Технология подготовки растительного сырья для биоконверсии. Учебное пособие

ролизата дают возможность получить кормовой продукт, сравнимый по своей питательной ценности с соевым белком. Ферментативный гидролиз исходного сырья проводят под действием целлюлаз в течение 20 ч. В результате удается получить 12%-й раствор восстанавливающих сахаров. Известен способ ферментативного гидролиза отходов переработки картофеля устойчивой к нагреванию альфаамилазой, способной расщеплять крахмал при прохождении исходного сырья и фермента через обогреваемый реактор. Получаемый таким образом ферментолизат используют в качестве осахаренного субстрата для культивирования микроорганизмов – продуцентов белка или непосредственно для производства гранулированного корма.

Нагревание влажных растительных материалов при достаточно высоких температурах также приводит к превращению легкогидролизуемых полисахаридов гемицеллюлоз в сахара и олигосахариды и даже к глубокому распаду образующихся cахаров, например до фурфурола. Основным катализатором этого процесса, называемого иначе бескислотным гидролизом, являются органические кислоты, образующиеся

врезультате термообработки растительного материала (уксусная кислота, выделяющаяся в растворе вследствие отщепления от гемицеллюлоз ацетильных групп, а также муравьиная кислота, образующаяся при распаде cахаров). Известно, что каталитическая активность этих кислот в 20–30 раз ниже каталитической активности серной кислоты. Некоторую роль в этом процессе в качестве катализатора распада сахаров могут играть и соли, образующиеся из зольных веществ сырья. Водная термообработка растительного сырья имеет важное практическое значение и используется при производстве фурфурола, целлюлозы и растительно-углеводного корма.

Гидролиз растительного сырья проводят в две стадии, на первой из которых, осуществляемой разбавленной серной кислотой при 100 °С

втечение 1–5 ч, происходит в основном гидролиз гемицеллюлозы до ксилозы, а на второй, осуществляемой концентрированной серной кислотой в течение 3 ч при той же температуре, протекает гидролиз целлюлозы с образованием глюкозы. При этом реакционную смесь после завершения второй стадии используют на первой стадии как источник разбавленной серной кислоты. В результате обеих стадий концентрации ксилозы и глюкозы в гидролизате достигали 10 %, а концентрации фурфурола и оксиметилфурфурола не превышали 0,005 %.

При биоконверсии мельничных отходов в белково-углеводный корм субстрат подвергают электрохимической предобработке.

Обычное бланширование клубней и мезги топинамбура водой или паром вызывает сильное размягчение растительной ткани, прида-

21

ет ей слизистую консистенцию, затрудняет последующее прессование. Выход сока из мезги клубней топинамбура без предварительной обработки находится на уровне 40 %, для обеспечения наибольшего выхода сока, хороших условий прессования мезги в качестве способа предварительной обработки предложен электроплазмолиз. Измельченные клубни топинамбура пропускали через электроплазмолизатор, выход сока при этом достигал 65 %, что дало основание использовать этот способ для практических целей. Обработка мезги топинамбура переменным электрическим током промышленной частоты (электороплазмолиз) обеспечивает ей надлежащую подготовку к прессованию, выход сока при этом достигает 65 %.

Для осахаривания предобработанную щелочью багассу сахарного тростника подвергают ферментативному гидролизу комплексом, полученным при культивировании грибов родов Aspergillus и Triohoderma. Основными продуктами в этом случае являются глюкоза

иксилоза в соотношении 3:1. Ферментативный гидролиз пульпы сахарной свеклы применяется и для последующего выращивания дрожжей рода Candida с целью получения кормового продукта, содержащего до 40 % белка, а также в случае твердофазной ферментации с целью получения этанола.

Ферментативный гидролиз целлюлозосодержащих отходов чайных концентратов осуществляют культурами дрожжей Candida krusei

иCandida pelliculosa.

Часто предобработку растительного сырья проводят в несколько стадий. Так, при двухстадийном гидролизе сахарной свеклы на первой стадии сырье обрабатывают разбавленной кислотой (соляной или серной) при 60–80 °С, в результате чего происходит деструкция гемицеллюлозы, и получают остаток, обогащенный целлюлозой. Остаток после кислотной обработки подвергают ферментативному гидролизу с помощью целлюлаз.

Среди перспективных процессов можно отметить термолиз (автогидролиз), сочетание автогидролиза, экстракции и взрыва, радиолиз, щелочную делигнификацию, гидролиз в парах диоксида серы, гидролиз в органических растворителях, высокотемпературный гидролиз, а также прямой и непрямой ферментативный гидролиз. Несомненно, что каждый из перечисленных процессов обладает своими достоинствами и недостатками. Некоторые исследователи полагают, что только сочетание этих процессов может иметь промышленное значение, например сочетание кислотного и ферментативного типов гидролиза.

22

В любом случае проводимая предобработка должна обеспечивать уменьшение индекса кристалличности, увеличивать поверхность

идоступность субстрата, количество моносахаров, быть дешевой и экологичной. Но универсального метода предобработки для любого типа сырья не существует, и окончательный выбор метода зависит от конкретного вида сырья, продуцента и используемой технологии. Ряд методов предобработки имеют высокую эффективность, но некоторые требуют значительных материальных затрат в силу материало-

иэнергоемкости, необходимости использования специальных конструкционных материалов, нейтрализации, регенерации или плохой экологической защищенности. Наиболее широкое распространение для получения моносахаров с последующим выращиванием определенного штамма – продуцента белка получил кислотный гидролиз, не лишенный вышеуказанных недостатков.

При разработке технологии биоконверсии растительного сырья предпочтение отдается замкнутым технологическим схемам комплексного использования растительного сырья, которые включают стадии ферментации и химические превращения исходных продуктов в ценные вещества. Преимуществом такой схемы является то, что она отличается высокой подвижностью и позволяет в зависимости от задач и запросов организовать производство, выпускающее несколько видов продуктов, необходимых народному хозяйству. Комплексная переработка растительного сырья представляет особый интерес, так как при этом основные технологические этапы осуществляются с помощью ферментации путем использования для этой цели большого количества микроорганизмов.

Необходимо подчеркнуть, что подготовка субстратов для биоконверсии должна проводиться с учетом свойств микроорганизмов. Полнота усвоения субстрата будет точно соответствовать степени распада полисахаридов растительного сырья. Поэтому выбор штаммапродуцента для осуществления процессов биосинтеза представляется очень важным и во многом определяющим технико-экономические показатели всего производства кормового белка.

1.3. МИКРООРГАНИЗМЫ – ПРОДУЦЕНТЫ КОРМОВОГО БЕЛКА НА УГЛЕВОДНЫХ СРЕДАХ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Продуцентами белка на углеводных субстратах могут быть дрожжи, бактерии, микроскопические грибы, актиномицеты и водоросли.

23

Бактерии имеют высокую скорость роста и дают биомассу с повышенным содержанием белка и метионина. Однако биомасса бактерий характеризуется повышенным содержанием нуклеиновых кислот и большими трудностями отделения ее от культуральной жидкости. Многочисленные исследования посвящены получению грибных белковых продуктов пищевого и кормового назначения, так как грибной белок по аминокислотному составу близок к мясному белку, содержит мало нуклеиновых кислот. Но при использовании грибных продуцентов белка необходимость проведения ферментации в строго асептических условиях в течение длительного времени накладывает определенные ограничения на крупнотоннажные варианты реализации этого процесса.

Дрожжи способны продуцировать биомассу, содержащую до 58 % белка, ценные аминокислоты и витамины. Дрожжи могут утилизировать различные субстраты – сахариды, органические кислоты, а некоторые даже полисахариды. К недостаткам дрожжевой биомассы можно отнести повышенное содержание нуклеиновых кислот. Чаще всего в качестве продуцентов применяют дрожжи родов

Candida, Rhodotorula, Trichosporon, Saccharamyces, Torulopsis, Hansenula и др. Наиболее часто используемыми являются аспорогенные дрожжи, относящиеся к роду Candida – С. tropicalis, С. scottii,

С. utilis, С. edax, С. maltosa, С. melinii.

Дрожжи, выращенные на гидролизатах растительного сырья, содержат 52–54 % сырого протеина, 13–16 % углеводов, 22–40 % безазотистых экстрактивных веществ, 2–3 % жира, 6–10 % воды. В составе их белка идентифицировано 17 аминокислот, в том числе все жизненно необходимые. Суммарное содержание аминокислот в товарных кормовых дрожжах составляет 36–39 % от сухого веса. Дрожжи богаты витаминами группы В и эргостерином.

Отличительным признаком этих дрожжей является их способность к усвоению пентоз, которые входят в состав гидролизатов и составляют около 30 % от общего количества сахаров, образующихся при гидролизе древесины. Дрожжи используют для роста и синтеза белка различные источники углерода (сахара, органические кислоты), содержащиеся в гидролизате, кислород воздуха, минеральный и органический азот, фосфор и в небольших количествах калий, натрий, железо, магний и кальций. Дрожжи С. tropicalis нуждаются в биотине, поэтому часто для компенсации потребности совместно с основным видом выращивают С. utilis и С. arborea. Несомненно, что будущее принадлежит смешанному культивированию.

24

Дрожжи C. scottii ассимилируют глюкозу, галактозу, L-сорбозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, L-ксилозу, L-арабинозу, L-рамнозу, этанол, глицерин, сорбит, молочную, янтарную и лимонную кислоты, а также слабо усваивают растворенный крахмал, инозит и салицин. Нитраты не ассимилируют, не нуждаются в биотине, хотя отдельные витамины стимулируют рост изученных штаммов. Потребность в витаминах носит характер штаммовых отличий. Этот вид дрожжей активно растет на различных гидролизных средах – послеспиртовой барде, смеси гидролизата и барды, гидролизате древесины, давая выход биомассы 50–55 % в зависимости от качества используемого субстрата. Дрожжи этого вида характеризуются высокой удельной скоростью роста. Продуктивность достигает 3,6–4,2 кг АСД/(м3·ч) при содержании истинного белка 44–48 %. Следует отметить, что штаммы дрожжей, обладающие повышенным содержанием белка в биомассе, более чувствительны к ингибиторам гидролизных сред, поэтому требуют дополнительного облагораживания гидролизатов. Дрожжи С. scottii растут на производственных средах в виде веточек, кустиков, вследствие чего легко отделяются из отработанной бражки, обладая хорошей флотирующей способностью. Дрожжи данного вида развиваются при температуре 38–39 °С и pH 4,2–4,6, требуют интенсивной аэрации.

Дрожжи вида C. tropicalis постоянно присутствуют в микрофлоре ферментеров, они активно сбраживают глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу и ассимилируют глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, мелицитозу, инулин, молочную, янтарную, лимонную кислоты, растворимый крахмал и др., но не усваивают раффинозу, лактозу, мелибиозу, дульцит, инозит и рамнозу. Штаммы этого вида не расщепляют или очень слабо расщепляют арбутин, не образуют крахмалоподобных соединений, гидролизуют мочевину. Нитраты не ассимилируют. Значительно стимулируют рост штаммов пантотеновая кислота, биотин и тиамин.

Дрожжи вида C. tropicalis являются менее урожайными при культивировании на гидролизатах, чем C. scottii. Выход биомассы достигает 38–46 %, удельная скорость роста составляет 0,15–0,20 ч–1. Внесение дрожжевого автолизата в количестве 0,5 % значительно увеличивает продуктивность штаммов на гидролизате: выход биомассы достигает 48–50 %, а удельная скорость роста – 0,25–0,28 ч–1. Дрожжи С. tropicalis развиваются в виде раскидистых веточек, хорошо флотируются. При голодании и недостаточной аэрации они распадаются на отдельные клетки или вытягиваются в псевдомицелиаль-

25

ные нити, что затрудняет их выделение из отработанной бражки. Содержание сырого протеина в дрожжах составляет 46–50 %, истинного белка – 38–42 %. На производственных средах дрожжи активно растут при температуре 36–37 °С и pH 4,2–4,5.

Оптимум значений pH при культивировании составляет 5,0–5,5, температурный оптимум для С. utilis – 30–35 °С, С. tropicalis 36–37 °С,

C. scottii – 38–39 °С.

Микроорганизмы рода Endomycopsis fibuligera являются мицелиальными грибами, ранее объединявшимися в один порядок с дрожжами. Грибы могут размножаться как почкованием, так и делением. При почковании последовательно возникающие клетки могут не отделяться друг от друга, в этом случае они образуют структуры, называемые псевдомицелием, что обеспечивает хорошую фильтруемость культуральной жидкости. Колонии быстро растут на суслоагаре. Endomycopsis fibuligera сбраживает глюкозу, фруктозу, левулёзу, маннозу, галактозу, сахарозу, мальтозу. Содержание сырого протеина составляет 41–46 %, истинного белка – 34–39 %.

Дрожжеподобные грибы вида Endomycopsis fibuligerа обладают амилазной активностью и выращиваются на среде, содержащей крахмал, но имеют меньший выход белка. Поэтому дрожжи этого вида используются в глубинном культивировании совместно с дрожжами рода Candida.

1.4. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

Биотрансформация растительного сырья, отходов сельского хозяйства, обогащение их белком для повышения кормовой ценности, несомненно, являются одним из перспективных путей расширения кормовой базы животноводства.

Широкие исследования, направленные на поиск рациональных технологических решений переработки отходов сельскохозяйственного производства или промышленности, перерабатывающей растительное сырье, показали, что биоконверсия растительных материалов может быть реализована не только в условиях промышленного производства, как это имеет место в микробиологической промышленности при получении кормовых дрожжей из гидролизатов целлюлозосодержащего сырья, но и непосредственно в сфере сельского хозяйства.

Растительное сырье и отходы его переработки характеризуются сложным химическим составом. Основными компонентами сухих веществ растительного сырья являются целлюлоза (от 15 до 40 %),

26

гемицеллюлоза (от 17 до 40 %), лигнин (от 10 до 30 %), а также крахмал, пектины и т. п. Большая группа растительных отходов характеризуется повышенным содержанием лигнина, и такой вид сырья в биотехнологии получил название лигноцеллюлозных материалов. Для использования растительного сырья в качестве субстрата в биотехнологических процессах необходимо решить проблему предварительной его обработки с целью повышения реакционной способности.

Способы биотрансформации делятся на две большие группы: прямая биотрансформация; непрямая биотрансформация.

При непрямой биотрансформации деградация субстрата проводится биохимическими (путем ферментативного гидролиза), химическими (кислотный или щелочной гидролиз) или биологическими (гидролиз субстрата продуцентом гидролаз) методами, а синтез белка из продуктов деградации субстрата осуществляется быстрорастущими продуцентами белка.

В случае прямой биоконверсии в деградации субстрата участвует ассоциация микроорганизмов, каждый из которых расщепляет и синтезирует белок из определенного полимера сложного растительного субстрата.

Известно, что эффективность использования того или другого способа биотрансформации растительных материалов сильно зависит от структуры и состава растительного сырья, а также техникоэкономических факторов.

В последние десятилетия большое внимание уделяется способам прямой биотрансформации отходов растительного сырья с целью улучшения их переваримости и обогащения микробным белком или их предобработки для последующих биохимических превращений в более полноценные углеводно-белковые корма.

Лигноцеллюлозный комплекс растительного сырья может разлагаться различными видами микроорганизмов благодаря синтезу ими специфического комплекса целлюлолитических ферментов.

В аэробных условиях грибы бурой и белой гнили играют главную роль в разложении лигноцеллюлозного компонента растительного сырья. Грибы бурой гнили (Agrocybe, Flamulina velutipes и т. д.) разлагают только целлюлозу и гемицеллюлозу, придавая при этом субстратам бурый цвет, характеризующий накопление освободившегося лигнина. Грибы белой гнили могут разлагать все компоненты, среди них некоторые штаммы (Dichomitus squalens, Abortiporus bienis,

Stropharia rugosoannulata, Pleurotus eryngii, P. sajosaju и т. д.) более активно разлагают лигнин, особенно гриб Sporotrichum pulverulentum,

27

способный разлагать лигноцеллюлозный компонент со скоростью 3 % субстрата/день.

Рядом исследователей показано, что грибы Trichoderma, Chaetomium, Myrothecium также хорошо разлагают целлюлозу в лигноцеллюлозном комплексе.

Целлюлозосодержащие субстраты, а именно отходы сахарного производства, растительные отходы, получаемые в процессе обработки овощей, использовались японским и французскими исследователями для выращивания грибов, идущих в корм животных. Для этих целей рекомендуют использовать штаммы Oidodendrom griseum, Pénicillium cyclopium и Pеnicillium crustosum. Эти грибы отличаются способностью развиваться при низком значении рН (от 1,7 до 3,0) с оптимальным значением 2,0. Максимальный вес мицелий приобретает через 10 дней. По питательной ценности 0,4 г сухого белкового мицелия могут заменить в рационе кролика 2 г растительного белка.

Исследования ряда ученых показывают, что аэробные бактерии

родов Cytophaga, Sporocytophaga, Cellulomonas, Pseudomonas и некоторые другие также хорошо разлагают целлюлозу. Так, ученые из университета штата Луизиана (США) выработали способ получения белковой биомассы путем выращивания бактерий Cellullomonas на выжимках свеклы или сахарного тростника. Подготовка отходов ограничивается размолом и суспензированием полученного материала в среде, что значительно снижает эксплуатационные затраты и себестоимость продукта. Бактерии родов Nocardia, Flavobacterium,

Aeromonas, Bacillus, Agrobacterium, Xanthomonas также обладают способностью разлагать целлюлозу.

Среди актиномицетов только некоторые роды способны разлагать лигноцеллюлозу, причем наиболее часто встречаемыми являются

Thermoactinomyces, Thermomonospora, Micromonospora chalcea,

Streptomyces cellulozae.

Гидролиз полисахаридов свекловичной пульпы экстрактами твердофазных культур Pénicillium capsulation, обладающих целлюлазной, β-глюкозидазной, ксиланазной, β-ксиланазной, арабиназной, пектиназной и пектинэстеразной активностями, дает максимальную степень осахаривания 76 % через 2,5 сут. При рН 4,5–5,0 и температуре 50 °С выход глюкозы составлял 40 %. Отсутствие в исходном экстракте пектинлиазы не влияет на эффективность гидролитического процесса.

Пульпу кормовой свеклы используют для твердофазной ферментации с целью получения этанола. Пульпу вначале доводят

28

до рН 3,0 для уничтожения бактериальных загрязнений. Максимум дрожжевой популяции, которая создается в пульпе, не зависит от размера ячейки решета мельницы и в среднем составляет 200–230 млн клеток/мл и достигает этого значения через 19–22 ч для тонкоизмельченной пульпы (0,476–0,953 см) и 24–28 ч для грубоизмельченной пульпы (1,270–1,905 см). Слабая зависимость параметров ферментации от размера измельчения объясняется влажной волокнистой природой свеклы, что мешает свободному проходу пульпы через решето. Поэтому независимо от размера ячейки решета образуются частицы приблизительно одинакового размера. Следовательно, тщательное измельчение свеклы нецелесообразно.

Условия проведения процессов твердофазной ферментации

восновном зависят от используемого сырья и штамма биодеструктора. Однако существенные недостатки твердофазной ферментации не позволяют получить более высококачественные корма и также осуществить широкое ее промышленное применение.

Глубинная ферментация имеет давнюю историю и широко используется в настоящее время, так как по сравнению с поверхностным культивированием обладает следующими преимуществами:

–позволяет приготовить реакционно-активную равномерную ферментационную среду, которая оптимально подходит к физиологическим особенностям используемых микроорганизмов;

–дает при одном и том же объеме ферментационной среды больше биомассы и более высокую эффективность ферментации по сравнению с поверхностной ферментацией;

–имеет меньшую трудоемкость и площадь производства;

–позволяет легко применять механизацию и автоматизацию

врегулировании процессов как самой ферментации, так и на стадиях выделения готового продукта.

Поэтому, несмотря на имеющиеся недостатки (дорогостоящее оборудование; переработка больших объемов жидкости, возможность инфицирования посторонней микрофлорой; сложность процессов выделения готового продукта), глубинное культивирование нашло широкое применение и является более перспективным по сравнению с поверхностным в производстве белка одноклеточных для кормовых целей.

Многочисленные исследования по использованию дрожжей и дрожжеподобных грибов для получения белка одноклеточных показывают, что более перспективно использование дрожжевых штаммов при глубинном культивировании для обоих вариантов биоконверсии.

29

Известны работы, в которых рассмотрены вопросы культивирования быстрорастущих дрожжей на ферментативных гидролизатах картофельных и плодоовощных отходов, в которых биохимическая обработка осуществляется на первой стадии биоконверсии, а синтез белка – на второй.

Имеются немногочисленные сведения о прямой биоконверсии растительных полимеров в дрожжевой белок. Биоконверсия углеводсодержащих отходов сводится к двум основным биохимическим процессам: гидролизу целлюлозы ферментами и росту клеток микроорганизмов с использованием продуктов гидролиза. Если оба эти процесса осуществляются одним микроорганизмом, то процесс биоконверсии тогда называют прямым или одностадийным. За некоторым исключением дрожжи обладают слабыми гидролитическими системами, не способными расщеплять трудногидролизуемые полимеры (целлюлозу, лигнин). В основном при прямой биотрансформации быстрорастущие дрожжи могут усваивать крахмал и пектинсодержащие субстраты, такие как отходы бананов, ананасов, пектинсодержащие стоки от переработки фруктов и овощей. Такие продуценты белка, как C. utilis и C. tropicalis, используются при прямой биотрансформации сладких виноградных выжимок, отходов переработки ананасов, свекловичного жома и хлопковой шелухи, Saccharornyces fibuliger – при прямой биоконверсии пектинсодержащих сточных вод, микроорганизмы рода Torulopsis – при биоконверсии гуза-пайи, виноградной лозы, рисовой соломы, стеблей кукурузы, Endomycopsis fibuliger – при обогащении пшеничных отрубей, листьев сахарной свеклы для получения белковых продуктов и белково-ферментных препаратов. Экономическая эффективность процессов биоконверсии растительного сырья в микробный белок, состав получаемого продукта зависят не только от используемого штамма-продуцента, но и от условий культивирования продуцента, подготовки сырья и способов выделения готового продукта.

В отличие от прямой биоконверсии растительного сырья, которая широко распространена в природе и осуществляется микроорганизмами, расщепляющими основные компоненты древесины, непрямая биоконверсия включает в себя стадию предварительной обработки растительных материалов для удаления тех препятствий, которые могут замедлить процесс ферментации.

При подготовке субстратов для проведения способов непрямой биотрансформации растительного сырья широкое применение получил гидролиз растительного сырья минеральными кислотами и его

30