Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Отклик бактериальных культур на низкоинтенсивное электромагнитное поле крайне высоких частот. Монография
.pdf
11
Таблица 1.1
Зависимость уровня накопления биомассы Bacillus subtilis D26
от длительности воздействия ЭМП КВЧ (средние значения
по трем измерениям) на стимулирующей частоте 60,8 ГГц после
24 ч культивирования
Следующим этапом работы стало изучение влияния ЭМО на бациллярную культуру, находящуюся в разных физиологических состояниях при ее выращивании на питательных средах в различных агрегатных состояниях (плотной (твердой) и жидкой) (рис. 1.4).
Рис. 1.4. Влияние ЭМО на стимулирующей частоте 60,8 ГГц
на прирост биомассы Bacillus subtilis в различных физиофазовых
условиях культивирования: 60,8* – прирост бациллярной культуры,
находящейся на плотной питательной среде в вегетативном
состоянии; 60,8** – прирост бациллярной культуры, находящейся на
плотной питательной среде в состоянии спорообразования; 60,8***–
прирост бациллярной культуры, находящейся в жидкой питательной
среде в споровом состоянии; сплошная линия – через 24 ч,
прерывистая – через 48 ч культивирования; к – к – линия контроля
Время обработки, мин
1 3 5 7 9
11
Контр.
Уровень биомассы
112
102
150
146
110
75
100
12
На рис. 1.4 показано изменение прироста биомассы (Х) бациллярной культуры через 24 и 48 ч культивирования, когда МКО находятся в
различных средах и физиологических состояниях, т. е. в неодинаковых
физиологофазовых условиях культивирования. При этом микроскопирование образца 60,8* показало наличие в нем порядка 90 % клеток в
вегетативном состоянии, в то время как через 48 ч культивирования та
же популяция находилась, в основном, в споровом состоянии. И хотя в
обоих случаях на плотных средах получено превышение контрольного
уровня прироста биомассы (на 40 и 20 % соответственно), но обработка
споровых клеток дала более скромные результаты. В то же время прирост Х выше контроля у МКО, предварительно выращенных на жидкой
среде, не превышает 14 % (образец 60,8***), что дополняет литературные данные [4, 6, 7] о еще менее благоприятном влиянии ЭМО, но не
только гигагерцового, но и мегагерцового диапазона, на клетки, предварительно выращенные в жидкой среде (при этом клетки находились
преимущественно в состоянии спорообразования). При дальнейшем
выращивании культуры в течение 48 ч наблюдается снижение прироста
биомассы, по-видимому, обусловленное затянувшимся переходом обработанных споровых клеток в стационарную фазу роста. Следовательно, прирост биомассы, выращенной на плотной питательной среде,
всегда выше, чем на жидкой. В частности, при обработке споровых
культур с плотной питательной среды прирост биомассы оказался практически не зависящим от времени культивирования и составил более
114 % (118–120 % (образец 60,8**)).
Таким образом, наиболее оптимальным режимом электромагнитной обработки бациллярных культур частотами миллиметрового диапазона является воздействие на МКО, выращенные на плотных питательных средах, и после 24 ч культивирования находящихся в вегетативном состоянии.
1 . 1 . 2 . В л и я н и е Э М П К В Ч н а ч у в с т в и т е л ь н о с т ь
B a c i l l u s s u b t i l i s D 2 6 к а н т и б и о т и к а м
Антибиотики как ингибиторы бактериальных культур биохимической природы являются незаменимыми препаратами медицинского
назначения. Поэтому их реакция на любые внешние воздействия, в
13
особенности в процессе выполнения целевых функций (при контакте с
бациллами), представляет особый интерес, который в некоторой степени
могут удовлетворить проведенные нами исследования.
Использованные в работе антибиотики являются представителями антибиотиков (АБ) широкого и узкого спектра действия.
Бензилпенициллин (БПЦ) – (пенициллин G (PNC G) – бензиловый
эфир 6-аминопенициллановой кислоты (рис. 1.5).
Рис. 1.5. Молекула бензилпенициллина
Антибиотик группы биосинтетических пенициллинов. Оказывает бактерицидное действие за счет ингибирования синтеза клеточной
стенки микроорганизмов.
Амоксициллин (АЦ) – антибактериальное бактерицидное кислото-
устойчивое средство широкого спектра действия из группы полусинтетических пенициллинов (рис. 1.6). Ингибирует транспептидазу, нарушает синтез пептидогликана (компонент клеточной стенки бактерий) в
период деления и роста, вызывает лизисбактерий [8–10].
Рис. 1.6. Молекула амоксициллина (Amoxicillin)
Полимиксины (ПМ) – группа бактерицидных антибиотиков, об-
ладающих узким спектром активности против грамотрицательной
флоры. Основное клиническое значение имеет активность
14
полимиксинов в отношении P. aeruginosa. По химической природе
это полиеновые соединения, включающие остатки полипептидов.
В обычных дозах препараты этой группы действуют бактериостатически, в высоких концентрациях оказывают бактерицидное действие,
которое связано с нарушением целостности цитоплазматической
мембраны микробной клетки. Молекула полимиксина абсорбируется
на фосфолипидах мембраны, увеличивая ее проницаемость и вызывая
лизис микробной клетки.
Левомицитин (ЛеМЦ) является антибиотиком широкого спектра
действия; эффективен в отношении многих грамположительных и грамотрицательных бактерий (рис. 1.7).
Рис. 1.7. Молекула левомицитина
Механизм антимикробного действия левомицитина связан с
нарушением синтеза белков микроорганизмов.
Линкомицин (ЛиМЦ) – антибиотик, продуцируемый Streptomyces
lincolniensis, оказывает бактериостатическое действие. Подавляет белко-
вый синтез бактерий вследствие обратимого связывания с 50S субъединицей рибосом, нарушает образование пептидных связей. Активен в отношении грамположительных кокков (Staphylococcusspp.,
Streptococcusspp., в том числе Streptococcus pneumoniae); Haemophilus
influenzae; Bacillus anthracis [8–10].
Фунгицидные антибиотики по химическому строению являются
представителями полиеновой (нистатин) и азольной (клотримазол, флуконазол) групп (рис. 1.8).
Молекула нистатина содержит макроциклическое лактонное
кольцо, названное нистатинолом, соединенное по С19 гликозидной связью с дезоксиаминосахаром (микозамином).
15
а б
Рис. 1.8. Представители антибиотиков различных групп:
а – нистатин; б – клотримазол, флуконазол
Предполагается, что биологическая активность нистатина обусловлена наличием лактонной структуры и конъюгированных ненасыщенных двойных связей. Механизм противогрибковой активности заключается в физико-химическом взаимодействии этих препаратов
со стеролами цитоплазматической мембраны грибов. В результате такого взаимодействия в мембране образуются поры, через которые происходит потеря цитоплазматического содержимого, приводящая к гибели гриба. Поскольку мишенью полиенов являются структурные элементы клетки грибов, а не ферменты, то формирование устойчивости
может быть результатом сложных генетических процессов, приводящих к изменению биосинтеза компонентов мембраны.
Механизм действия азолов (клотримазол, флуконазол) заключается в ингибировании биосинтеза эргостерола – вещества, участвующего в поддержании структурной целостности мембраны клетки гриба.
Основной мишенью действия азолов являются ферменты (14α-деметилазы), осуществляющие деметилирование предшественников эргостерола [8–10].
Обработку культуры Bacillus subtilis Д26 ЭМП КВЧ проводили
на частотах 60,8 и 61,6 ГГц, которые ранее были установлены как стимулирующая и ингибирующая частоты для этих микроорганизмов.
Время экспозиции во всех случаях составляло 5 мин. Эффект от ЭМО
оценивали через 24 ч по зонам задержки роста.
Влияние ЭМП КВЧ на чувствительность МКО и активность антибиотиков изучалось в трех вариантах опытов:
1) при обработке культуры до внесения АБ;
2) при обработке только антибиотиков;
3) при одновременной обработке культуры с внесенными АБ.
16
В табл. 1.2 и 1.3 и на их визуализациях (рис. 1.9 и 1.10) представ-
лены данные, характеризующие влияние ЭМП КВЧ на чувствительность бацилл к антибиотикам.
Таблица 1.2
Влияние ЭМО на частоте 60,8 ГГц на чувствительность
Bacillussubtilis D26 к антибактериальным АБ (зоны задержки
роста (d, мм) (*– Бациллы и антибиотики без обработки ( – )
и с обработкой (+))
Вид
АБ
Кон-
цент-ра-
ция,
мкг/мл
Варианты исследований
Контроль
1 2 3
Объект ЭМО
Б*
АБ*
Б
АБ Б АБ Б АБ – – + – – + + +
БПЦ
500
27,5
24
23,3
25,6
АЦ
500
24,3
23,4
22
22,6
ПМ
300
7,5
8,5
8,5
8,5
ЛеМЦ
30
22,8
23,6
23,5
24,3
ЛиМЦ
15
12,6
13,4
12,3
13,9
Было обнаружено, что обработанная культура проявляла различную чувствительность по отношению к использованным антибиотикам.
Максимальное антибактериальное действие оказывает бензилпенициллин (при концентрации 500 мкг/мл) и амоксициллин (при той же концентрации 500 мкг/мл).
Также оказалось, что электромагнитная обработка не снимает
тормозящего действия антибиотиков. При этом чувствительность Ba-
cillus subtilis D26 зависит не только от действия конкретного антибиотика, но и от используемой частоты. Так, при воздействии на бациллы
ЭМП КВЧ на частоте 60,8 ГГц наблюдается снижение резистентности
бациллярной культуры к левомицитину, линкомицину и полимиксину
(вариант исследований 1 в табл. 1.2); чувствительность обработанных
этой частотой бацилл (Б) к пенициллину и амоксициллину уменьшилась. При воздействии на антибиотики также наблюдается снижение
17
резистентности к левомицитину и полимиксину (вариант 2 в табл. 1.2);
устойчивость микробной культуры к обработанным бензилпенициллину и амоксициллину увеличилась.
Рис. 1.9. Влияние ЭМО на частоте 60,8 ГГц на чувствительность
бациллярной культуры к антибактериальным антибиотикам
При обработке бацилл совместно с антибиотиками наблюдается
снижение резистентности обработанных МКО к обработанным ЛеМЦ
и ЛиМЦ (вариант 3 в табл. 1.2); при этом чувствительность обработанных бацилл к обработанным БПЦ и АЦ уменьшилась.
Ранее при обработке на частоте 61,6 ГГц наблюдалось
ингибирование роста микроорганизмов. Как видно из полученных
данных (табл. 1.3), при обработке популяции микроорганизмов на этой
частоте сократилась (по сравнению с контролем) зона задержки роста
при действии левомицитина, линкомицина и пенициллина. Также
наблюдается уменьшение резистентности обработанных бацилл к
амоксициллину. При обработке антибиотиков на той же частоте не
наблюдалось отличий от предыдущего варианта. При обработке бациллярной культуры совместно с антибиотиками наблюдается увеличение
резистентности обработанных МКО к обработанным ЛеМЦ, ЛиМЦ и
БПЦ (вариант 3 в табл. 1.3); чувствительность обработанных бацилл к
обработанному АЦ уменьшилась.
18
Таблица 1.3
Влияние ЭМО на частоте 61,6 ГГц на чувствительность
Bacillus subtilis D26 к антибактериальным АБ (зоны задержки
роста (d, мм))
Вид
АБ
Концентрация,
мкг/мл
Варианты исследований
Контроль
1 2 3
Объект ЭМО
Б *
АБ*
Б
АБ Б АБ Б АБ
– – + – – + + + БПЦ
500
27,5
26,7
25,3
20,6
АЦ
500
24,3
23,3
22
23,5
ПМ
300
7,5
8,7
9,3
9
ЛеМЦ
30
22,8
21,6
22,8
21,8
ЛиМЦ
15
12,6
11
12
11,9
* – бациллы и антибиотики без обработки ( – ) и с обработкой (+).
В целом наличие самого эффекта от воздействия ЭМП КВЧ проявляется при любой активной (стимулирующей или ингибирующей) частоте обработки, но сказывается на его количественных характеристиках. При этом направленность эффекта от воздействия ЭМП КВЧ зависит от природы антибиотика, в том числе:
1. Действие ЭМП КВЧ проявляется на обеих исследованных ча-
стотах, но больший эффект наблюдается при воздействии на ингиби-
рующей для бацилл частоте 61,6 ГГц.
2. ЭМП КВЧ оказывает более существенное влияние на действие
фунгицидных антибиотиков, причем направление эффекта от воздей-
ствия ЭМП КВЧ зависит от природы антибиотика.
3. ЭМП КВЧ действует как на клетки бацилл, так и на антибиотики.
При этом при совместной обработке бацилл с антибиотиками наблюда-
ется синергический эффект от воздействия ЭМП на эти объекты.
Рис. 1.10. Влияние ЭМП КВЧ (61,6 ГГц) на чувствительность
бациллярной культуры к антибактериальным антибиотикам
19
1 . 2 . В л и я н и е э л е к т р о м а г н и т н о й о б р а б о т к и
н а э ф ф е к т и в н о с т ь п р е п а р а т а « Ф и т о с п о р и н »
По данным FAO, среднегодовые потери урожая сельскохозяйственных культур от вредителей, болезней и сорняков в мировом масштабе составляют около 30 %. Использование современных методов агрохимии позволяет значительно снизить эти потери.
Однако резкие изменения в фитопатологической ситуации, которые связаны с нарушением биоценотического равновесия популяций
микроорганизмов, ведут к накоплению в почве резистентных к пестицидам возбудителей заболевания. Побочным эффектом такого воздействия является снижение плодородия почв. Для оздоровления агроценозов необходимо использовать комплексный биологический подход к
регулированию патогенов [11]. Использование биологического метода
защиты растений, наряду с агротехническими мероприятиями, позволяет решать проблему биологической и токсикологической безопасности сельскохозяйственного производства.
В этой связи в последнее время в земледелии активно используется препарат «Фитоспорин». Основой препарата являются грамположительные, подвижные аэробные спорообразующие бактерии
Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128, которые обладают полезными фи-
зиолого-биохимическими свойствами, высокой антагонистической
активностью к возбудителям гнилей семян и их проростков. Они выделяют антибиотические вещества полипептидной и аминогликозидной природы, ряд ферментов, в частности хитиназы, влияющие на
жизнеспособность патогенной микрофлоры. Применение «Фитоспорина» предотвращает проникновение в растения возбудителей болезней и подавляет их развитие во внутренних тканях вплоть до созревания урожая [12].
Изменение экологического равновесия почвенных агробиоценозов привело к резкому возрастанию агрессивности фитопатогенной
микрофлоры. В связи с этим большое значение приобретает вопрос повышения активности и эффективности действия используемых биопрепаратов. В настоящее время одним из перспективных методов влияния
на биологические системы различного уровня организации является
электромагнитное поле крайне высокой частоты.
20
В литературе накоплен достаточно обширный материал, характеризующий возможность использования этого метода физического
воздействия на микроорганизмы с целью повышения их физиологической активности. Показана возможность стимуляции роста биомассы
бактерий и выделения ими физиологически активных веществ [13–16].
Поэтому целью работы стало исследование возможности повышения активности биологического средства защиты растений «Фитоспорин» путем его обработки электромагнитным полем миллиметрового диапазона длин волн.
Объектами исследований стали бактерии Bacillus subtilis
ВНИИСХМ 128, которые являются основой препарата биологиче-
ской защиты растений «Фитоспорин». В лабораторных условиях
бактерии хранили на скошенной агаризованной питательной среде
Громыко при температуре 3–5 °С. Для проведения экспериментов
культуру микроорганизмов выращивали в условиях периодического
культивирования в течение 48 ч при температуре 32 °С. Питательную среду готовили на основе пшеничных отрубей с добавлением
мела (для стабилизации рН).
Количество редуцирующих веществ (РВ) анализировали с помощью стандартных методик – методом Бертрана и фенол-сернокислотным методом. Концентрацию белка в культуральной жидкости определяли биуретовым методом, а также методом Лоури. Для анализа использовался супернатант [17].
В работе изучались образцы, подвергнутые обнаруженному нами
ранее оптимальному стимулирующему (53,77 ГГц) и ингибирующему
(53,67 ГГц) воздействию ЭМП на бактерии Bacillus subtilis.
Одной из важнейших физиологических характеристик роста
микроорганизмов является выход биомассы от потребленного субстрата. В качестве субстрата для роста бактерии Bacillus subtilis используют сахара, содержащиеся в питательной среде. Изменения состава культуральной жидкости в процессе культивирования представлены в табл. 1.4.
И как видно из представленных результатов, в процессе культивирования количество редуцирующих веществ в питательной среде
снизилось для всех исследуемых образцов, что связано с потреблением
сахаров в процессе роста культуры.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]