Растения под крышей. Учебное пособие для направлений подготовки бакалавриата и магистратуры «Агрономия», «Агрохимия и агропочвоведение», «Ландшафтная

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» («ФГБОУ ВПО «КГТУ»)

Е.С. Роньжина

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ

для направлений подготовки бакалавриата и магистратуры «Агрономия», «Агрохимия и агропочвоведение», «Ландшафтная архитектура»

Калининград

2015

1

УДК 58

Роньжина, Е.С.

Растения под крышей [Электронный ресурс]: учебное пособие для направлений подготовки бакалавриата и магистратуры «Агрономия», «Агрохимия и агропочвоведение», «Ландшафтная архитектура» / Е.С. Роньжина. - ФГБОУ ВПО «КГТУ», 2015. – 892 КБ. Систем. требования: Электрон. кн. распростр. в виде файлов в защищ. формате pdf. (Откр. с использов. Adobe reader версии 9.0 и новее). – Создан

25.11.2015. – 54 с.

РЕКОМЕНДОВАНО кафедрой агрономии ФГБОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет» 26.11.2015, протокол № 3

АВТОР: Роньжина Е.С., доктор биологических наук, профессор заведующий кафедрой агрономии ФГБОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет»

РЕЦЕНЗЕНТЫ: Бедарева О.М.. доктор биологических наук, доцент, заведующий кафедрой агропочвоведения и агроэкологии ФГБОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет»

Панасин В.И., доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Заслуженный агроном РФ, директор ФГБУ «Центр агрохимической службы «Калининградский»»

В учебном пособии даются основные понятия о клеточной и тканевой инженерии растений, изучении современных методов культивирования и фиторегуляции клеточных культур, а так же об инновационных методах и эффективных приемах выращивания растений в сельском хозяйстве.

Учебное пособие предназначено для студентов бакалавриата и магистратуры специальностей «Агрономия», «Агрохимия и агропочвоведение», «Ландшафтная архитектура».

Роньжина Е.С., 2015 г.

ФГБОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет», 2015 г.

2

3

Введение

Внастоящее время скорость потребления человеком биологических ресурсов начинает превосходить скорость производительной активности биосферы, и в первую очередь – воспроизводительную способность растений. Экстенсивное направление развития сельского хозяйства с каждым годом становится все менее эффективным, в частности, в силу ограниченности размеров пригодных для земледелия территорий. Введение в фонды земледелия новых территорий требует больших затрат на окультуривание земель, мелиорацию, специальные приемы возделывания культур, что удорожает себестоимость продукции.

Это требует от человечества значительного повышения продуктивности сельскохозяйственных культур путем применения новых, перспективных технологий.

Перспективные технологии (или новые технологии) - EMERGING TECHNOLOGIES (OR PACING TECHNOLOGIES) - технологии, которые пока не применяются, но имеют значительный потенциал при использовании их для замены существующих технологий или производства новых продуктов.

Врастениеводстве их разработка основана на пока еще нереализованных кардинальных возможностях, которые делают введение в практику подходы интенсивного земледелия необходимыми и эффективными.

Особенно важно применение инновационных технологий в Калининградской области. Регион является эксклавным регионом России, расположенным в центре Европы. Она соединяет Россию с Западной Европой и окружена странами с высоким уровнем сельского хозяйства. Поэтому Калининградская область должна раньше других регионов нашей страны переходить на международные стандарты аграрного производства, качества продуктов питания и природной среды.

Несмотря на выгодное географическое положение и относительно благоприятные климатические условия, уровень сельскохозяйственного производства в Калининградской области пока недостаточно высок. Существующие в регионе проблемы носят системный характер и могут быть решены лишь путем реализации комплекса мероприятий, направленных на поддержку и повышение экономической эффективности аграрного производства, повышение культуры земледелия, изменение мировоззрения хозяйствующих субъектов.

Необходимо создать условия для устойчивого развития сельского хозяйства в Калининградской области, перевести аграрное производство в регионе на качественно новый уровень, увеличить производительность труда, повысить урожай и качество производимой сельхозпродукции, обеспечив при этом сохранение и улучшение состояния природной среды. Нужно содействовать производству высококачественной сельскохозяйственной продукции с использованием передовых технологий, повышению продуктивности и производительности сельскохозяйственного производства.

4

Успешное решение этих задач возможно только путем внедрения в сельскохозяйственную практику современных, разработанных на основе достижений биологической и аграрной науки технологий. Технологии должны быть экономически эффективными, доступными для рядового труженика, экологически безвредными.

Необходимо учитывать, что бурное развитие биологии в ХХ – начале ХХI века позволило достичь существенных успехов в выяснении молекулярных основ жизни, таких как хранение и передача генетической информации, структура и механизмы биосинтеза нуклеиновых кислот и белков, основные принципы и механизмы трансформации энергии в биологических системах, структура, свойства и функции биомолекул, структурная и биохимическая организация клеточных органелл и т.д. Все эти данные сегодня и послужили основой разработки инновационных технология для АПК. Дисциплина «Инновационные технологии в АПК» тесно связана с другими дисциплинами: физиологией растений, генетикой, селекцией, микробиологией, молекулярной биологией, биохимией, растениеводством и др., что связано с единством и взаимосвязью формирования урожая со всеми физиолого-биохимическими процессами, происходящими в растениях.

Наиболее значимые успехи сегодня достигнуты в развитии молекулярногенетических и молекулярно-биологических и нанобиологических подходов. Итогом этого направления работ: полная расшифровка геномов четырех видов высших растений (арабидопсиса, риса, люцерны, тополя) и выдвижение на первый план задачи завершения секвенирования геномов важнейших видов сельскохозяйственных растений (кукурузы, винограда, томатов, пшеницы, ячменя). Имеются большие достижения в области стволовых клеток у растений. Установление и познание генетических связей в растительной клетке позволяет в большой мере выявлять и наследственно закреплять количественные и качественные признаки растения, а также управлять формированием урожая и т.д.

Эти и многие другие достижения позволили применять в современной сельскохозяйственной практике серию инновационных подходов. Первый из них связан с развитием генноинженерных технологий и использованием генетически модифицированных (трансгенных) организмов (ГМО), т.е. организмов, генетический материал (ДНК) которых изменен способом, недостижимым при естественных путях внутривидовых скрещиваний. Для получения ГМО используют так называемую генную технологию, или технологию рекомбинантных молекул, или генную инженерию. Она позволяет переносить отдельные гены из любого живого организма в любой другой живой организм.

В настоящее время наиболее генная инженерия нашла широкое применение в сфере производства новых сортов сельскохозяйственных растений, обладающих признаками, отсутствующими у родительских форм. Созданы и разрешены к использованию в некоторых странах трансгенные сорта и гибриды сои, хлопчатника, кукурузы, сахарной свеклы, картофеля, рапса и

5

других культур. Трансгенные сорта и гибриды сельскохозяйственных культур отличаются высокой устойчивостью к гербицидам, опасным вредителям и болезням, засухе, что делает их незаменимыми и весьма эффективными в производстве. Главным направлением по трансгенозу растений сегодня является создание гербицидоустойчивых растений. Растения с генами устойчивости к гербицидам выращиваются на 73% площадей, растения, продуцирующие белки, устойчивые к инсектицидам (инсектицидные белки), прежде всего Bt-токсины, - на 18%. Из суммарной площади в 272 млн. га, занятых упомянутыми выше четырьмя культурами, 25% принадлежит их трансгенным формам.

В связи с быстрым и массовым производством новых сортов, легкостью и кажущейся научной предсказуемостью приобретения ими заданных свойств, а также большой экономической эффективностью метода многие ведущие ученые и лидеры государств надеются, что биоинженерия станет стратегическим направлением научно-технического прогресса и экономического развития всех стран мира. В аграрной сфере это направление предполагает повышение продуктивности и устойчивости растениеводства и сельского хозяйства в целом, решение проблемы продовольственной независимости и безопасности государств; в перерабатывающей промышленности - повышение качества и резкое снижение потерь при хранении сельскохозяйственной продукции.

Однако сегодня вопросы безопасности, существование реальных или потенциальных пищевых, экологических и агротехнических рисков при коммерческом выращивании и использовании ГМО и полученных из них продуктов питания диктуют необходимость усовершенствования существующих генно-инженерных технологий, углубления знания структуры и механизмов регуляции и функционирования генома растений, всестороннего изучения биологии генетически модифицированных растений и фундаментальных основ регуляции экспрессии генома с целью создания трансгенных растений нового поколения, безопасных для человека и окружающей среды. Пока же аксиомой должно являться положение о том, что доказательства биобезопасности ГМО и полученных из них продуктов должны опережать их коммерческое использование.

Вторым важным направлением современного растениеводства является применение регуляторов роста и развития растений. Сегодня эти приемы стали неотъемлемым элементом современных интенсивных технологий возделывания важнейших сельскохозяйственных культур.

Культивирование изолированных клеток, тканей и органов in vitro (т.е. в пробирке, в стекле на искусственных питательных средах) является еще одним из инновационных направлений, используемых в АПК. Метод открывает широкие возможности перед человечеством, позволяя получать новые важные формы и линии сельскохозяйственных растений, ускоряет и облегчает селекционный процесс, с его помощью можно проводить размножение ценных генотиов и трудноразмножаемых растений, получать ценные биологические препараты пищевого, кормового, и медицинского назначения и т.д.

6

Важные достижения получены при использовании данных смежных наук

– например, микробиологии, - симбиотические взаимоотношения растений с другими организмами, механизмы фиксации молекулярного азота атмосферы, биотехнологических процессов создания физиологически активных соединений растительного происхождения. Намечены новые подходы по генноинженерному конструированию новых симбионтов с высокой азотфиксирующей способностью и минимизацией антагонистических взаимоотношений.

Изучение минерального питания растений позволило оптимизировать минеральный состав ионообменных искусственных субстратов. Такая оптимизация позволяет растениям развиваться в замкнутом безотходном цикле, избегая загрязнения окружающей среды и т.п.

Внедрение в сельскохозяйственную практику инновационных технологий создает условия для устойчивого развития сельского хозяйства, его перевода на качественно более высокий уровень, позволяя увеличить количество и улучшить качество урожая, повысить рентабельность сельхозпроизводства. Технологии позволяют сочетать экономические интересы сельхозпроизводителей и защиту окружающей среды за счет снижения антропогенного воздействия на биосферу.

Необходимо отметить, что важны не только результаты, но и ограничения в использовании достижений биологии для развития аграрного производства на основе возобновляемых ресурсов, мобилизации новых источников для производства лекарств и продуктов питания, решения экологических проблем и улучшения благосостояния людей.

7

Тема 1

Клеточная и тканевая биотехнология

Культивирование изолированных клеток, тканей и органов in vitro (т.е. в пробирке, в стекле на искусственных питательных средах) является одним из инновационных направлений, используемых в АПК. Метод открывает широкие возможности перед человечеством. Его преимуществом является высокая экономическая эффективность, связанная с большими коэффициентами размножения (например, из одного растения земляники можно получить 1 млн. растений в год), возможностью получать оздоровленный, свободный от вирусов и других патогенов посадочный материал, проводить работы в течение всего года, экономией площадей, занимаемых под маточные растения, легкостью транспортировки пробирочных растений и их возможностью их сохранения в течение длительного времени. Этот метод служит основой для селекции и получения трансгенных организмов с новыми (заранее заданными) наследуемыми свойствами.

1. Стерилизация.

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности.

Изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными инструментами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изолированных тканей.

Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фольгу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160оС в течение 1,5 – 2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120оС и давлении 0.75 – 1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40оС.

Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация, которую проводят следующим образом. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ.

После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем растворе несколько раз промывают в дистиллированной воде и скальпелем удаляют наружные слои

8

клеток на срезах эксплантов, так как он может быть поврежден при стерилизации. Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной ткани. Наиболее часто внутреннее инфицирование встречается у тропических и субтропических растений. Поэтому кроме поверхностной стерилизации иногда приходится применять антибиотики, которые и убивают микробы внутри ткани. Следует, однако, заметить, что подобная обработка не всегда приводит к стерилизации внутренних тканей, так как трудно выбрать направленно действующий антибиотик.

2. Питательные среды.

Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины. Фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы (обычно это сахароза или глюкоза) входят в состав любой питательной смеси в концентрации 2-3%. Они необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способны к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте. Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фосфата способствует быстрому росту клеток. Истощение среды значительно снижает рост и процессы вторичного метаболизма. Однако изначально низкое содержание фосфатов в питательной среде способно стимулировать синтез вторичных метаболитов. Установлено, что культивирование каллусов солодки голой на среде с половинной концентрацией азота и фосфора в темноте увеличивает содержание фенольных соединений в 1,6 раза по сравнению с каллусами, растущими на полной среде. В среду могут быть добавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосовый орех, конский каштан и др.), пасока некоторых деревьев, различные экстракты (солодовый, дрожжевой, томатный сок). В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты или гидролизат казеина – источник аминокислот. В состав сред включают водорастворимые витамины; тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбиновую кислоту.

Обязательными компонентами питательных сред должны быть фитогормоны. К ним относятся ауксины, вызывающие дифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При изменении соотношения между этими фитогормонами или при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза.

Природный ауксин в растениях представлен в основном в виде β- индолил-3-уксусной кислоты (гетероауксином) – ИУК. Наиболее выраженный эффект ауксина проявляется в стимуляции роста. Ауксин играет важную роль в процессах регенерации при размножении каллусных клеток; в процессе образования придаточных и боковых корней, луковиц, при заложении вегетативных почек.

Для практических целей в сельском хозяйстве часто применяют не ИУК, а синтетические ауксины, так как они в растениях неразрушаются ИУКоксидазой. Молекулы синтетических ауксинов имеют разную структуру, они

9

содержат ароматическое или гетероциклическое кольцо, боковая часть которого представлена остатком алифатической кислоты. Это – индолил-3- масляная кислота (ИМК); α-нафтил-1-уксусная кислота (НУК); 2,4 - дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д); фенилуксусная кислота (ФУК); фенилмасляная (ФМК).

2,4-Д применяют для индукции каллуса у злаков, бобовых, томатов; для роста суспензионных культур; в сочетании с другими фитогормонами для формирования у протопластов клеточной стенки. ИУК, ИМК, НУК, ФУК и ФМК применяют в качестве индукторов образования корней, а в сочетании с цитокининами эти фитогормоны могут быть использованы для развития проростков при культивировании изолированных зародышей.

ИУК необходима для индуцирования каллусогенеза.

В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин, 6-бензиламинопурин, зеатин, которые представляют собой N-замещенные производные аденина. Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК и РНК и белков. Благодаря этому замедляется старение клеток и повышается их устойчивость к неблагоприятным факторам среды. Цитокинины в составе сред включают для стимуляции клеточного деления в каллусных и суспензионных культурах, в культурах протопластов, при регенерации проростков из соматических эмбриондов или стеблевых почек.

При культивировании протопластов в составе культурных сред используют и абсцизовую кислоту. Абсцизовая кислота оказывает противодействие ауксинам, гиббереллинам и цитокининам.

Гиббереллины оказывают множественные действия: стимулируют рост в фазе растяжения и деления клеток (например, камбия), вызывают рост плодов. Важное свойство гиббереллинов – вызывать вытягивание стебля у розеточных растений или у растений с укороченным стеблем, т.е. устранять физиологическую и генетическую карликовость.

Гиббереллины относят к условно половым гормонам; например, у тыквенных они способствуют образованию мужских цветков.

Для гиббереллинов доказано их непосредственное действие на биосинтез ферментов, например, α-амилазы и других гидролаз в прорастающих семенах злаков; эти ферменты расщепляют крахмал до простых сахаров, которые усваиваются развивающимся зародышем.

Гиббереллины обнаружены у сумчатого гриба (аскомицета) Gibberella fujikuroi, а также в тканях высших растений. Гиббереллины – это дитерпеноиды с тетрациклическим гиббереллановым скелетом из 19-20 С-атомов.

Для практических целей наиболее часто используют гибберелловую кислоту, которая производится в промышленности. Обработка гибберелловой кислотой семян и клубней приводит к снятию у них покоя и стимулирует быстрое прорастание. Ее действие на озимые злаки заменяет яровизацию, необходимую для таких растений.

10