Технология малотоннажного производства Неовира – нового биологического средства для защиты леса от рыжего соснового пилильщика

Необходимо соблюдать аккуратность и стараться не допускать попадания экскрементов, кусочков хвои и коры в сбор, так как это усложнит последующую очистку вируса.

Собранные трупы следует разложить на ткани для высушивания (рис. 9). Не допускается попадание на них прямых солнечных лучей! Периодически подсыхающие трупы следует перемешивать. Следует предусмотреть защиту помещения, где подсыхают трупы инфицированных личинок, от насекомых-трупоедов, так как это может привести к потере заготовленного материала.

Ветви сосны, экскременты, оставшиеся в садках, а также и образовавшиеся коконы пилильщика следует утилизировать сжиганием.

1.6. Доставка в лабораторию

После полной гибели обработанных вирусом личинок их собирают и доставляют в лабораторию. При этом высушенные трупы (рис. 10) перевозят в бумажных мешках или коробках, а не высушенные следует транспортировать в контейнерах с широкой горловиной.

1.7. Определение наличия полиэдров

До начала работ по получению вирусной биомассы следует убедиться в наличии полиэдров в биоматериале. Для этого методом случайной выборки из каждой партии отбирают 5–7 трупов. Затем их следует тщательно перетереть в ступке с небольшим количеством дистиллированной воды. Из полученной суспензии нанести каплю на предметное стекло, сверху поместить покровное стекло и при помощи микроскопа с объективом 40х определить наличие в мазке полиэдров (рис. 11).

1.8.Завершение высушивания

Влаборатории всех личинок рассыпают на ткани в хорошо проветриваемом помещении, исключив попадание солнечных лучей, и досушивают весь биоматериал до воздушно-сухого состояния.

1.9.Заморозка и хранение сухого биоматериала

Весь высушенный биоматериал следует разложить в пакеты, банки или пластиковые контейнеры, и поместить в морозильную камеру с температурой –18 оС. Промораживание личинок можно проводить частями,

11

используя часть контейнеров и освобождая место для следующих. Промораживание каждой партии следует проводить не менее 7 сут.

Сухой замороженный биоматериал можно хранить в сухом месте, защищенном от прямых солнечных лучей, при температуре +5…+7 оС. Срок хранения не ограничен при условии отсутствия влаги.

2. ПЕРЕРАБОТКАПОГИБШИХЛИЧИНОКИОЧИСТКА ВИРУСНОЙБИОМАССЫ

Второй блок (блок 2) технологической схемы представляет собой операции и их последовательность на этапе переработки погибших личинок и очистки вирусной биомассы (см. рис. 2).

2.1. Общие положения

Согласно ГОСТ 12.1.007–76 Неовир относится к 4 классу опасности (малоопасные продукты), не содержит материалов, представляющих опасность для здоровья человека при использовании, и не выделяет вредные вещества, регламентированные в Единых санитарноэпидемиологических и гигиенических требованиях к товарам, подлежащих санитарно-эпидемиологическому надзору и регламентированных ГОСТ 12.1.007–76.

Помещения, где изготавливают Неовир, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, в соответствии с ГОСТ 12.4.021–75. Общие требования к пожарной безопасности должны соблюдаться в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004–91. При проведении работ концентрация вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должна превышать значений, указанных в ГОСТ 12.1.005–88 и ГН 2.2.5.1313–03. Уровень шума и вибраций на рабочих местах не должны превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.003–83, ГОСТ 12.1.012–2004, СН

2.2.4/2.1.8.562–96 и СН 2.2.4/2.1.8.566–96. Освещенность на рабочих местах должна соответствовать требованиям СП 52.13330.2011. А общие правила охраны окружающей среды при производстве – требовани-

ям СанПиН 1.2.1330–03, СанПиН 2.1.6.1032–01.

Контроль состояния окружающей среды должен проводиться предприятием-изготовителем или аккредитованными лабораториями

12

Рис. 10. Высушенные трупы личинок пилильщика

Рис. 11. Процесс определения наличия полиэдров в биоматериале

Рис. 12. Процесс смешивания (гомогенизации) сухого порошка вирусной биомассы с дистиллированной водой

14

Рис. 13. Процесс фильтрации гомогената

Рис. 14. Полученныев результате фильтрации отжим и фильтрат

Рис. 15. Процесс уравновешивания веса центрифужных стаканов на весах

15

Рис. 16. Слив фугата из центрифужных стаканов после центрифугирования

б – вид сверху

а – вид сбоку

Рис. 17. Вирусный осадок в центрифужных стаканах

16

(на договорных началах) по методическим указаниям, утвержденным в установленном порядке.

При производстве Неовира не должно образовываться технологических отходов, ведущих к загрязнению объектов окружающей среды. При его изготовлении необходимо соблюдать требования безопасности, указанные в ГОСТ 12.1.008–76.

Все лабораторные помещения, посуду и рабочую одежду перед началом манипуляций необходимо обеззараживать бактерицидными лампами в течение не менее 40 мин. Ежедневно следует проводить влажную уборку лабораторных помещений. Каждое помещение должно быть обеспечено полотенцем и мылом. Перед каждым этапом микроскопирования рабочие поверхности протирают спиртом, инструменты прокаливают на спиртовке, а объектив микроскопа после использования иммерсионного масла протирают ксилолом. Очистку предметных и покровных стекол проводят замачиванием в растворе хромпика (серная кислота + железоаммиачные квасцы). Стеклопосуду (мерные стаканы, пробирки и чашки Петри) моют раствором соды, тщательно смывают водой и полощут в дистиллированной воде, затем стерилизуют в суховоздушном шкафу в течение 1 ч при температуре 120 оС.

Все работы проводят в специальной одежде (ГОСТ 27575–87,

ГОСТ 27574–87, ГОСТ 12.4.028–76 и ГОСТ 12.4.253–2013) и в средст-

вах индивидуальной защиты (ГОСТ 12.4.011–89 и ГОСТ 12.4.103–83). Для оптимизации технологических процессов необходимо составить

перечень выполнения работ каждой категорией сотрудников (обязанности) и завести на каждом рабочем месте журнал для ежедневной регистрации выполненных работ; рационально организовать труд на каждом технологическом этапе с целью сокращения времени на вспомогательные операции и излишнего хождения за недостающими материалами в процессе технологической процедуры; осуществлять регистрацию и контроль прохождения каждой партии биомассы всех технологических процессов и степень очистки концентратов и конечного продукта.

Необходимо обеспечить доступ сотрудников к инструкциям по технике безопасности и методике работ на каждом рабочем месте.

Отходы производства биологического средства обеззараживают и утилизируют в соответствии с технологической документацией предпри- ятия-изготовителя.

17

Стеклянную и пластиковую посуду замачивают в глубокой раковине в 2 %-м растворе хлорамина, выдерживают в течение 1 ч, а затем промывают водопроводной водой с мылом или содой. Промывные воды направляют в сток.

Очистка отработанного воздуха (вентиляционных выбросов в атмосферу) из всех производственных помещений производиться в течение всего времени технологического процесса через шахты-воздуховоды, оснащенные всасывающими фильтрами на выходе.

Все производственные помещения должны быть снабжены бактерицидными лампами, которые включают после рабочей смены на 40 мин.

2.2. Измельчение сухого материала

Измельчение биоматериала следует проводить при помощи лабораторного блендера. Для этого в емкость прибора насыпают необходимый объем сухого биоматериала, позволяющий прибору равномерно его перемолоть. Измельчение проводят до однородного состояния. Чем тоньше размол, тем больше и легче работать с ним, а в дальнейшем можно получить больше вирусной массы.

2.3. Гомогенизация

Размолотый биоматериал необходимо гомогенизировать для получения однородной жидкой массы. При гомогенизации следует использовать дистиллированную воду – для исключения попадания примесей и изменения химизма. Для получения дистиллята используют лабораторный аквадистиллятор. Марка и мощность прибора зависят от потребностей производства.

Перед началом работ необходимо заготовить достаточное количество дистиллированной воды (ГОСТ 6709–72), наполнив чистые канистры или ведра с крышками. Потребность дистиллированной воды на 1000 г сухих личинок составляет 6–7 л.

Измельченный сухой биоматериал смешивают с дистиллированной водой до однородной кашицеобразной консистенции. Смешивание проводят в течение 2–3 мин с помощью лабораторного блендера (рис. 12). Полученный в результате смешивания гомогенат подлежит очистке путем фильтрации.

18

2.4. Фильтрация

Первый этап очистки гомогената представляет собой фильтрацию через тонкий фильтр с целью отделения остатков тканей, хитинового покрова и других примесей. Для этого следует использовать нейлоновые фильтры с размером пор не более 40 мкм.

Над чашей или тазом помещают фильтр, в который вливают 0,5– 3,0 л гомогената (в зависимости от размера фильтра) (рис. 13а). С концов фильтр собирают в единый пучок и отжимают вирусную суспензию (рис. 13б). После первого отжима в оставшийся на фильтре осадок следует добавить дистиллированную воду и снова отжать полученную массу. При отжиме необходимо перетирать биомассу, чтобы вымывание вируса происходило равномерно и более полно. Такие манипуляции с каждой частью гомогената следует проводить не менее 5–7 раз, до тех пор, пока из фильтра не начнет отжиматься светлая суспензия.

Врезультате получают фильтрат и хорошо отжатый остаток (рис. 14).

2.5.Определение рН

Всоответствии с ГОСТ 8.134–98 с помощью рН метра определяют кислотность фильтрата, который должен соответствовать показателю 6,5– 7,5. Если показатели фильтрата отличаются от указанного, добавляют дистиллированную воду.

2.6.Внесение антибиотика

Для уничтожения посторонней бактериальной микрофлоры в фильтрат следует добавить антибиотик (гентамицин сульфата или аналог) из расчета 80 ед. активного вещества на 1 л фильтрата. Фильтрат с антибиотиком выдерживают в канистрах или бидонах при комнатной температуре 2 сут., затем помещают в холодильник, где при температуре +4–+5 оС он временно хранится до начала работ по приготовлению биосредства.

3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ НЕОВИРА

Этапы приготовления биологического средства (блок 3) приведены на рис. 3. Работы в блоке 3 проводят в 2 цикла.

Для изготовления Неовира необходимо применять материалы и

19

приобретать изделия, отвечающие требованиям стандартов и технических условий, утвержденных в установленном порядке. Входной контроль применяемого сырья и материалов осуществляется в соответст-

вии с ГОСТ 24297–13.

При изготовлении биосредства должны применяться следующие материалы:

9глицерин дистиллированный по ГОСТ 6824–76;

9вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 6709–72;

9соль поваренная пищевая. Техническая условия ГОСТ Р

51574–2000.

Допускается применение других материалов, не ухудшающих эксплуатационные характеристики биосредства.

Качество применяемых покупных материалов должно отражаться соответствующей маркировкой и удостоверяться при входном контроле документом о качестве.

Цикл 1

3.1. Центрифугирование

Центрифугирование – разделение неоднородной суспензии на фракции по плотности при помощи центробежных сил. Центрифугирование осуществляется в специальных аппаратах – центрифугах.

3.1.1. Приготовление физраствора

В дистиллированную воду следует добавить поваренную соль из расчета 8,5 г на 1 л воды. Полученный раствор разливают по емкостям, накрывают крышкой (не пластик) и стерилизуют в автоклаве в течение 45 мин.

3.1.2. Процесс центрифугирования

Фильтрат, хранящийся в холодильнике, по мере необходимости извлекают, хорошо размешивают и разливают по центрифужным стаканам. Массу стаканов с фильтратом уравновешивают на точных весах и помещают в центрифугу (рис. 15). Процесс центрифугирования длится 60 мин при скорости 4200 об./мин.

20