Основы клеточной инженерии растений. Практикум

Затем стерилизуют в 2,5–5 % раствор гипохлорита натрия — листья в течение 5–10 мин, а побеги в течении 10–20 мин с последующей 7-ми кратной промывкой в стерильной дистиллированной воде.

3.Для образования каллуса, стерильные побеги и листочки травмируют.

4.Подготовленные стерильные экспланты помещают в стерильную посуду со средой МS, содержащей ИУК 1 мг/л и кинетина 1 мг/л. Все мероприятия проводят в ламинар-боксе.

5.Условия выращивания: получение каллусов проводят в климатической камере; освещенностью 2500–6000 лк; при температуре 24–26°С, влажности

60–70 %.

8.Результаты оформить в виде таблицы.

9. Сделать соответствующие выводы.

Требования к отчету по лабораторной работе. Лабораторные записи нужно вести аккуратно, с описанием всех этапов, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Записывают тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Лабораторная работа № 7. Получение морфогенеза из побегов и листьев традесканции в условиях in vitro

Цель работы. Освоить методы стерилизации и посадки растительных эксплантов традесканции на питательную среду, получить морфогенез растений.

31

Материалы и оборудование: побеги и листья традесканции, растворы макро- и микроэлементов, витаминов для среды Мурасиге — Скуга, ИУК, кинетин, 70 % раствор этилового спирта, мыло, раствор «Доместоса», стерильная дистиллированная вода, ламинар, климатическая камера, пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, чашки Петри, пробирки, стаканы, пищевая пленка, вата, фольга.

Порядок работы:

1.Фрагменты побегов и листьев традесканции вымыть в мыльном растворе с добавлением моющих средств капли «Сорти», промыть в проточной воде.

2.Стерилизацию фрагментов побегов и листьев традесканции проводят в 70 % растворе этанола в течение 1–2 мин, затем помещают в раствор «Доместоса» в разведении 1 : 2 листья на 5–10 мин, а побеги на 10–20 мин., с последующей 5-ти кратной промывкой стерильной водой.

3.Для образования каллуса, стерильные побеги и листочки травмируют.

4.Подготовленные стерильные экспланты переносят в стерильную посуду со средой МS, содержащей ИУК 2 мг/л и кинетина 1 мг/л. Все мероприятия проводят в ламинар-боксе.

5.Условия выращивания: получение каллусов проводят в климатической камере; освещенностью 2500–6000 лк, при температуре 24–26°С, влажности

60–70 %.

6.Результаты эксперимента оценить по следующим показателям: интенсивность (частота) каллусообразования, т.е. подсчитать количество полученных каллусов.

7.Определить прирост сырой биомассы каллусной ткани. Для чего через 10 дней от начала пассирования, каллусы взвесить на торсионных весах. Прирост каллусной ткани вычислить по формуле:

W1 – W0 / W0,

где W1 — конечный вес каллуса, W0 — начальный вес каллуса.

8. Результаты оформить в виде таблицы.

32

9. Сделать соответствующие выводы.

Требования к отчету по лабораторной работе. Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Лабораторная работа № 8. Получение каллусной культуры хризантемы in vitro в лабораторных условиях

Цель работы. Освоить методы стерилизации и посадки растительных эксплантов хризантемы на питательную среду, получить каллусные ткани и определить эффективность процесса для этих типов эксплантов.

Материалы и оборудование: лепестки, побеги и листья хризантемы, растворы макро- и микроэлементов, витаминов для среды Мурасиге — Скуга, ИУК, кинетин, 70 % раствор этанола, 0,1 % раствор йода, стерильная дистиллированная вода, мыло, ламинар, климатическая камера, пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, чашки Петри, пробирки, стаканы, пищевая пленка, вата, фольга.

Порядок работы:

1.Фрагменты лепестков, побегов и листья хризантемы вымыть в мыльном растворе с добавлением моющего средства «Фери», промыть в проточной воде.

2.Фрагменты лепестков, побегов и листьев хризантемы стерилизуют вначале в 70 % растворе этанола в течение 1–2 мин, затем промывают стерильной дистиллированной водой. Затем помещают в 0,1 % раствор йода лепестки и ли-

33

стья на 2–3 мин, а побеги на 20–25 мин и промывают 5-ти кратно в стерильной дистиллированной воде.

3.Для образования каллуса, стерильные лепестки, побеги и листочки травмируют.

4.Подготовленные стерильные экспланты, помещают в стерильную посуду со средой МS, содержащей ИУК 1 мг/л и кинетина 1 мг/л. Все мероприятия проводят в ламинар-боксе.

5.Условия выращивания: получение каллусов проводят в климатической камере; освещенностью 2500–6000 лк, при температуре 24–26°С, влажности

60–70 %.

6.Результаты эксперимента оценить по следующим показателям: интенсивность (частота) каллусообразования, т.е. подсчитать количество полученных каллусов.

7.Определить прирост сырой биомассы каллусной ткани. Для чего через 10 дней от начала пассирования, каллусы взвесить на торсионных весах. Прирост каллусной ткани вычислить по формуле:

W1 – W0 / W0,

где W1 — конечный вес каллуса, W0 — начальный вес каллуса.

8. Результаты оформить в виде таблицы.

9. Сделать соответствующие выводы.

Требования к отчету по лабораторной работе. Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

34

Лабораторная работа № 9. Получение каллусной культуры эхинацеи in vitro в лабораторных условиях

Цель работы. Освоить методы стерилизации и посадки растительных эксплантов эхинацеи на питательную среду, получить каллусные ткани и определить эффективность процесса для этих типов эксплантов.

Материалы и оборудование: побеги и листья эхинацеи, растворы макро- и микроэлементов, витаминов для среды Мурасиге — Скуга, ИУК, кинетин, 70 % раствор этанола, 0,1 % раствор йода, мыло, 5 % раствор гипохлорита натрия, стерильная дистиллированная вода, ламинар, климатическая камера, пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, чашки Петри, пробирки, стаканы, пищевая пленка, вата, фольга.

Порядок работы:

1.Фрагменты побегов и листья эхинацеи вымыть в мыльном растворе с добавлением моющего средства «Фери», промыть в проточной воде.

2.Фрагменты побегов и листьев эхинацеи стерилизуют вначале в 70 % растворе этанола в течение 1–2 мин, затем промывают стерильной дистиллированной водой. Затем помещают в 0,1 % раствор йода листья на 2–3 мин, а побеги на 15–20 мин и промывают 5-ти кратно в стерильной дистиллированной воде. Затем стерилизуют в 5 % растворе гипохлорита натрия листья 4–5 минут, а побеги 20–25 минут и промывают 5-ти кратно в стерильной дистиллированной.

3.Для того чтобы вызвать каллусогенез, стерильные побеги и листочки травмируют.

4.Подготовленные стерильные экспланты, помещают в стерильную посуду со средой МS, содержащей ИУК 1 мг/л и кинетина 1 мг/л. Все мероприятия проводят в ламинар-боксе.

5.Условия выращивания: получение каллусов проводят в климатической камере; освещенностью 2500–6000 лк, при температуре 24–26°С, влажности

60–70 %.

6.Результаты эксперимента оценить по следующим показателям: интенсивность (частота) каллусообразования, т.е. подсчитать количество полученных каллусов.

7.Определить прирост сырой биомассы каллусной ткани. Для чего через 10 дней от начала пассирования, каллусы взвесить на торсионных весах. Прирост каллусной ткани вычислить по формуле:

35

W1 – W0 / W0,

где W1 — конечный вес каллуса, W0 — начальный вес каллуса.

8. Результаты оформить в виде таблицы.

9. Сделать соответствующие выводы.

Требования к отчету по лабораторной работе. Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Лабораторная работа № 10. Получение каллусной культуры ромашки in vitro в лабораторных условиях

Цель работы. Освоить методы стерилизации и посадки растительных эксплантов ромашки на питательную среду, получить каллусные ткани и определить эффективность процесса для этих типов эксплантов.

Материалы и оборудование: лепестки и листья ромашки, растворы макро- и микроэлементов, витаминов для среды Мурасиге — Скуга, ИУК, кинетин, 70 % раствор этанола, 10 % раствор перекиси водорода, мыло, стерильная дистиллированная вода, ламинар, климатическая камера, пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, чашки Петри, пробирки, стаканы, пищевая пленка, вата, фольга.

36

Порядок работы:

1.Фрагменты лепестков и листьев ромашки вымыть в мыльном растворе

сдобавлением моющего средства «Фери», промыть в проточной воде.

2.Фрагменты лепестков и листьев ромашки стерилизуют вначале в 70 % растворе этанола в течение 30 с — 2 мин, затем промывают стерильной дистиллированной водой. Затем помещают в 10 % раствор перекиси водорода лепестки и листья на 3–7 мин и промывают 3-х кратно в стерильной дистиллированной воде.

3.Для того чтобы вызвать каллусогенез, стерильные лепестки и листочки травмируют.

4.Подготовленные стерильные экспланты, помещают в стерильную посуду со средой МS, содержащей ИУК 1 мг/л и кинетина 1 мг/л. Все мероприятия проводят ламинар-боксе.

5.Условия выращивания: получение каллусов проводят в климатической камере; освещенностью 2500–6000 лк, при температуре 24–26°С, влажности

60–70 %.

6.Результаты эксперимента оценить по следующим показателям: интенсивность (частота) каллусообразования, т.е. подсчитать количество полученных каллусов.

7.Определить прирост сырой биомассы каллусной ткани. Для чего через 10 дней от начала пассирования, каллусы взвесить на торсионных весах. Прирост каллусной ткани вычислить по формуле:

W1 – W0 / W0,

где W1 — конечный вес каллуса, W0 — начальный вес каллуса.

8. Результаты оформить в виде таблицы.

9. Сделать соответствующие выводы.

37

Требования к отчету по лабораторной работе. Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Лабораторная работа № 11. Получение каллусной ткани из корнеплода моркови в условиях in vitro

Цель работы. Получение каллусной ткани из паренхимной ткани корнеплода моркови в условиях in vitro.

Материалы и оборудование: корнеплоды моркови, растворы макро- и микроэлементов, витаминов для среды Мурасиге — Скуга, ИУК, кинетин, этиловый спирт, мыло, гипохлорит натрия, стерильная дистиллированная вода, ламинар, термостат, пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, чашки Петри, пробирки, стаканы, пищевая пленка, вата, фольга.

Порядок работы:

1.Корнеплод моркови тщательно вымыть в мыльной воде, затем промыть

впроточной (водопроводной) воде.

2.Погрузить на 15–20 мин в 5 % раствор гипохлорита натрия. После отмыть в 5-ти порциях стерильной дистиллированной воды по 5 мин в каждой.

3.Под ламинаром отделить среднюю часть корнеплода, разрезать на диски толщиной 5–7 мм, каждый из которых разделить на 10 сегментов и из каждого сегмента вычленить сердцевинную паренхиму.

4.Полученные сегменты перенести в пробирки, содержащие питательную среды МС содержащую ИУК 1 мг/л и кинетина 1 мг/л.

5.Пробирки с эксплантами поместить в термостата и культивировать в темноте при температуре 25–27°С.

6.Результаты эксперимента оценить по следующим показателям: интенсивность (частота) каллусообразования, т.е. подсчитать количество полученных каллусов.

38

7. Определить прирост сырой биомассы каллусной ткани. Для чего через 10 дней от начала пассирования, каллусы взвесить на торсионных весах. Прирост каллусной ткани вычислить по формуле:

W1 – W0 / W0,

где W1 — конечный вес каллуса, W0 — начальный вес каллуса.

8. Результаты оформить в виде таблицы.

9. Сделать соответствующие выводы.

Требования к отчету по лабораторной работе. Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Лабораторная работа № 12. Получение и культивирование каллуса из стебля картофеля

Цель работы. Получение каллусной ткани из стебля картофеля в услови-

ях in vitro.

Материалы и оборудование: нестерильные проростки клубней картофеля, этанол, 5 % раствор гипохлорита натрия, стерильная дистиллированная вода, скальпель, пинцет, спиртовка, кафельная плитка, стаканчик, подставки для инструмента, кисточка, стерильная чашка Петри, спички, чашки Петри или колбы со средой МС (с добавлением гормонов ИУК 1 мг/л и кинетина 1 мг/л).

39

Порядок работы:

1.Нестерильные проростки картофеля тщательно вымыть в мыльной воде, затем промыть в проточной (водопроводной) воде.

2.Погрузить на 15–20 мин в 5 % раствор гипохлорита натрия. После отмыть в 5-ти порциях стерильной дистиллированной воды по 5 мин в каждой.

3.Стерильным скальпелем вырезать скальпелем участки стебля длиной 5–10 мм, не захватывая междоузлия.

4.Обжечь инструменты, перенести вырезанный участок на плитку, надсечь экспланты в нескольких местах для появления в дальнейшем раневого каллуса.

5.Поместить их в колбу или чашку Петри со стерильной средой, чуть вдавливая их пинцетом, для усиления контакта со средой. В одну чашку Петри помещают 5–10 эксплантов. Закрыть колбу или чашку Петри. Чашки Петри заклеить парафилмом или пищевой пленкой.

6.Поместить в термостат без освещения и выдержать 3 недели при температуре 22–25оС.

7.Результаты эксперимента оценить по следующим показателям: интенсивность (частота) каллусообразования, т.е. подсчитать количество полученных каллусов.

8.Определить прирост сырой биомассы каллусной ткани. Для чего через 10 дней от начала пассирования, каллусы взвесить на торсионных весах. Прирост каллусной ткани вычислить по формуле:

W1 – W0 / W0,

где W1 — конечный вес каллуса, W0 — начальный вес каллуса.

9. Результаты оформить в виде таблицы.

10. Сделать соответствующие выводы.

40