходимы
следующие ингредиенты: 1 — исследуемая сыворотка от больного,
в которой определяют наличие специфических АТ; 2 — эритроцитар-
ный диагностикумантигенный, представляющий собой эритроциты «0»
группы крови человека, обработанные танином и нагруженные АГ, ко-
торый соответствует искомым АТ; 3 — физиологический раствор.
В серии пластиковых лунок готовятся последовательные разве-
дения исследуемой сыворотки (обычно кратные двум) в физиологи-
ческом растворе объемом по 0,5 мл (табл. 5). Разведения готовят
с ориентиром на диагностический титр. Затем в каждое разведение
сыворотки добавляют по 0,5 мл эритроцитарного диагностикума ан-
тигенного.
Таблица 5
Постановка РНГА с целью серодиагностики
Ингредиенты, мл
Разведения
1:10
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
К
Сыворотка больного
(в разведении 1:5)
1,0
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5 (вы-
лить 0,5)
–
36
Окончание табл. 5
Ингредиенты, мл
Разведения
1:10
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
К
Физиологический раствор
Эритроцитарный диагностикум
–
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Комнатная температура 2 ч
Результаты
Выводы:
К опыту ставится контроль АГ: эритроцитарный антигенный ди-
агностикум + физиологический раствор.
Результат реакции учитывается после двухчасового отстаивания
при комнатной температуре по характеру осадка эритроцитов. Так,
в частности, в контроле, а также в лунках, где гемагглютинация отсут-
ствует, осадок эритроцитов бывает всегда компактный в виде «пугов-
ки», а при наличии гемагглютинации — рыхлым, кружевным, распределенным по всей площади дна лунки в виде «зонтика».
РНГА считается положительной, если гемагглютинация наблюдается в диагностическом титре.
Для постановки РНГА с целью сероидентификации необходимы
следующие ингредиенты: 1 — чистая культура, выделенная из исследуемого материала от больного; 2 — эритроцитарный диагностикум
глобулиновый, представляющий собой эритроциты «0» группы крови
человека, обработанные танином и нагруженные глобулинами, кото-
рые соответствуют искомому АГ; 3 — физиологический раствор.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА,
ОСНОВАННЫЕ НА СВЯЗЫВАНИИ КОМПЛЕМЕНТА
Одним из важнейших защитных свойств иммунной сыворотки
при инфекциях является ее способность растворить (лизировать)
37
микроорганизмы и другие клеточные элементы, поступившие в орга-
низм. В основе реакций лизиса, гемолиза, бактериолиза лежит взаи-
модействие трех компонентов: АГ (эритроциты, микробы или другие
клетки), специфических АТ иммунной сыворотки (гемолизинов, бак-
териолизинов), вызывающих сенсибилизацию АГ, и комплемента —
неспецифического фактора, который адсорбируется на специфиче-
ском комплексе АГ+АТ, вследствие чего наступает активация компо-
нентов комплемента, приводящая к лизису клеток.
Комплемент является основной частью любой свежей сыворотки,
как нормальной, так и иммунной. Наибольшее количество ее обнару-
живается в сыворотке морских свинок. Комплемент термолабилен,
полностью инактивируется при прогревании сыворотки в течение
30 мин при 56 °C, способен адсорбироваться на специфических ком-
плексах АГ+АТ. В одних случаях, когда АГ имеет корпускулярную
природу, это проявляется реакцией бактериолиза, гемолиза. В других
случаях, когда АГ представлен вирусом или имеет растворимую при-
роду, — не сопровождается никакими видимыми изменениями. По-
следняя реакция называется реакцией связывания комплемента (РСК).
Реакция бактериолиза состоит в том, что при соединении им-
мунной сыворотки с соответствующими живыми бактериями в при-
сутствии комплемента происходит лизис микробов. Как иммунобио-
логический процесс бактериолиз наиболее ярко выражен при холере
и тифо-паратифозных инфекциях. В практике реакцией бактерио-
лиза пользуются для:
1) определения вида неизвестного микроба при помощи специ-
фической бактериологической сыворотки;
2) определения в исследуемой сыворотке бактериолизинов
к заранее известному микробу.
Реакция бактериолиза воспроизводится в пробирках (in vitro)
и в организме (in vivo).
38
Диагностическое значение в практике приобрел метод опреде-
ления холерного вибриона реакцией бактериолиза путем введения
в брюшную полость морской свинки смеси, состоящей из иммунной
противохолерной сыворотки и выделенной культуры. Этот метод из-
вестен под названием феномена Исаева-Пфейффера.
В опыт берут не менее двух морских свинок: подопытную и кон-
трольную. Первой свинке вводят в брюшную полость смесь из 1 мл
взвеси исследуемой культуры в физиологическом растворе и 0,2 мл
иммунной противохолерной сыворотки определенного разведения,
второй — смесь из 1 мл той же культуры и 0,2 мл нормальной сыворот-
ки. Через 10 мин из брюшной полости свинки берут стерильным шпри-
цем экссудат, из которого делают мазки на предметном стекле и гото-
вят препарат «висячая капля». Высушенный мазок фиксируют смесью
Никифорова и красят водным фуксином 6 мин. Через 20 мин и через 1 ч
готовят таким же образом материал для повторных исследований.
В мазках и «висячих каплях» из экссудата подопытной морской
свинки наблюдаются разные стадии бактериолиза в зависимости от
срока взятия экссудата. В ранней стадии вибрионы не изменены: они
очень подвижные и имеют типичную морфологию. Далее движения
их замедляются, сами они набухают, в мазках отмечаются бледно
окрашенные шары или зерна. В экссудате, взятом позже, изменения
еще более выражены и, наконец, в последнем мазке и капле вибрионы
не обнаруживаются. После опыта первая морская свинка остается
в нормальном состоянии и выживает.
Экссудат, взятый у контрольной морской свинки, во всех препа-
ратах содержит значительное количество подвижных, типичных виб-
рионов. В наиболее поздних мазках можно отметить увеличение количе-
ства микробов, что свидетельствует об их беспрепятственном размноже-
нии в организме свинки. В последующие дни контрольная морская
39
свинка проявляет признаки заболевания и погибает, так как большое ко-
личество введенной культуры явилось для нее смертельным.
Реакция бактериолиза in vitro. В стерильной пробирке делают
смеси из взвеси культуры вибриона Мечникова, инактивированной
иммунной сыворотки и комплемента. В контрольную пробирку вме-
сто иммунной сыворотки добавляют такой же объем нормальной сы-
воротки. Пробирки помещают на 2 ч в термостат при температуре
37 °С, после чего делают посев 0,1 мл на чашки с агаром и ставят по-
севы на сутки в термостат. На следующий день в посеве из контроль-
ной пробирки обнаруживается обильный рост культуры. В посеве же из
пробирки, содержавшей иммунную сыворотку, количество выросших
колоний значительно меньше; возможно и полное отсутствие роста.
РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)
Эта реакция основана на законе общем для всех реакций имму-
нитета: в случае взаимодействия иммунной сыворотки со специфиче-
ским антигеном при наличии комплемента образующийся комплекс
АГ+АТ обязательно адсорбирует (связывает) комплемент, который
вызывает лизис АГ. В случаях же отсутствия специфического сродства
между АГ и АТ сыворотки образования комплекса АГ+АТ не проис-
ходит и комплемент остается свободным. Процесс адсорбции компле-
мента и лизис АГ при положительной реакции антитела с антигеном
остается невидимым. Для того, чтобы установить, произошла ли ад-
сорбция комплемента или он остался свободным (несвязанным), в ре-
акцию вводят вторую систему (гемолитическую или индикаторную).
Индикаторная система состоит из АГ, в качестве которого используют-
ся эритроциты барана, и гемолитической сыворотки, содержащей АТ,
специфичные к эритроцитам барана. То есть в индикаторной системе
всегда присутствует специфический комплекс АГ+АТ. При отсутствии
40
специфического комплекса АГ+АТ в первой части реакции комплемент
адсорбируется специфическим комплексом АГ+АТ индикаторной си-
стемы, вызывая гемолиз эритроцитов барана — реакция отрицательная.
АГ
+ комплемент +
гемолитическая сыворотка (АТ)
= гемолиз
АТ эритроциты барана (АГ)
Отсутствие (задержка) гемолиза эритроцитов барана в индика-
торной системе свидетельствует о наличии специфического комплек-
са АГ+АТ в первой части, связавшего комплемент, — реакция положительная.
АГ
+ комплемент +
гемолитическая сыворотка (АТ)
= задержка
АТ эритроциты барана (АГ) гемолиза
РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью
и применяется для сероидентификации бактерий, вирусов и других АГ
и серодиагностики многих инфекционных заболеваний (туберкулез,
бруцеллез, вирусные инфекции, риккетсиозы). Наибольшее значение
эта реакция приобрела в диагностике сифилиса (реакция Вассермана).
Для постановки РСК необходимо точное определение количественных
соотношений всех ингредиентов: исследуемой сыворотки, АГ, компле-
мента, гемолитической сыворотки и эритроцитов барана. Поэтому по-
становке опыта предшествует большая подготовительная работа.
Приготовление и титрование ингредиентов для РСК
Антиген изготавливается производственными институтами из
взвеси убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экс-
трактов тканевых липидов. Ввиду того, что АГ может обладать анти-
комплементарным действием, он подвергается титрованию. Титруется
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]