Приложение 9. Некоторые сведения по лабораторной практике
|
|
Таблица 8 |
Физические константы важнейших органических растворителей |
||
|
|
|
Растворитель |
Температура плавления, |
Температура кипения при |
|
градусы |
760 мм ртутного столба, |
|
|
градусы |
Вода |
0,0 |
100,0 |
Формамид |
2,5 |
210,0 |
Этиленгликоль |
13,0 |
198,0 |
Метанол |
97,8 |
65,0 |
N-метилформамид |
3,8 |
180–185 |
Диэтиленгликоль |
10,5 |
245,0 |
Триэтиленгликоль |
5,0 |
287,4 |
Метилцеллозольв |
85,1 |
124,5 |
N-метиланцетамид |
29,7 |
202,4 |
Этанол |
117,3 |
78,3 |
Уксусная кислота |
16,6 |
118,5 |
Бензиловый спирт |
15,3 |
205,3 |
Пропанол |
127,0 |
97,4 |
Бутанол |
89,8 |
117,5 |
2-пропанол |
89,5 |
82,4 |
Изоамиловый спирт |
117,2 |
132,0 |
Ацетонитрил |
43,8 |
81,6 |
Диметилсульфоксил |
18,5 |
189,0 |
Анилин |
6,0 |
184,4 |
Трет-бутиловый спирт |
25,8 |
82,5 |
Диметилформамид |
61,0 |
153,0 |
Диметилацетамид |
20,0 |
165,5 |
Ацетон |
95,3 |
56,2 |
Нитробензол |
5,7 |
210,8 |
Циклогексанон |
16,4 |
155,6 |
Пиридин |
41,7 |
115,5 |
Хлороформ |
63,5 |
61,2 |
Этилацетат |
83,6 |
77,1 |
Диэтиловый эфир |
116,0 |
34,6 |
Бензол |
5,5 |
80,1 |
Толуол |
95,0 |
110,6 |
Циклогексан |
6,5 |
80,8 |
Гексан |
95,0 |
68,8 |
54
Индикаторы
В табл. 9 приведены наиболее распространенные в практике индикаторы, применяющиеся при титровании методом нейтрализации и для колориметрического определения pH. Интервалы в pH перехода окраски индикаторов приводятся для комнатной температуры.
|
|
|
|
Таблица 9 |
|
|
Кислотно-основные индикаторы |
|
|
|
|
|
|
|
№ |
Название |
Цвет формы |
Интервал перехода |
|
п/п |
индикатора |
кислотной |
щелочной |
окраски в pH |
|
|
|
|
|
1 |
Тимоловый синий |
Красный |
Желтый |
1,2–2,8 |
|
|
|
|
|
2 |
Метиловый желтый |
Красный |
Желтый |
3,0–4,0 |
|
|
|
|
|
3 |
Бромфеноловый |
Желтый |
Сине-фиолетовый |
3,0–4,6 |
|
синий |
|
|
|
4 |
Метиловый |
Красный |
Желтый |
3,1–4,4 |
|
оранжевый |
|
|
|
5 |
Бромкрезоловый |
Желтый |
Синий |
3,8–5,4 |
|
зеленый |
|
|
|
6 |
Метиловый |
Красный |
Желтый |
4,4–6,2 |
|
красный |
|
|
|
7 |
Хлорфеноловый |
Желтый |
Красный |
5,0–6,6 |
|
красный |
|
|
|
8 |
Бромкрезоловый |
Желтый |
Пурпурный |
5,2–6,8 |
|
пурпуровый |
|
|
|
9 |
Бромтимоловый |
Желтый |
Синий |
6,0–7,6 |
|
синий |
|
|
|
10 |
Феноловый |
Желтый |
Красный |
6,8–8,0 |
|
красный |
|
|
|
11 |
Нейтральный |
Красный |
Янтарно-желтый |
6,8–8,0 |
|
красный |
|
|
|
12 |
Крезоловый |
Янтарно-желтый |
Пурпурно-красный |
7,2–8,8 |
|
красный |
|
|
|
13 |
a-нафтолфталеин |
Желто-розовый |
Сине-зеленый |
7,3–8,7 |
|
|
|
|
|
14 |
Тимоловый синий |
Желтый |
Синий |
8,0–9,6 |
|
|
|
|
|
15 |
Фенолфталеин |
Бесцветный |
Малиново-красный |
8.2–10,0 |
|
|
|
|
|
16 |
Тимолфталеин |
Бесцветный |
Синий |
9,4–10,6 |
|
|
|
|
|
17 |
Ализариновый |
Бледно-лимонно- |
Коричнево-желтый |
10,0–12,0 |
|
желтый |
желтый |
|
|
55
Выбор светофильтров в колориметрии и спектрофотометрии
Для правильного выбора светофильтров нужно знать спектрофотометрическую кривую исследуемого вещества.
Таблица 10
Таблица ориентировочного выбора светофильтров в колориметрии и спектрофотометрии
Окраска |
Длина волны |
Цвет необходимого |
Длина волны |
исследуемого |
поглощенного света, |
светофильтра |
пропускаемого света, |
вещества |
ммк |
|
ммк |
Зеленовато-желтая |
400 |
Фиолетовый |
400–430 |
Желтая |
425 |
Синий, фиолетовый |
420–450 |
Оранжевая |
450 |
Синий |
430–460 |
Красная |
490 |
Зеленый |
460–500 |
Пурпурная |
510 |
Зеленый |
490–530 |
Фиолетовая |
530 |
Зелено-желтый |
520–550 |
Красно-синяя |
550 |
Желтый |
520–550 |
Синяя |
590 |
Оранжевый |
590 |
Сине-зеленая |
640 |
Красный |
600–650 |
Используют светофильтры, пропускающие в области, где поглощение исследуемого вещества наибольшее, и подбирают такой светофильтр, при котором разница в окраске выступает особенно ярко.
Приготовление охлаждающих смесей
При проведении реакций часто требуется локальное охлаждение реакционной среды.
|
|
|
Таблица 11 |
Вещества, используемые для приготовления охлаждающих смесей |
|||
|
|
|
|
Вещество |
Начальная |
г/100 г H2O |
Температура |
|
температура, °C |
|
охлаждающей смеси, |
|
|
|
°C |
Na2CO3 |
1 (лед) |
20 |
2,0 |
NH4NO3 |
20 |
106 |
4,0 |
NaNO3 |
13,2 |
75 |
5,3 |
Na2S2O3 5H2O |
10,7 |
110 |
8,0 |
KCl |
0 (лед) |
30 |
10,9 |
NH4Cl |
1 (лед) |
25 |
15,4 |
NH4NO3 |
1 (лед) |
45 |
16,8 |
NaCl |
1 (лед) |
33 |
21,3 |
NaBr |
|
66 |
28 |
MgCl2 |
|
85 |
34 |
CaCI2 6H2O |
|
143 |
55 |
Сост. по: Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М. : Мир, 1976. С. 465.
56
Для получения низких температур пользуются процессом растворения. Многие соли при растворении поглощают большое количество тепла, т. е. обладают отрицательной теплотой растворения. Если использовать вместо воды для растворения ледяную крошку или снег, получают более низкую температуру за счет теплоты плавления.
Оглавление
Часть 1. Основные правила работы в биохимической лаборатории . |
3 |
Тема 1. Правила работы с реактивами и оборудованием . . . . . . . . . . |
3 |
Подготовка эксперимента . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . |
3 |
Подготовка к проведению эксперимента . . . . . . . . . . . . . . . . . . |
7 |
Часть 2. Фотометрические методы анализа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . |
10 |
Тема 2. Методы количественного определения белка . . . . . . . . . . . . |
10 |
Работа № 1. Определение концентрации белка спектрофотомет- |
|
рическим методом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . |
11 |
Работа № 2. Определение концентрации белка методом Лоури . . |
12 |
Работа № 3. Определение концентрации белка методом |
|
Бредфорда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . |
14 |
Работа № 4. Определение концентрации белка с бицинхонино- |
|
вой кислотой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . |
16 |
Часть 3. Выделение и очистка белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Тема 3. Экстракция белков. Грубое фракционирование . . . . . . . . . . . 18
Работа № 5. |
Выделение фитогемагглютинина (ФГА) из семян |
|
фасоли . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . |
. . . . . . . . . 19 |
|
Тема 4. Хроматографические методы . . . . . . . . . . . . . . |
. . . . . . . . . 20 |
|
Тема 4.1. Гель-фильтрация . . . . . . . . . . . . . . . . . . |
. . . . . . . . . 21 |
|
Работа № 6. Разделение белков методом гель-фильтрации на се- |
||
фадексе G-75 (G-100) . . . . . . . . . . . . . . . . . |
. . . . . . . . . 21 |
|
Работа № 7. |
Препаративное обессоливание белкового раствора |
|
на сефадексе G-50 (среднем) . . . . . . . . . . . . |
. . . . . . . . . 24 |
|
Работа № 8. |
Очистка липополисахарид-белковых |
комплексов |
бактерий методом гель-фильтрации от низкомолекулярных |
||
примесей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . |
. . . . . . . . . 25 |
|
Тема 4.2. Аффинная хроматография . . . . . . . . . . . . |
. . . . . . . . . 26 |
|
Работа № 9. Выделение лектина из семян гороха аффинной хроматографией на сефадексе G-150 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
58
Тема 4.3. Ионообменная хроматография . . . |
. . . . . |
. . . . . . . . . . 29 |
||
Работа № 10. |
Разделение белков |
сыворотки |
крови |
на колонке |
с ДЭАЭ-целлюлозой . . . . . |
. . . . . . . |
. . . . . . |
. . . . . . . . . 29 |
|
Работа № 11. |
Фракционирование |
белков |
семян |
фасоли на |
ДЭАЭ-целлюлозе . . . . . . . |
. . . . . . . |
. . . . . . |
. . . . . . . . . 31 |
|
Работа № 12. |
Разделение белков сыворотки крови на КМ-цел- |
|||
люлозе |
. . . . . . . . . . . . . . |
. . . . . . . |
. . . . . . |
. . . . . . . . . 32 |
Часть 4. Методы аналитической биохимии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Тема 5. Аналитическая гель-хроматография . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Работа № 13. Определение молекулярного веса рибонуклеазы методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100 (G-150) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Работа № 14. Определение молекулярной массы белков методом гель-фильтрации в тонком слое сефадекса . . . . . . . . . . . . 35
Тема 6. Электрофорез . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Работа № 15. Определение степени чистоты полученного препарата с помощью диск-электрофореза в ПААГ . . . . . . . . . . 38
Работа № 16. Определение молекулярной массы белков методом электрофореза в пластинах ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
ПРИЛОЖЕНИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Приложение 1. Прописи приготовления растворов с различными значе-
ниями pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Приложение 2. Молекулярная масса некоторых белков . . . . . . . . . . . . . 48 Приложение 3. Некоторые свойства сефадекса . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 Приложение 4. Удельный вес и молекулярная концентрация концентри-
рованных кислот и аммиака . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 Приложение 5. Регенерация и хранение сефадекса . . . . . . . . . . . . . . . . 49 Приложение 6. Перекристаллизация сульфата аммония . . . . . . . . . . . . . 49 Приложение 7. Определение активности лектина методом гемагглютина-
ции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 Приложение 8. Определение относительного центробежного ускорения . . 51 Приложение 9. Некоторые сведения по лабораторной практике . . . . . . . . 54
Учебное издание
Составители:
Галицкая Анна Алексеевна, Каневский Матвей Владимирович, Коннова Светлана Анатольевна, Плешакова Екатерина Владимировна
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ
КБОЛЬШОМУ ПРАКТИКУМУ ПО БИОХИМИИ
Вдвух частях
Ч а с т ь 1 Основные методы исследования
биомакромолекул
Учебно-методическое пособие для студентов биологического факультета,
обучающихся по направлению подготовки 06.03.01 «Биология»
Редактор Е. А. Митенёва
Технический редактор Т. А. Трубникова Корректор Т. К. Певная Оригинал-макет подготовил И. А. Каргин
Подписано к использованию 31:08:2019. Формат 60 841=16.
Усл. печ. л. 4.65 (5.0). Объем данных 1 Мб.
Издательство Саратовского университета. 410012, Саратов, Астраханская, 83.