Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Отклик бактериальных культур на низкоинтенсивное электромагнитное поле крайне высоких частот. Монография
.pdf
31
Рис. 1.13. Зависимость изменения концентрации биомассы
и вязкости культуральной жидкости от частоты обработки ЭМП
(время обработки 5 мин)
Таким образом, исследованные частоты по характеру своего действия располагаются следующим образом. Действие ЭМП КВЧ с частотой 60,4 ГГц приводит к проявлению стимулирующего эффекта как
в отношении концентрации биомассы, так и в отношении синтеза ЭПС.
Частота 61,22 ГГц является ингибирующей, в то время как частота
61,4 ГГц практически не оказывает влияния на развитие Xanthomonas cam-
pestris. Обращает на себя внимание тот факт, что при действии стимулирующей и ингибирующей частот параллельно происходит изменение как
концентрации биомассы, так и вязкости культуральной жидкости, хотя для
последнего показателя эти изменения менее выражены.
По-видимому, миллиметровое электромагнитное поле приводит
к изменениям в направлении и величине бактериальных метаболических потоков, перенаправляя их в сторону более эффективного синтеза
биомассы Xanthomonas campestris, в отличие от биосинтеза бактериями
вторичных метаболитов.
Однако следует отметить, что стимулирование синтеза вторичных продуктов также происходит, но в меньшей степени. В этом случае
можно ожидать изменения состава и структуры экзометаболитов,
в частности ксантана, поскольку известно, что структура и состав ксантана подвержены сильным вариациям и существенно зависят от состава
питательной среды и условий культивирования микробного продуцента [39, 42].
Согласно литературным данным, ксантан построен из повторяющихся пятичленных блоков (рис. 1.14), содержащих D-глюкозу,
D-маннозу, D-глюкуроновую кислоту в соотношении 2:2:1.
0
1
2
3
4
5
6
контроль 60,4 ГГц 61,22 ГГЦ 61,4 ГГц
концентрация биомассы,г/л
0
5
10
15
20
25
30
Кинематическая вязкость
,кв.мм/сек
концентрация
биомассы
кинематическая
вязкость
32
Полисахарид имеет поли–α–(1→4)–D–глюкопиранозную структуру,
напоминающую целлюлозу, но содержит боковые цепи с остатками
других моносахаридов.
Молекулы α–D–глюкозы, соединяясь 1,4–гликозидной связью,
образуют основную цепь, в которой каждый второй остаток содержит
короткое боковое звено из трех моносахаридных единиц. В боковом
фрагменте остаток глюкуроновой кислоты располагается между двумя
остатками маннозы. Концевой остаток маннозы может содержать пируватную группу, а звено, примыкающее к основной цепи, – ацетатную
группу при шестом углеродном атоме. Как правило, каждое второе боковое ответвление содержит пируватную группу. При сходном качественном составе ЭПС у патоваровбактерии Xanthomonas campestris со-
ответствующие полимеры отличаются молярным соотношением входящих в них компонентов. Содержание пировиноградной кислоты, входящей в состав ЭПС в кетальной форме, колеблется в широких пределах – от 0 до 9 % [43].
Рис. 1.14. Первичная структура экзополисахаридаксантана
Образцы полученного ксантана были также исследованы методом ЯМР-релаксометрии. В таблице представлены результаты соответствующего структурно-динамического анализа образцов ксантана.
Из табл. 1.8 следует, что представленные образцы ксантанов заметно
различаются по молекулярной подвижности (временам релаксации Т2i)
и доле соответствующих этой подвижности структурно-динамических
фрагментов в образце (характеризуемой относительными населенностями Р2i).
33
Таблица 1.8
Параметры ЯМР-релаксации образцов ксантана
Частота, ГГц
Т21, мс
Т22, мкс
Т23*, мкс
Р21, %
Р22, %
Р23, %
60.4
19
37
16
2,5
23,5
74
61.22
55
44
18
1,5
24,5
74
61.4
38
40
19
1,0
28,0
71
контроль
43
39
19,5
0,5
29,5
70
* – в связи с неэкспоненциальной формой начального участка ССИ время Т23 определялось по
изменению амплитуды сигнала в е раз.
Само наличие нескольких (в данном случае трех) структурно-динамических (ЯМР) фаз (i = 1,2,3) может быть обусловлено наличием
низкомолекулярных примесей в образце и (или) широкого молекулярно-массового распределения полимера, а также особенностями
строения и упаковки макромолекул. В работе [32] показано, что в данном случае появление наиболее подвижной фазы, судя по значениям ее
параметров (Т21 и Р21), обусловлено наличием в образцах низкомолекулярных соединений (например, воды, низковязких метаболитов и т. п.)
и(или) относительно большого свободного объема вокруг концевых
макромолекулярных фрагментов, что позволяет им двигаться более
свободно и независимо от соседей. При этом доля подобных фрагментов пропорциональна наблюдаемой в эксперименте протонной населенности Р21.
Различия высокомолекулярных компонентов по характеру их
структурно-динамического поведения описывают ЯМР-фазы с более
короткими временами поперечной релаксации (Т22 и Т23). При этом промежуточные времена релаксации (Т22) и соответствующие им населенности (Р22) характеризуют более подвижные и(или) менее плотно упакованные фрагменты высокомолекулярной фазы, а наиболее короткие
времена релаксации (Т23) и соответствующие им населенности (Р23)
описывают поведение наименее подвижных (более высокомолекулярных и(или) плотно упакованных (в том числе более упорядоченных не
только по структуре, но и по подвижности)) высокомолекулярных
фрагментов.
Можно предположить (табл. 1.8), что стимулирующее воздействие способствует росту доли более регулярных и компактно упакованных (более высокомолекулярных) ксантановых структур, в то время
как обработка на ингибирующей частоте приводит к росту ширины их
молекулярно-массового распределения. Это может быть связано с изменением условий протекания элементарных актов реакций удлинения
и разветвления ксантановых цепей, что должно отражаться на
абсолютной величине и соотношении между кинетическими константами соответствующих процессов и, как следствие, составе и структуре
получаемых продуктов. Ранее подобные изменения структуры биополимеров были обнаружены нами при культивировании микробного
продуцента на разных питательных средах [42].
Таким образом, обнаружено, что ЭМП миллиметрового диапазона оказывает влияние как на рост биомассы бактерий Xanthomonas
campestris, так и на синтез ими гидроколлоидаксантана. При этом ЭМП
КВЧ воздействует на механизм и(или) условия продуцирования и первичных, и вторичных метаболитов бактериями Xanthomonas campestris.
35
Г л а в а 2 . Р Е Г У Л И Р О В А Н И Е Ф И З И О Л О Г И Ч Е С К О Й
АКТИВНОСТИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
2 . 1 . В л и я н и е н и з к о и н т е н с и в н о й э л е к т р о м а г н и т н о й
о б р а б о т к и н а р о с т б и о м а с с ы м о л о ч н о к и с л ы х
б а к т е р и й в з а в и с и м о с т и о т ф и з и о л о г и ч е с к о г о
с о с т о я н и я м и к р о о р г а н и з м о в
Распространение молочнокислых бактерий в природе определяется их сложными потребностями в питательных веществах и способом
получения энергии (только брожение). Эти бактерии почти никогда не
обнаруживаются в почве или водоемах.
В естественных условиях они встречаются:
а) в молоке, в местах его переработки и молочных продуктах
(Lactobacillus lactis, L. bulgaricus, L. helveticus, L. casei, L. fermentum,
L. brevis; Streptococcus lactis, S. diacetilactis);
б) на растениях и на разлагающихся растительных остатках
(Lactobacillus plantarum, L. delbriickii, L. fermentum, L. brevis;
Streptococcus lactis; Leuconostoc mesenteroides);
в) в кишечнике и на слизистых оболочках человека и животных
(Lactobacillus acidophilus; Bifidobacterium; Streptococcus faecalis,
S. salivarius, S. bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae).
Streptococcus faecalis – обычный обитатель кишечника человека;
S. bovis распространен в пищеварительном тракте жвачных. Многие стреп-
тококки являются безобидными обитателями слизистых рта, дыхательных
и мочевых путей, половых органов; однако среди стрептококков есть и паразиты крови – весьма вирулентные возбудители болезней.
Благодаря образованию больших количеств молочной кислоты, к
которой сами они в значительной степени толерантны, молочнокислые
бактерии при подходящих условиях могут довольно быстро размножаться, вытесняя другие микроорганизмы. По этой причине их легко
культивировать на элективных средах и легко выделять. «Естественные
накопительные культуры» этих бактерий содержатся в кислом молоке и
молочных продуктах, кислом тесте, кислой капусте, силосе и т. п. [1–4].
36
Предварительно проведенные эксперименты показали, что ЭМП
КВЧ оказывает влияние на концентрацию биомассы молочнокислых
бактерий и выделение ими молочной кислоты. Молочная кислота представляет собой продукт метаболизма молочнокислых бактерий, и ее вы-
деление может рассматриваться как критерий активности молочнокислого брожения.
Известно, что одним из первых ферментов молочнокислого брожения является гексокиназа, осуществляющая свою деятельность
в начале фруктозодифосфатного пути расщепления глюкозы (гликолиза), который характерен для гомоферментативного молочнокислого
брожения. Такое брожение реализуют, например, молочнокислые бактерии Lactobacillus lactis. Кроме того, гексокиназа является первым
ферментом и пентозофосфатного молочнокислого брожения, характерного для гетероферментативных молочнокислых бактерий. Их типичным представителем является Lactobacillus casei.
Таким образом, можно предположить, что активность процессов
брожения и прирост концентрации биомассы являются взаимосвязанными величинами. В этой связи представляло интерес исследовать взаимосвязь между этими параметрами в условиях обработки ЭМП КВЧ
микробной культуры, находящейся в различных физиологических состояниях.
Реализация этого проекта потребовала изучения воздействия
ЭМП КВЧ на рост биомассы молочнокислых бактерий Lactobacillus
lactis и Lactobacillus casei в зависимости от физиологического состояния культуры, а также влияния электромагнитной обработки
микроорганизмов на активность ферментов ихосновных
метаболитических путей.
Обработка биообъектов производилась на стимулирующей частоте 61,22 ГГц. Время экспозиции составляло 5 мин.
Таблица 2.1
Влияние ЭМО на Lactobacillus casei
Образец
Абсолютно су-
хой вес, г/л
ΔК
Оптич.
плотность,
ед. +0,05
ΔК
Титруемая кис-
лотность,
°Т+0,05
ΔК
Культура Lactobacillus casei, находящаяся в состоянии анабиоза
Контр.
12,7+0,05
168
6,5
169
0,40
143
Опыт
21,2 +0,05
11,0
0,57
Активированная культура Lactobacillus casei
Контр.
15,0 +0,05
202
13,0
184
0,70
114
Опыт
30,4 +0,05
24,0
0,80
37
Для определения физиологических параметров исследуемой
культуры проводили обработку микроорганизмов, растущих в виде газона на поверхности плотной питательной среды. Для выявления действия ЭМП КВЧ на лактобациллы, находящиеся в различном физиологическом состоянии, обработке подвергались жидкие культуры микроорганизмов.
Первоначально изучалось влияние ЭМП КВЧ на рост синхронизированных культур молочнокислых бактерий Lactobacillus lactis
В–5646 и Lactobacillus casei С–1 ВКПМ В–3960, находящихся в различном физиологическом состоянии. Результаты эксперимента представлены в табл. 2.1 и 2.2 (ΔК – значение параметра относительно
контроля К = 100 %).
Как видно из табл. 2.1, происходит увеличение концентрации
биомассы и оптической плотности (в 1,7 раза), а также кислотности
(в 1,4 раза), при обработке ЭМП неактивированной культуры
Lactobacillus casei С–1 ВКПМ В–3960. После обработки также наблюдается прирост биомассы активированной культуры Lactobacillus casei
С–1 ВКПМ В–3960 в 2 раза и титруемой кислотности в 1,14 раза. Дан-
ные табл. 2.1 также представлены в виде рис. 2.1–2.3.
Рис. 2.1. Изменение концентрации биомассы Lactobacillus casei
(абсолютно сухой вес)
г/л
Неактивированная
культура
Акитвированная
культура
38
Рис. 2.2. Изменение концентрации биомассы Lactobacillus casei
(турбидиметрический метод)
Рис. 2.3. Титруемая кислотность Lactobacillus casei
Из сравнения абсолютно сухого веса неактивированной и активированной культур Lactobacillus casei С–1 ВКПМ В–3960 следует, что ак-
тивированная культура растет в 2 раза интенсивнее, что вполне естественно: в культуре, находящейся в состоянии анабиоза, активность ферментных систем закономерно более низкая, чем в активированной,
вследствие чего активированная культура развивается быстрее.
Из табл. 2.1 видно, что ЭМП КВЧ оказывает влияние не только
на прирост биомассы, но и на титруемую кислотность.
Титруемая кислотность – внешнее проявление молочнокислого
брожения (характерного для данных культур способа получения энергии). Поскольку молочнокислые бактерии являются облигатными анаэробами, то эта характеристика определяет эффективность образования
в них энергии.
ед. опт. плотности
Неактививрованная
культура
Активированная
культура
о
Т
Неактивированная
культура
Активированная
культура
39
В то же время из табл. 2.1 следует, что после ЭМО концентрация
биомассы нарастает значительно быстрее, чем эффективность брожения. Это можно объяснить перераспределением метаболических потоков клетки, в результате чего эффективность использования полученной энергии возрастает, что и приводит к повышению концентрации биомассы. Здесь же следует отметить, что данный эффект в большей степени
проявляется при обработке активированной культуры.
Из табл. 2.2 видно, что такая же тенденция характерна и для
Lactobacilus lactis, т. е. в большей степени происходит прирост био-
массы, чем нарастает титруемая кислотность (ΔК – значение параметра
относительно контроля К = 100 %).
При этом действие волн ММ диапазона на активированную культуру проявляется более значительно. Этот результат вполне ожидаем,
так как у активированной культуры более высокая активность ферментных систем, которые, соответственно, более восприимчивы к действию
ЭМП КВЧ.
Таблица 2.2
Влияние ЭМО на Lactobacillus lactis
Образец
Абсолютно
сухой вес,
г/л
ΔК
Оптич.
плотность,
ед.+0,05
ΔК
Титруемая
кислотность,
°Т+0,05
% ΔК
Культура Lactobacillus lacti , находящаясяв состоянии анабиоза
Контр.
10,7+0,05
128
15,0
113
0,56
107
Опыт
13,7+0,05
17,0
0,60
Активированная культура Lactobacillus lactis В–5646
Контр.
15,2+0,05
141
14,0
121
0,56
106
Опыт
21,4+0,05
17,0
0,58
В обработанной активированной культуре снижается количество
выделяемой молочной кислоты, следовательно, снижается и активность
бродильных процессов, но поскольку при этом значительно возрастает
концентрация биомассы, то и эффективность процессов брожения
резко возрастает. В неактивированной культуре также наблюдается возрастание эффективности использования процессов брожения, однако в
значительно меньшей степени.
Данные, представленные в табл. 2.2, также изображены в виде
рис. 2.4–2.6.
40
Рис. 2.4. Изменение концентрации биомассы Lactobacillus lactis
(абсолютно сухой вес)
Рис. 2.5. Изменение концентрации биомассы Lactobacillus lactis
(турбидиметрический метод)
Поиск причин несоответствия масштабов увеличения концентрации биомассы и выделения молочной кислоты (что наиболее ярко проявляется при действии ЭМП КВЧ на активированную культуру) потребовал проведения измерений физиологических параметров роста микробных культур. Полученные данные представлены в табл. 2.3.
Рис. 2.6. Титруемая кислотность Lactobacillus lactis
г/л
Неактивированная
культура
Активированная
культура
ед. опт. плотности
Неактивированная
культура
Активированная
культура
о
Т
Неактивированная
культура
Активированная
культура
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]