Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Серологические реакции в диагностике инфекционных заболеваний. Учебное пособие для СПО
.pdf
21
3 — полная прозрачность участвующих в реакции ингредиентов —
сыворотки и АГ;
4 — наличие электролита (0,85 % раствора хлорида натрия).
РП можно ставить как с веществами белковой природы — полноценными АГ, так и с гаптенами — неполноценными АГ (полисахариды, липиды).
Растворы полноценных АГ готовят непосредственно из исследу-
емого материала или путем экстрагирования физиологическим рас-
твором из него с последующей фильтрацией. Растворы микробных
гаптенов готовят кипячением либо исследуемого материала, либо его
кислотных гидролизатов с последующим фильтрованием.
Существует несколько способов постановки РП.
1 — реакция кольцепреципитации ставится в пробирках. Внешне
при положительном результате реакция выражается в следующем:
при осторожном наслаивании прозрачного раствора АГ к иммунной
преципитирующей сыворотке на границе раздела обеих жидкостей по-
является мутное кольцо преципитата, выпадающее в осадок (рис. 2, а).
2 — реакция термокольцепрепипитации также ставится в про-
бирках. В отличие от предыдущей в данной реакции используется
АГ-преципитиноген, обладающий высокой резистентностью к температуре до 100
о
С. На этом свойстве бактерийных АГ основана реак-
ция термокольцепреципитации по Асколи, которая применяется при
диагностике сибирской язвы. АГ извлекают из исследуемого матери-
ала (кусочки органов, кожи, шерсти) кипячением с последующим
фильтрованием до прозрачного состояния.
3 — РП в геле используется с целью дифференциации АТ против
разных АГ, а также для определения титра преципитирующей сыворот-
ки. Лунки, сделанные в агаре, заполняют раствором АГ и раствором
преципитирующей сыворотки. Спустя 24 часа, АГ и АГ диффундируя
в агар и вступая на месте их встречи в специфическое взаимодействие,
образуют мутные полосы (усики) преципитации (рис. 2, б).
22
4 — метод иммуноэлектрофореза основан на разделении анти-
генного комплекса в электрическом геле в присутствии соответству-
ющих преципитирующих сывороток. При этом каждый АГ с гомоло-
гичным АТ дают зону преципитации в геле в виде дуги.
Рис. 2. Реакция преципитации:
а — в пробирке; б — в геле
РП характеризуется высокой чувствительностью и специфично-
стью. Она позволяет обнаружить минимальные следы АГ (преципи-
тиногена) в разведении до 1:1 000 000 и 1:10 000 000, благодаря чему
преципитация практически стала важной реакцией в химии, биоло-
гии, медицине и т. д.
Чрезвычайно важное значение РП имеет в судебно-медицинской
практике для распознавания видовой принадлежности крови, спермы
не только в свежем и жидком состоянии, но и также в высушенном,
например, в пятнах очень давнего происхождения на одежде.
В санитарной практике РП является методом для определения
фальсификации мясных, мучных, и других продуктов, выявления
23
примеси молока одного вида животного к молоку другого вида, до-
бавления искусственного меда к натуральному и т. д.
В биологии с помощью РП устанавливают генетические связи
близких между собой видов животных, растений, микроорганизмов.
Наибольшее распространение РП получило в диагностике сибир-
ской язвы (реакция Асколи) для обнаружения АГ (сероиндикация) сиби-
реязвенных бацилл в исследуемом материале: экстракты из органов
больных животных, кожи, шерсти, волос, выпускаемая продукция —
полушубки, меховые воротники, кисточки для бритья и другие изделия.
Методика постановки РП (кольцепреципитации)
В пробирку наливают 0,5 мл преципитирующей сыворотки, затем при помощи пипетки (лучше всего пастеровской), держа пробирку в наклонном положении, осторожно наслаивают на сыворотку
0,5 мл раствора АГ (спускают жидкость по стенке пробирки так, чтобы она не смешалась с сывороткой, а образовала над ней верхний
слой). Добавив АГ, пробирку ставят в штатив. При положительном
результате реакции сразу же или в течение 1–2 минут на границе раздела обеих жидкостей образуется мутное кольцо преципитата от выпавшего в осадок АГ. Степень реакции оценивается по величине
кольца и времени его появления.
К опыту ставятся контроль: нормальная сыворотка + раствор
определяемого АГ.
РЕАКЦИЯ ФЛОКУЛЯЦИИ (РФ)
РФ — это разновидность РП, антигеном в которой является токсин. В результате взаимодействия токсина с соответствующей
антитоксической сывороткой наблюдается выпадение осадка — хло-
24
пьев флокулята. Наиболее интенсивная и ранняя флокуляция происходит в пробирке, где АГ и АТ встречаются в эквивалентных соотношениях — инициальная флокуляция.
Существует два способа постановки РФ:
1 — в геле;
2 — в пробирках.
1 — РФ в геле чаще всего используется для обнаружения экзо-
токсина у возбудителей дифтерии (сероидентификация). На поверх-
ность пластинчатого агара в чашке Петри накладывается в центре по-
лоска фильтрованной бумаги, пропитанная антитоксической противо-
дифтерийной сывороткой. Выделенные от больных или бактерионосителей культуры бактерий засевают в виде бляшек по бокам от по-
лоски бумаги параллельно краю на некотором расстоянии от него. Ес-
ли исследуемая культура токсична, то выделяемый ею токсин, диф-
фундируя в агар, встречается с антитоксином (антитоксической сыво-
роткой), также распространяющимся от полоски бумаги в толщу агара.
На месте соединения токсина и антитоксина появляются белые линии
преципитата, получившие название «усики преципитата».
2 — РФ в пробирках в основном используется для титрования
антитоксических лечебных сывороток и анатоксинов (токсинов).
Сила антитоксической сыворотки, выражаемая в антитоксиче-
ских единицах (АЕ), определяются в РФ с соответствующим анаток-
сином известного титра. За 1 АЕ принимается такое количество анти-
токсической сыворотки, которое в РФ нейтрализует определенное
число ДЛМ соответствующего токсина. Количество АЕ в 1 мл анти-
токсической сыворотки называют ее титром.
Рассмотрим титрование антитоксических сывороток на приме-
ре титрования противодифтерийной сыворотки. Технически это вы-
полняется следующим образом: противодифтерийную сыворотку
неизвестного титра в увеличивающихся количествах разливают в ряд
25
пробирок, в которые затем добавляют по 2 мл дифтерийного токсина
известного титра (табл. 3). Пробирки выдерживают в водяной бане
при 45 °С в течение 30 мин до выпадения хлопьев в одной из них, то
есть результаты реакции оценивают по инициальной флокуляции.
Таблица 3
Титрование противодифтерийной сыворотки
Допустим, в данном примере инициальная флокуляция произошла в пробирке № 4.
Это говорит о том, что в этой пробирке оптимальное соотношение
АГ и АТ, то есть 100 ДЛМ дифтерийного токсина нейтрализовали 1 АЕ
противодифтерийной сыворотки. Для разных токсинов и антитоксиче-
ских сывороток такое соотношение различно. Отсюда можно опреде-
лить сколько АЕ противодифтерийной сыворотки находится в пробир-
ке № 4.
Если в 1 мл токсина 10 000 ДЛМ (табл. 1), то в 2 мл будет
20 000 ДЛМ. Эти 20 000 ДЛМ токсина полностью нейтрализовались
противодифтерийной сывороткой, находящейся в пробирке № 4. Для
определения количества АЕ сыворотки, присутствующей в данной
Ингредиенты, мл
Номер пробирки
1 2 3 4 5 6 7
8
Противодифтерийная
сыворотка
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Дифтерийный токсин
силой 10 000 ДЛМ/мл
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
Инкубация при 45 °С в течение 30 мин
Результаты по инициальной
флокуляции
+
26
пробирке, необходимо составить уравнение, которое получается из
следующих рассуждений: если 100 ДЛМ токсина нейтрализуется
1 АЕ сыворотки, то 20 000 ДЛМ токсина нейтрализуется Х АЕ сыворотки, отсюда Х = (20 000 х 1) : 100 = 200 АЕ сыворотки находится в
пробирке № 4. Но эти 200 АЕ приходятся на 0,4 мл сыворотки. Следовательно, в 1 мл сыворотки будет (200 : 0,4) = 500 АЕ.
Таким образом, титр противодифтерийной сыворотки равен
500 АЕ. Сила антитоксина, выражаемая в иммуногенных единицах
(ИE), также определяется в PФ с соответствующей антитоксической
сывороткой известного титра. За 1 ИЕ анатоксина принимается то его
количество, которое в РФ нейтрализуется 1 АЕ соответствующей сыворотки.
Рассмотрим титрование анатоксинов на примере титрования
дифтерийного анатоксина. Технически это выполняется следующим
образом: противодифтерийную сыворотку известного титра в увели-
чивающихся количествах разливают в ряд пробирок, в которые затем
добавляют по 2 мл дифтерийного токсина неизвестного титра. Пробирки выдерживают в водяной бане при 45 °С в течение 30 мин до
выпадения хлопьев в одной из них, то есть результаты реакции оце-
ниваются по инициальной флокуляции (табл. 4).
Допустим, в данном примере инициальная флокуляция произошла
в пробирке № 4. В первую очередь необходимо узнать, сколько АЕ противодифтерийной сыворотки находится в этой пробирке? Если в 1 мл
3 000 АЕ сыворотки (табл. 2), то в 0,4 мл будет (3 000 х 0,4) 1 200 АE сыворотки. Следовательно, в пробирке № 4 содержится, соответственно,
и 1 200 ИЕ дифтерийного токсина. Но эти 1 200 ИЕ приходятся на 2 мл
токсина. Отсюда, в 1 мл токсина будет содержаться (1 200 : 2) = 600 ИЕ.
27
Таблица 4
Титрование дифтерийного токсина
РЕАКЦИЯ КУМБСА
Реакцию Кумбса используют для выделения неполных АТ, которые образуются при различных патологических состояниях: резус-
конфликте, аутоиммунных заболеваниях (системная красная волчанка,
полиартрит и другие коллагенозы). Неполные АТ (непреципитирующие, блокирующие агглютиноиды) способы соединяться с соответ-
ствующим АГ, но без образования in Vitro феноменов преципитации,
агглютинации и др. В отличие от обычных АТ они более устойчивы
к нагреванию, значительно легче проходят через плаценту.
Наибольший интерес представляют АТ (агглютинины) к резус-
антигенам эритроцитов детей, страдавших гемолитической болезнью,
которая обусловлена наличием в эритроцитах резус-фактора, унаследованного от отца. Проникая в кровь резус-отрицательной матери,
резус-фактор вызывает образование резус-агглютининов, которые
в дальнейшем через плаценту поступают в кровь плода и вызывают
у него агглютинацию эритроцитов.
Резус-фактор может вызывать образование агглютининов двух типов: полных: (бивалентных) агглютининов (АТ), которые определяется
Ингредиенты, мл
Номер пробирки
1 2 3 4 5 6 7
8
Противодифтерийная сыворотка
(титр 3 000 АЕ)
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Дифтерийный токсин
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
Инкубация при 45 °С в течение 30 мин
Результаты по инициальной
флокуляции
+
28
в РА, и неполных (моновалентных, блокирующих) агглютининов (АТ),
которые не выявляются этим методом, так как, соединяясь с АГ, бло-
кируют его, но не-могут вызвать агрегации частиц в крупные конгломераты. Для обнаружения неполных АТ у резус-отрицательных мате-
рей применяют реакцию Кумбса (антиглобулиновый тест). Для поста-
новки реакции необходима антиглобулиновая сыворотка (АГС),
которую получают путем иммунизации кролика человеческим глобу-
лином. В АГС содержатся бивалентные АТ к любому человеческому
глобулину, в том числе и к неполным АТ. Для выявления фиксации
неполных АТ (аглютининов) эритроцитами добавляют антиглобули-
новую сыворотку, обладающую способностью в солевом растворе
(in vitro) вызывать выраженную агглютинацию сенсибилизированных
неполными АТ эритроцитов. Молекула глобулина соединяет две мо-
лекулы неполных АТ, фиксированных на двух различных эритроци-
тах, благодаря чему и происходит РА.
Реакция Кумбса ставится в два этапа:
1 — к двукратным разведениям сыворотки беременной женщины с резус-отрицательной кровью добавляют эритроциты, содержащие резус-агент. Выдерживают при 37 °C в течение 1–1,5 ч;
2 — к тщательно отмытым после первого этапа эритроцитам
с фиксированным на них неполными АТ (если таковые есть в сыво-
ротке обследуемой беременной женщины) добавляют АГС, которая,
взаимодействуя с этими неполными АТ, способствует агглютинации
эритроцитов. Реакция оценивается по наличию гемагглютинации (по-
ложительная реакция) после 30 мин инкубирования при 37 °C.
К опыту ставится несколько контролей:
1 — антиглобулиновая сыворотка + заведомо сенсибилизированные эритроциты;
2 — нормальная сыворотка + эритроциты + антиглобулиновая
сыворотка;
3 — исследуемая сыворотка + эритроциты, не содержащие резус-антиген, + антиглобулиновая сыворотка.
29
РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ (РН)
PH основана на способности антитоксической сыворотки нейтра-
лизовать действие соответствующего токсина. Используют ее для серо-
диагностики токсигенных инфекций (столбняка, газовой гангрены,
дифтерии, ботулизма), а также для сероиндикации и сероидентифика-
ции бактериальных токсинов. Воспроизводится PH на мелких лабораторных животных — белых мышах. В опыт берутся две группы мышей.
PH в направлении серодиагностики предусматривает обнаруже-
ние специфических антитоксинов (АТ) в сыворотке больного. С этой
целью первой группе мышей парентерально вводится сыворотка
больного (исследуемая) и заведомо известный токсин, например,
столбнячный. Второй группе животных (контрольной) вводится нор-
мальная (не иммунная) сыворотка и также столбнячный токсин. Учи-
тывается реакция по гибели и выживаемости животных.
РН считается положительной, если первая группа животных
выживает, а вторая — погибает. Подобный результат говорит о нали-
чии специфических, в данном случае противостолбнячных, АТ в сы-
воротке больного. При отрицательном результате PH гибель живот-
ных наступает в обеих группах.
PH в направлении сероиндикации предусматривает обнаружение
неизвестного токсина в исследуемом материале от больного. С этой
целью первой группе животных вводят смесь исследуемого материала
с антитоксической иммунной сывороткой, например, с противодифте-
рийной. Второй группе — смесь исследуемого материала с не иммун-
ной сывороткой. Если первая группа животных выживает, а вторая по-
гибает, следовательно, в исследуемом материале от больного присут-
ствует токсин возбудителя дифтерии — реакция положительная.
PH в направлении сероидентификации. В качестве исследуемо-
го материала в данном случае берут фильтрат с чистой культуры воз-
30
будителя в бульоне, выделенного от больного, который в смеси с им-
мунной видоспецифической антитоксической сывороткой вводится
первой группе животных. Второй группе вводится тот же фильтрат
чистой культуры возбудителя, но в смеси с неиммунной сывороткой.
О положительной PH в данной случае свидетельствует выживаемость
животных первой группы и гибель второй.
PH бактериальных токсинов нашла применение и при определе-
нии восприимчивости людей к таким токсигенным инфекциям, как
дифтерия (реакция Шика) и скарлатина (реакция Дика). Техниче-
ски это выполняется следующим образом. Человеку на внутренней
поверхности нижней трети предплечья внутрикожно вводится 0,1 мл
токсина Шика или Дика. Учет результатов реакции осуществляется
через 24 ч. Если человек восприимчив к данным инфекциям, то есть
в его организме нет специфических АТ к возбудителю дифтерии или
скарлатины, то нейтрализации введенного токсина антителами не про-
изойдет. На месте инъекции будет регистрироваться воспаление — реакция отрицательная. Если организм невосприимчив и в тканевых
жидкостях его содержатся специфические АТ, то произойдет нейтрали-
зация введенного токсина этими АТ. На месте инъекции видимая на
глаз реакция будет отсутствовать — реакция положительная. РН широко применяется также для сероидентификации вирусов и серодиагно-
стики вирусных инфекций. Сущность этой реакции заключается
в нейтрализации вируса (АГ) специфическими АТ. В зависимости от
методов культивирования вирусов существуют следующие способы
постановки РН при вирусных инфекциях:
1 — на животных;
2 — на куриных эмбрионах;
3 — на культурах тканей.
РН при вирусных инфекциях технически выполняется анало-
гично PH бактериальных токсинов. В этом случае, исходя из целевого
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]