Основы клеточной инженерии растений. Практикум

По функциональному действию различают 5 основных групп фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. Ауксины в культуре тканей вызывают рост клеток растяжением, в больших концентрациях деление клеток, в сочетании с цитокининами органогенез. В биотехнологии применяют как природные ауксины (ИУК), так и синтетические ИПК, 2,4-Д, НУК.

Цитокинины в сочетании с ауксинами индуцируют митозы, пролиферацию клеток, почек и побегов. К природным цитокининам относятся зеатин, кинетин (кокосовое молоко); к синтетическим — 6-БАП.

Гиббереллины стимулируют рост клеток растяжением, а также синтез ауксинов и цитокининов. Сейчас известно около 60 видов гиббереллинов. В культуре ткани используется гибберелловая кислота.

Абсцизины (АБК) и этилен ингибируют ростовые процессы, деление клеток, в сочетании с цитокининами индуцируют органогенез (образование микроклубней).

Гормональная система тесно связана с генетическим аппаратом клетки. Изменяя соотношение гормонов в питательных средах, можно в какой-то степени изменять и генетические программы клеток и тканей. В культуре ткани фитогормоны, добавленные в различных пропорциях, регулируют синтез эндогенных гормонов растений, что проявляется в разнообразных морфогенетических реакциях клеток и тканей.

В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции в культуре клеток и тканей, которая сейчас известна, как правило Скуга — Миллера: если концентрация ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни; если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов, то образуются почки, побеги.

21

ГЛАВА 3.

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ ПО ДИСЦИПЛИНЕ «КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ»

Лабораторная работа № 1. Организация и оборудование биотехнологической лаборатории, правила работы в ней

Цель работы. Изучить правила работы в биотехнологической лаборатории, провести стерилизацию помещений, посуды, инструментов.

Материалы и оборудование: пробирки диаметром 15–25 мм, пипетки стеклянные объемом 1–25мл, мерные цилиндры объемом 25–1000 мл, мерные стаканы на 50–1000 мл, химические стаканы, автоматические пипетки, весы аналитические, электроплитка, водяная баня, магнитная мешалка, фарфоровые стаканы объемом 200–500 мл, конические колбы на 250–500 мл, чашки Петри диаметром 40–90 мм, предметные стекла, скальпель, пинцет, тонкая фольга, пергаментная бумага, соли, фитогормоны, витамины, этиловый спирт, 1 н раствор NaOH или KOH, автоклав, сушильный шкаф, моющие средства, стиральный порошок, горчичный порошок.

Порядок работы:

1.Ознакомиться с устройством биотехнологической лаборатории.

2.Под руководством преподавателя освоить принципы работы автоклава, сушильного шкафа, дистиллятора и другого вспомогательного оборудования.

3.Посуду замочить в 1 % растворе гипохлорита натрия, тщательно отмыть в растворах детергентов (стиральный порошок), промыть 8–10 раз проточной водой, поместить на 4-6 часов в хромпик (смесь серной кислоты с бихроматом калия) или 5 % раствор горчичного порошка на 30 минут, промыть теплой водой, затем дважды дистиллированной.

4.Чистую посуду поместить в сушильный шкаф на 2 часа (после установления температуры) при температуре 175°С.

5.Металлические инструменты завернуть в плотную бумагу и поместить

всушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при температуре 200°С в течение 2 часов.

6.Сухую посуду, инструменты обернуть бумагой или целлофаном и хранить в стеклянных шкафах или в выдвижных полках лабораторных столов.

22

Требования к отчету по лабораторной работе. Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Лабораторная работа № 2. Приготовление маточных растворов для питательных сред на примере Мурасиге — Скуга

Цель работы. Приготовить маточные растворы для питательной среды Мурасиге — Скуга.

Материалы и оборудование: пробирки диаметром 15–25 мм, пипетки стеклянные объемом 1–25 мл, мерные цилиндры объемом 25–1000 мл, мерные стаканы на 50–1000 мл, химические стаканы, автоматические пипетки, весы аналитические, электроплитка, водяная баня, магнитная мешалка, фарфоровые стаканы объемом 200–500 мл, конические колбы на 250–500 мл, чашки Петри диаметром 40–90 мм, предметные стекла, скальпель, пинцет, тонкая фольга, пергаментная бумага, соли, фитогормоны, витамины, этиловый спирт, 1 н раствор NaOH или KOH, автоклав, сушильный шкаф.

Порядок работы:

1.Приготовить маточный раствор микроэлементов согласно прописи (табл. 2). Для этого взять 10-ти кратную навеску каждой соли, растворить при слабом нагревании в небольшом объеме дистиллированной воды, охладить до комнатной температуры, слить растворы в мерный цилиндр и довести водой до 200 мл. Раствор хлористого кальция (CaCl2) готовить и хранить отдельно. На 1 л среды брать 20 мл маточного раствора.

2.Приготовить маточный раствор микроэлементов согласно прописи. Для этого взять 100-кратную навеску каждой соли, растворить при слабом нагревании в небольшом объеме дистиллированной воды, охладить до комнатной температуры, слить растворы в мерный цилиндр и довести дистиллированной водой до 200 мл. На 1 л среды брать 2 мл маточного раствора.

3.Приготовить маточный раствор хелата железа. Приготовление 20-ти кратного концентрата хелата железа (Fe-хелата) 557 мг FeSO 7H O и 745 мг

23

NaЭДТА 2H O растворяют по отдельности при нагревании (не доводя до кипения) в 30–40 мл дистиллированной воды. Затем растворы объединяют и доводят до общего объема — 100 мл. На 1 л литр среды брать 5 мл раствора.

4.Приготовить концентрированные растворы ауксинов. Для этого 100 мг вещества (ИУК, 2,4-Д, НУК) растворить в 1,2 мл этилового спирта (каждый в отдельности), подогреть, довести дистиллированной водой до 100 мл. 1 мл раствора будет содержать 1 мг вещества.

5.Приготовить концентрированные растворы цитокининов. Для этого 100 мг вещества (кинетин, зеатин, БАП) растворить в небольшом объеме 0,5–1 н раствора NaOH (KOH) при слабом нагревании, довести дистиллированной водой до 100 мл. 1 мл раствора будет содержать 1 мг вещества.

6.Приготовить маточные растворы витаминов. Для этого ампулу (аптечную) содержащую (1 или 5 %) раствора витамина довести до 100 мл дистиллированной водой. 1 мл раствора будет содержать соответственно 0,1 или 0,5 мг витамина.

7.На сосудах с маточными растворами обязательно указать название среды, концентрацию раствора. Дату приготовления и помесить в холодильник. Хранить при температуре 4–7°С в течение месяца.

Требования к отчету по лабораторной работе. Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые

влабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Таблица 1

Среда Мурасиге — Скуга, рН 5,6–5,8

24

Таблица 2

Состав маточных растворов по Мурасиге — Скугу

Компоненты питательной среды

25

Лабораторная работа № 3. Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге — Скуга

Цель работы. Приготовить питательную среду Мурасиге — Скуга для культивирования изолированных клеток и тканей.

Материалы и оборудование: маточные растворы макро- и микроэлементов, витаминов, фитогормонов, глицин, мезоинозит, сахароза, очищенный агарагар, колбы или стаканы химические на 50–1000 мл, банки с притертыми пробками для хранения маточных растворов на 1 л и 100 мл, баночки на 20–50 мл, мерные пипетки на 1–25 мл, пробирки, магнитная мешалка, водяная баня, автоклав, весы аналитические, электроплитка.

Порядок работы:

1.Подготовить маточные растворы макро- и микроэлементов, витаминов, регуляторов роста.

2.Для приготовления 1л среды в стакан объемом 1 л, пипеткой перенести необходимый объем каждого из исходных растворов.

3.Растворить в небольших объемах дистиллированной воды (каждый в отдельности) мезо-инозит, глицин, сахарозу и полученные растворы внести в стакан с маточными растворами.

4.Полученную жидкую питательную среду из стакана слить в мерный цилиндр и дистиллированной водой довести до объема 950 мл.

5.Довести рН среды до требуемого значения. Если рН выше нужного значения добавить несколько капель 1 н HCl, если ниже этого значения — добавить несколько капель 1 н NaOH (KOH) в мерный цилиндр, тщательно перемешать. Отлить небольшой объем среды в стакан, измерить рН. Измерения рН среды проводить до установления требуемой величины.

6.Навеску очищенного агар-агара (6–7 г) поместить в стакан со средой, растворить, нагревая на плите (не доводя до кипения), при постоянном помешивании.

7.Питательную среду нагреть до 50–60°С, объединить с горячим раствором агара. Порошкообразный агар можно внести в среду непосредственно.

8.Довести объем среды до метки 1 л подогретой дистиллированной водой

итщательно перемешать.

26

9.Готовую питательную среду разлить в пробирки на ¼ объема, закрыть пробирки колпачками из ваты или фольгой, поместить пробирки в металлические штативы.

10.Поместить штативы в автоклав и автоклавировать в течение 20 мин при давлении 1–1,2 атм.

11.Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи.

Требования к отчету по лабораторной работе. Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые

влабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Лабораторная работа № 4. Получение каллусной культуры каланхоэ в лабораторных условиях in vitro

Цель работы. Освоить методы стерилизации и посадки растительных эксплантов каланхоэ на питательную среду, получить каллусные ткани и определить эффективность процесса для этих типов эксплантов.

Материалы и оборудование: побеги и листья каланхоэ, растворы макро- и микроэлементов, витаминов для среды Мурасиге — Скуга, ИУК, кинетин, 70 % раствор этилового спирта, мыло, 10 % раствор перекиси водорода, стерильная дистиллированная вода, ламинар, климатическая камера, пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, чашки Петри, пробирки, стаканы, пищевая пленка, вата, фольга.

Порядок работы:

1.Фрагменты побегов и листьев каланхоэ вымыть в мыльном растворе с добавлением моющих средств капли «Сорти», промыть в проточной воде.

2.Фрагменты побегов и листьев каланхоэ стерилизуют сначала в 70 % растворе этанола в течение 1–2 мин, затем промывают стерильной дистиллированной водой. Затем помещают в 10 % раствор перекиси водорода листья на 5–7 мин, а побеги на 10–15 мин и промывают 3-х кратно в стерильной дистиллированной воде.

27

3.Для образования каллуса, стерильные побеги и листочки травмируют.

4.Подготовленные стерильные экспланты, помещают в стерильную посуду со средой МS, содержащей ИУК 1 мг/л и кинетина 1 мг/л. Все мероприятия проводят в ламинар-боксе.

5.Условия выращивания: получение каллусов проводят в климатической камере; освещенностью 2500–6000 лк, при температуре 24–26°С, влажности

60–70 %.

6.Результаты эксперимента оценить по следующим показателям: интенсивность (частота) каллусообразования, т.е. подсчитать количество полученных каллусов.

7.Определить прирост сырой биомассы каллусной ткани. Для чего через 10 дней от начала пассирования, каллусы взвесить на торсионных весах. Прирост каллусной ткани вычислить по формуле:

W1 – W0 / W0,

где W1 — конечный вес каллуса, W0 — начальный вес каллуса.

8. Результаты оформить в виде таблицы.

9. Сделать соответствующие выводы.

Требования к отчету по лабораторной работе. Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

28

Лабораторная работа № 5. Получение каллусной культуры очитка в условиях in vitro

Цель работы. Освоить методы стерилизации и посадки растительных эксплантов очитка на питательную среду, получить каллусные ткани и определить эффективность процесса для этих типов эксплантов.

Материалы и оборудование: листья очитка, растворы макро- и микроэлементов, витаминов для среды Мурасига и Скуга, ИУК, кинетин, этиловый спирт, мыло, 5 % раствор гипохлорита натрия, стерильная дистиллированная вода, ламинар, климатическая камера, пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, чашки Петри, пробирки, стаканы, пищевая пленка, вата, фольга.

Порядок работы:

1.Фрагменты листьев очитка вымыть в мыльном растворе с добавлением моющих средств капли «Сорти», промыть в проточной воде.

2.Листья очитка стерилизуют в 5 %-ном растворе гипохлорита натрия в течение 5-7 мин и промывают 5 раз стерильной воде.

3.Для образования каллуса, стерильные листочки травмируют.

4.Подготовленные стерильные листочки переносят в стерильную посуду со средой МS, содержащей ИУК 1 мг/л и кинетина 1 мг/л. Все мероприятия проводят в ламинар-боксе.

5.Условия выращивания: получение каллусов проводят в климатической камере; при температуре 24–26°С, освещенности 2500–6000 лк, влажности воз-

духа 60–70 %.

6.Результаты эксперимента оценить по следующим показателям: интенсивность (частота) каллусообразования, т.е. подсчитать количество полученных каллусов.

7.Определить прирост сырой биомассы каллусной ткани. Для чего через 10 дней от начала пассирования, каллусы взвесить на торсионных весах. Прирост каллусной ткани вычислить по формуле:

W1 – W0 / W0,

где W1 — конечный вес каллуса, W0 — начальный вес каллуса.

29

8. Результаты оформить в виде таблицы.

9. Сделать соответствующие выводы.

Требования к отчету по лабораторной работе. Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Лабораторная работа № 6. Введение в культуру in vitro некоторых сортов миниатюрной розы

Цель работы. Освоить методы стерилизации и посадки растительных эксплантов миниатюрной розы на питательную среду, получить каллусные ткани и определить эффективность процесса для этих типов эксплантов.

Материалы и оборудование: побеги и листья розы, растворы макро- и микроэлементов, витаминов для среды Мурасиге — Скуга, ИУК, кинетин, 70 % раствор этилового спирта, мыло, 2,5 % раствор гипохлорита натрия, стерильная дистиллированная вода, ламинар, климатическая камера, пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, чашки Петри, пробирки, стаканы, пищевая пленка, вата, фольга.

Порядок работы:

1.Сегменты побегов и листья розы, вымыть в мыльном растворе с добавлением моющих средств капли «Сорти» и промыть в проточной воде.

2.Растительный материал розы стерилизуют вначале в растворе 70 % этанола в течение 1–2 мин и промывают стерильной дистиллированной водой.

30