Технология малотоннажного производства Неовира – нового биологического средства для защиты леса от рыжего соснового пилильщика

После окончания работы центрифуги стаканы извлекают и сливают из них всю жидкость (фугат) (рис. 16).

На дне стаканов остается осадок (рис. 17). Его следует ресуспендировать, т.е. смешать осадок после центрифугования с физиологическим раствором. Для этого стеклянной палочкой аккуратно размешивают осадок до однородной массы, затем в стакан постепенно по каплям доливают физраствор при постоянном помешивании. Объем постепенно доводят до 1/3 объема стакана.

При правильном выполнении этой операции не должно оставаться комочков. В не до конца ресуспендированных частицах (комках) происходит быстрое размножение бактерий, а при подсчете полиэдров в суспензии титр получится заниженным.

Хорошо ресуспендированный осадок сливают из центрифужных стаканов в емкость для накопления и последующего хранения в холодильнике. Суспензия вирусной биомассы не должна быть густой, при необходимости следует долить консервант (физраствор) и хорошо перемешать.

3.1.3. Хранение суспензии вирусной биомассы

Хранение осуществляют в холодильнике при температуре 4–5 оС, пока идет процесс следующего этапа центрифугирования.

3.1.4. Определение рН

Показатель кислотности суспензии должен составлять 6,5–7,5. Если он отличается от указанного, добавляют физраствор.

Цикл 2

3.2. Центрифугирование

Второй этап центрифугирования необходим для более тщательной очистки от мелких примесей и посторонней микрофлоры. Для этого после хранения сливается надосадочная жидкость. Полученный осадок тщательно гомогенизируют. Затем концентрированный гомогенат фильтруется.

3.2.1. Фильтрация

Фильтрацию необходимо проводить для исключения в составе биосредства комочков от первого ресуспендирования, а также очистки от мел-

21

ких примесей. Для фильтрации используют тонкий фильтр – не более 20 мкм. Полученный фильтрат хранят в холодильнике, он подлежит следующему этапу центрифугирования.

3.2.2. Процесс центрифугирования

Работы выполняются в соответствии с пунктом 3.1.2. Отличие заключается в том, что при ресуспендировании следует использовать смесь физраствора (50 %) и глицерина (50 %).

Ресуспендированный осадок сливают в емкости для накопления всего объема суспензии вирусной биомассы и хранят в холодильнике.

После окончания работ со всей партией суспензии, весь ресуспендированный объем смешивают в большой емкости, гомогенизируют (тщательно перемешивают), после чего берут пробы для определения титра концентрированной суспензии.

3.2.3. Определение титра концентрированной суспензии

Для определения титра следует взять 3 мерные пробирки объемом по 10 мл. В каждую наливают 9 мл дистиллированной воды. Из емкости берут 1 мл хорошо перемешанной концентрированной суспензии и добавляют в первую пробирку. Полученный раствор хорошо взбалтывают (получено 10-кратное разведение). Затем чистой пипеткой из первой пробирки берут 1 мл и добавляют во вторую пробирку (получено 100-кратное разведение). Аналогично следует получить 1000-кратное разведение.

Подсчет полиэдров в последнем разведении проводят с помощью камеры Горяева.

К поверхности камеры Горяева притирается шлифованное покровное стекло до появления колец Ньютона. Под покровное стекло в капилляры пипеткой суспензия вводится таким образом, чтобы не было пузырьков

воздуха – до полного заполнения капилляров. При объективе 10х и окуляре 10х под микроскопом обнаруживают сетку камеры. Затем переводят на окуляр 40х и при увеличении в 400 раз и более подсчитывают число полиэдров в 100 малых квадратах сетки. Показатели числа полиэдров суммируют, находят среднее арифметическое число полиэдров в квадрате. Это число умножают на 4×108 (если для подсчета использовали 100-кратное разведение). Полученный показатель является числом полиэдров в 1 мл

22

суспензии (титром суспензии). Если использовали 1000-кратное разведение, то полученное число умножают на 4×109.

3.2.4. Определение чистоты суспензии

С помощью микроскопа с увеличением не менее 400х в мазке из суспензии определяют наличие лишних примесей, кусочков тканей, комков, бактерий. Если в поле зрения объектива указанные примеси занимают 50 % и более, следует проводить дополнительный цикл центрифугирования.

3.2.5. Доведение до необходимого титра(1 млрд в 1 мл)

При титре концентрированной суспензии выше 1×109 следует добавить 50 %-й глицерин в объеме, вычисленном следующим образом. Объем концентрированной суспензии умножаем на ее титр. Из полученного произведения вычитаем объем концентрированной суспензии. Итоговый результат является количеством 50 %-го глицерина, который следует добавить в концентрированную суспензию.

Например, объем суспензии составляет 7,8 л с титром 4,67×109. Вычисляем объем добавляемой жидкости: 7,8 × 4,67 – 7,8 = 28,6. Получаем, что необходимо долить 28 л и 600 мл 50 %-го глицерина, чтобы получить биосредство с титром 1×109. В результате объем готового биосредства будет составлять 36,4 л.

Полученное биосредство тщательно перемешивают и разливают в емкости для хранения и транспортировки.

4. КОНТРОЛЬКАЧЕСТВА

Технологические операции по контролю качества Неовира (блок 4) приведены на рис. 3. Контроль качества осуществляется в соответст-

вии с ГОСТ 14189–81 и ГОСТ 28495–90.

Для проверки биосредства установлены следующие виды испыта-

ний:

9приемо-сдаточные;

9периодические;

9типовые.

Если нет дополнительных требований, то испытания проводят в

23

нормальных условиях:

9температура от 20 до 30 оС;

9относительная влажность от 45 до 75 %

9атмосферное давление от 650 до 800 кПа.

Испытательное оборудование и средства измерений, применяемые при испытаниях биологического средства, должны быть поверены и аттестованы в установленном порядке.

Проверку внешнего вида Неовира на соответствие технической документации проводят визуально сличением с показателями и образцом эталона. По органолептическим и физико-химическим и биологическим показателям Неовир должен соответствовать значениям, указанным в табл. 1.

Таблица 1. Основные показатели Неовира

* Образовавшийся при хранении осадок при встряхивании исчезает.

Содержание в биологическом средстве токсичных элементов, химических инсектицидов, радионуклидов не допускается (по ГОСТ 1.5.326– 1.036.15).

4.1. Определение количества полиэдров

После получения биологического средства необходимо подтвердить, что титр соответствует 1×109. Отбор проб и определение качественного состава проводят по ГОСТ 28495–90. Масса объединенной пробы – не менее 50 мл.

4.2. Определение общего микробного числа

Для определения уровня обсемененности суспензии вирусного биосредства посторонними микроорганизмами достаточно определить общую

24

бактериальную обсемененность по так называемому микробному числу, под которым понимают количество колоний, выросших на мясопептонном агаре в чашках Петри после высева из последовательных разведений биосредства и инкубации при температуре 28 оС.

Для работы необходимо подготовить питательную среду и серию разведений пробы биосредства. Ряд серийных, 10-кратно убывающих разведений – от 101 до 106 – готовят в стерильном физрастворе в объеме 1 мл. Разведение осуществляют следующим образом: в пробирку с 0,9 мл стерильного физраствора вносят 0,1 мл испытуемого образца в разведении 1:10. Следующее разведение получают добавлением 0,1 мл из предыдущего. Для каждого разведения используют отдельную стерильную пипетку.

Из каждой пробы биосредства для посева используют не менее 2-х разных разведений (в зависимости от степени предполагаемого загрязнения) с таким расчетом, чтобы в чашках вырастало от 30 до 300 колоний. Как правило, это разведение 1×106.

Допускается засев одной пипеткой нескольких разведений, причем посев начинают с больших разведений (например: сначала из 106, затем –

103 и т.д.).

Материал предварительно перемешивают пипеткой, а затем по 0,1 мл вносят в 2 стерильные чашки Петри, слегка приподняв крышку. После этого вливают 15 мл расплавленного и остуженного до 45 оС мясопептонного агара, быстро смешивают его с вирусным материалом, осторожно наклоняя и вращая чашку, избегая смачивания бортов. Чашки оставляют при комнатной температуре до загустения агара, затем подписывают и помещают в термостат, где выдерживают при температуре 28 оС в течение 24 ч.

После этого проводят подсчет выросших колоний в глубине агара и на его поверхности. Количество колоний в пересчете на 1 мл, округляя до 10, 100, 1000 и т.д. покажет общую бактериальную обсемененность биосредства.

Число бактериальных клеток на 1 мл биосредства получают путем умножения числа колоний культур на соответствующее разведение. Например, если в чашке с разведением 105 есть 5 колоний, то обсемененность 1 мл составляет 5×105.

Работы проводятся в защитной одежде (халатах), респираторах и при включенной вентиляции. Посев осуществляют в камере ламинара.

25

4.3. Хранение

Неовир хранится в холодильниках при температуре 4–5 оС. Хранение при минусовой температуре вызывает кристаллизацию.

5. КОНТРОЛЬКАЧЕСТВАПОСЛЕХРАНЕНИЯНЕОВИРА

Технологические операции по контролю качества после хранения Неовира (блок 5) приведен на рис. 3.

5.1 Определение количества полиэдров

Работы выполняются в соответствии с пунктом 3.2.3.

5.2 Определение общего микробного числа

Работы выполняются в соответствии с пунктом 4.2.

5.3. Определение рН

При несоответствии показателя кислотности значению 6,5–7,5 биологическое средство считается непригодным. Условия хранения были нарушены, следует провести цикл очистки с помощью центрифугирования.

6. ИНСТРУКЦИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ ВЫПОЛНЕНИИРАБОТ НА МАЛОТОННАЖНОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ВИРУСНОГОБИОЛОГИЧЕСКОГОСРЕДСТВА

6.1.Общие положения техники безопасности

6.1.1.К работе в лаборатории допускаются лица, прошедшие предварительный медицинский осмотр, ознакомленные с настоящей инструкцией, умеющие оказать первую помощь при несчастном случае.

6.1.2.К работе с вирусами и насекомыми не допускаются подростки в возрасте до 18 лет, а также беременные и кормящие грудью женщины и лица с хроническими заболеваниями органов дыхания, зрения, кожи, склонные к аллергическим реакциям.

6.1.3.Перед началом работ руководитель лаборатории проводит инструктаж по технике безопасности.

6.1.4.После проведения инструктажа каждый работник расписывается в специальном журнале.

26

6.1.5.В каждой рабочей зоне на видном месте должна находиться инструкция по технике безопасности, подписанная руководителем.

6.1.6.Каждый работник лаборатории должен быть снабжен халатом, перчатками, респиратором или медицинской маской.

6.1.7.Контейнеры с насекомыми необходимо хранить на стеллажах

или полках.

6.1.8.При наличии в лаборатории стеллажей не устанавливать тяжелые предметы на верхние полки. Для снятия необходимых предметов с верхних полок стеллажей нужно пользоваться специально оборудованной для этих целей лестницей.

6.1.9.Вирусную суспензию хранить в любой плотно закрытой посуде

вхолодильнике с обязательной надписью на посуде.

6.1.10.Помещение должно быть оборудовано эффективно работающей вентиляцией, обеспечивающей нормальную ПДК вредных веществ в воздухе рабочей зоны.

6.1.11.Необходимо наличие медицинской аптечки в рабочем поме-

щении.

6.1.12.В аптечке необходимо иметь следующие медикаменты для оказания первой помощи при несчастных случаях: вата, бинт, питьевая сода, марганцовокислый калий, йод.

6.2.Требование техники безопасности перед началом работы

6.2.1.Приступать к работе можно только в халате и респираторе или марлевой повязке.

6.2.2.Необходимо освободить рабочее место от ненужных во время работы посторонних предметов.

6.2.3.Включить вентиляцию.

6.2.4.Тщательно вымыть руки с мылом.

6.3.Требования техники безопасности в период работы

6.3.1.Все работы с вирусной биомассой проводить в халате и рес-

пираторе.

6.3.2.Для отбора проб вирусной суспензии использовать только

пипетман.

6.3.3.При загрязнении вирусом рук и других частей тела вымыть загрязненные места с мылом.

6.З.4. При загрязнении вирусом стола или другой поверхности обработать это место и вокруг него 3 %-м раствором борной кислоты или 2 %-м раствором NaOH. Обработку проводить в резиновых перчатках.

6.3.5.Не принимать пищу во время работы с вирусом.

27

6.4.Требования техники безопасности после окончания работы

6.4.1.Всю использованную посуду замочить в 2 %-и растворе NaOH. Посуду мыть в резиновых перчатках.

6.4.2.Замоченную ранее посуду вымыть и убрать на место постоянного хранения.

6.4.3.При поражении стеклом рану нужно дезинфицировать спиртом или другим раствором, стерильным пинцетом аккуратно удалить осколки из раны и, убедившись, что их там больше нет, смазать раны йодом и наложить повязку.

6.4.4.Поверхности всех рабочих мест обработать растворами 2 %- й щелочи или 3 %-й борной кислоты либо спиртом.

6.4.5.Спецодежду, рабочее место и камеры, где расположены насекомые, обработать пылесосом.

6.4.6.Спецодежду убрать в шкаф, туда же, после соответствующей обработки, убрать и другие средства индивидуальной защиты.

6.4.7.Рот прополоскать 5 %-м раствором питьевой соды.

6.4.8.По окончании всех работ и ухода людей из помещения включить бактерицидную лампу на 40 мин.

28

Сергеева Ю. А., Гниненко Ю. И., Долмонего С. О.

Технология малотоннажного производства Неовира – нового биологического средства для защиты леса от рыжего соснового пилильщика

Редактор М.Ф. Нежлукто

Формат 60х90 1/16 Объем 2.0 печ. л. Тираж 300 экз.

Отпечатано в ФБУ ВНИИЛМ 141200, г. Пушкино Московской обл., ул. Институтская, д.15

Тел.: (495) 993-30-54 факс: (495) 993-41-91

29