Иммунологические методы анализа белковых молекул

УДК 577.3: 612.017. ББК Е074я73-1

И 537

Авторы:

Н. В. Тикунова, Я. А. Хлусевич, А.В. Чечушков, Л. А. Емельянова, С. В. Нетесов

Рецензент А. Л. Матвеев

И573 Иммунологические методы анализа белковых молекул. 2-е изд., перераб. / Н. В. Тикунова, Я. А. Хлусевич, А.В. Чечушков и др.; Новосиб. гос. ун-т. — Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2023. — 40 с.

ISBN 978-5-4437-1570-4

Издание включает в себя часть практикума по молекулярной иммунологии. Содержит теоретическую часть, в которой излагаются некоторые аспекты молекулярной иммунологии, а также лабораторные работы, направленные на овладение основными методами выявления антител с помощью иммуноферментного анализа, исследования их свойств и определения видовой принадлежности.

Издание предназначено для магистрантов 1–2-го курсов обучения и аспирантов факультета естественных наук НГУ.

УДК 577.3: 612.017.

ББК Е074я73-1

Рекомендовано к печати кафедрой молекулярной биологии и биотехнологии ФЕН НГУ (протокол от 18.04.2023 г.)

Издание подготовлено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 22-74-10103) и Госзадания

НГУ № FSUS-2022-0021.

3

Введение

Иммуноглобулины (антитела) представляют собой группу особых гликопротеинов с определенной биохимической структурой, основная функция которых – распознавать антигены и связываться с ними. Эти белки содержатся в плазме крови и тканевой жидкости у большинства позвоночных. Иммуноглобулины продуцируются в виде рецепторов на поверхности В-лимфоцитов, а также в виде растворимых молекул, которые секретируются плазматическими клетками в ответ на попадание в организм антигена [Мейл и др., 2007].

Биологическая функция антител заключается в распознавании и связывании антигена и его нейтрализации, опсонизации или активации системы комплемента. При анализе структуры и функции иммуноглобулинов различают два понятия: вариабельность и гетерогенность. Вариабельность – это индивидуальная характеристика иммуноглобулинов, относящихся к одному и тому же подклассу. Она проявляется в специфической антигенсвязывающей активности и обусловлена меняющейся от белка к белку последовательностью аминокислотных остатков N-концевой части молекулы. Гетерогенность определяет свойства иммуноглобулинов, обусловленные константной (С) частью молекулы. Гетерогенность подразумевает также различия в функциональной активности разных классов иммуноглобулинов за исключением их свойства специфического взаимодействия с антигеном. У млекопитающих известно пять классов антител: IgM, IgG, IgA, IgE и IgD, которые имеют сходное строение, но отличаются по размерам молекул, заряду, аминокислотному составу и содержанию углеводов.

Типичная молекула IgG содержит две идентичные тяжелые (H) цепи и две идентичные легкие (L) цепи, удерживаемые вместе дисульфидными связями (рис. 1) [Мейл и др., 2007]. N-концевые участки Н- и L-цепей (соответственно, VH и VL) содержат примерно по 110‒115 аминокислотных остатков и являются весьма вариабельными, поскольку от них и зависит специфичность иммуноглобулинов как антител. С-концевые участки L- цепей (~110 аминокислот) и H-цепей (~ 330 аминокислот) называются константными областями. Они относительно консервативны и подразделяются на гомологичные участки: CH1, CH2, CH3, CL. Между CH1 и CH2 расположена так называемая шарнирная область, обогащенная пролиновыми остатками, которые обеспечивают конформационную гибкость молекулы. При помощи рентгеноструктурного анализа было показано, что H- и L-цепи иммуноглобулинов имеют доменное строение, и каждый домен представлен двумя антипараллельными β-слоями, перемежающимися и упорядоченными α-спиралями. Эта структура стабилизирована одной или несколькими дисульфидными связями и образует глобулу, формирующую отдельный домен [Мейл и др., 2007].

4

Рис. 1. Общая схема строения молекулы Ig (по: [Reading et al., 2007]. Молекула построена из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых (Н) и двух легких (L), объединенных в единую структуру дисульфидными связями. Каждая цепь содержит вариабельную (VH и VL для тяжелой и легкой цепей) и константную (СH1, СH2 и СH3 для тяжелой и СL для легкой цепей) области

В пределах вариабельных доменов легких и тяжелых цепей три участка являются наиболее вариабельными ‒ их называют гипервариабельными участками (CDR, от англ. complementarity determining regions). Именно аминокислотные последовательности гипервариабельных участков вступают в физическое комплементарное связывание с антигеном. Между CDR-участками расположены относительно консервативные районы, которые принято называть каркасными или FR-участками (FR, от англ. framework regions). Всего таких областей четыре [Льюин, 1987; Мейл и др.,

2007; Галактионов, 2000; Хаитов, 2018; Goldsby et al., 2003].

Конформационная особенность V-доменов состоит в том, что все CDR- участки в результате формирования третичной структуры белка оказываются в непосредственной близости друг от друга со стороны «внешнего» N-конца, а FR-участками VH-домена взаимодействуют с соответствующими

5

участками VL-домена. Таким образом, CDR-участки образуют полость – место взаимодействия с антигеном.

Константные области бывают нескольких типов и определяют класс и эффекторные функции соответствующих антител. Известны два типа легких цепей – каппа (κ) и лямбда (λ) и пять изотипов СH: μ, γ, ά, ε, δ, которым соответствуют пять классов иммуноглобулинов –- IgM, IgG, IgA, IgE, IgD [Мейл и др., 2007].

Общее описание методологии

Основанная на строении и свойствах иммуноглобулинов методология включает определение свойств антител и пример их применения в научном исследовании:

1) определение видовой принадлежности антитела (человеческое или мышиное);

2)определение антигена для конкретного антитела;

3)определение константы связывания антитела методом иммуноферментного анализа;

4)определение содержания регуляторных Т-лимфоцитов в клетках крови лабораторной мыши методом проточной цитометрии с использованием флуоресцентно-меченных моноклональных антител.

6

Лабораторная работа № 1. Определение белка-мишени для антител методом дот-блот-анализа

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)

Иммуноферментный анализ (ИФА) — высокочувствительный и вы-

сокоспецифичный метод лабораторного исследования, основанный на специфическом связывании антигенов и антител с последующим выявлением комплексов антиген-антитело ферментной меткой. Высокая специфичность антител и каталитическая активность ферментов позволяют определять антиген в диапазоне концентраций от 10–1 до 10–12 г/мл (нижний предел 0,1 – 1 фемтомолей). ИФА имеет большую информативность как при диагностике маркеров вирусных, бактериальных, грибковых, паразитарных инфекций, так и при определении иммуноглобулинов, гормонов, структурных и транспортных белков, гликопротеинов и других высокомолекулярных биологических соединений [Анцилевич и др., 2014; Таракано-

ва и др., 2019].

Вклинической диагностике ИФА используется либо для обнаружения антител в сыворотке крови обследуемого, либо для выявления антигенов возбудителя. С учетом динамики синтеза отдельных классов иммуноглобулинов в ходе иммунного ответа, наличие антител класса IgM свидетельствует о первичной острой инфекции, тогда как обнаружение только IgG маркирует давний процесс, наличие иммунологической памяти без активного заболевания и поствакцинальных антител [Самойленков, 2009; Дол-

гов и др., 2007].

Воснове большинства модификаций метода ИФА лежит сорбция растворимых антигенов или антител на твердую фазу с сохранением их иммунологической активности и выявление образовавшихся иммунных комплексов с помощью фермента, конъюгированного с вторичным антителом. Конъюгат фермент-антитело в данном случае служит маркером иммунной реакции и позволяет наблюдать ее визуально или инструментально. Сорбцию можно провести путем ковалентного связывания антител (антигенов)

сактивированным носителем, используя химические подходы, или прибегнуть к методу физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров [Тараканова и др., 2019].

Наиболее часто употребляемыми вариантами твердофазного ИФА для определения антител и антигенов являются непрямой метод и метод ингибирования – для выявления антител, а также метод «двойных» антител (сэндвич) для выявления антигенов (рис. 2). Данный вариант ИФА проводят с использованием антивидовых антител как компонентов конъюгатов. Наиболее распространенными антивидовыми конъюгатами являются ме-

7

ченые ферментом антитела кролика, иммунизированного глобулинами других видов млекопитающих (например, мыши), меченые антитела осла, иммунизированного иммуноглобулинами кролика, и т. д [Тараканова и др., 2019, Бурместер и др. 2019]. После отмывки не связавшегося с твердой фазой конъюгата на последней стадии для проявления добавляют раствор бесцветного вещества — хромогена, который приобретает окраску после расщепления его присутствующим в ячейке ферментом. Если все элементы цепочки присутствуют, в лунке образуется окрашенный комплекс. Произошедшая цветная реакция пропорциональна предшествующей иммунологической, что позволяет выявить и даже количественно измерить в исследуемом биологическом материале искомый антиген или антитело.

Рис. 2. Наиболее часто употребляемые варианты твердофазного ИФА

Дот-ИФА

Существуют различные модификации ИФА, но есть наиболее простой и доступный вариант ‒ дот-ИФА (точечный твердофазный иммуноферментный анализ). В дот-ИФА минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку (мембрану, обладающую в 80‒120 раз большей сорбционной удельной емкостью, чем полистирол, поливинилхлорид и т. д., используемые в других твердофазных вариантах иммунотестов) в виде серии точек, что позволяет выполнить гораздо большее число анализов с тем же количеством реагентов. Кроме того, для проведения дот-ИФА можно обойтись без электрооборудования, что особенно практично и удобно при проведении массовых серологических исследований в полевых условиях. Субстраты, дающие нерастворимые продукты ферментативной реакции, на белом нитроцеллюлозном фильтре образуют легкоразличимые цветные пятна, в результате чего отпадает нужда в дорогих фотометрах. Белый цвет подложки вокруг пятен помогает контролировать реакции неспецифического связывания (или неспецифической адсорбции). Фильтры с результатами анализа можно хра-

8

нить в темном помещении в течение многих лет без потери интенсивности окраски. Однако этот вариант позволяет получить только качественный результат: «ДА» или «НЕТ» [Pappas, 1988; Написанова и др., 2015].

Цель работы – провести определение белка-мишени для антитела.

Оборудование и материалы

1.Термошейкер для иммунологических планшетов, ELMI SkyLine.

2.Микроцентрифуга «MiniSpin» для микропробирок типа Эппендорф («Eppendorf», Германия).

3.Весы технические 0,1–200 г.

4.Вортекс Elmi V-3.

5.Автоматические дозаторы переменного объема (от 0,5 до 10 мкл, от 5 до 20 мкл, от 20 до 200 мкл, от 200 до 1000 мкл).

6.Одноразовые наконечники с фильтром для дозаторов переменного объема до 10 мкл, до 20 мкл, до 200 мкл, до 1000 мкл.

7.Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до

200 мкл.

8.Штативы для микропробирок объемом 0,5 и 1,5 мл.

9.Одноразовые полипропиленовые пробирки типа Эппендорф на 0,5

и1,5 мл.

10.Пробирки типа Фалькон на 15 и 50 мл.

11.Шпатель.

12.Емкость для взвешивания.

13.Планшет для дот-блота с клейкой пленкой для планшета.

14.Нитроцеллюлозная мембрана 0,2 мкм BioRad.

15.Ножницы.

16.Пинцет.

17. Холодильник от +2 до +8 °С с морозильной камерой не выше ‒16 °С для хранения антивидовых конъюгатов.

18.Отдельный халат, шапочка и одноразовые перчатки.

19.Раствор 70 %-го спирта, вата.

20.Емкость с дезинфицирующим раствором (0,2 % водный раствор «Део-Хлор», ООО «Део») для сбрасывания наконечников.

21.Тонкий перманентный маркер-фломастер, грифельный карандаш.

Реактивы

1.Первичное антитело, с неизвестной специфичностью, с константными доменами мыши или человека.

2.Панель антигенов (А, Б, В).

3.Фосфатно-солевой буферный раствор.

4.Детергент Tween-20.

9

5.Сухое обезжиренное молоко.

6.Конъюгат антивидового моноклонального антитела с пероксидазой хрена против IgG мыши или человека («Биосан», Россия).

7.Цитратный буфер, pH 5.0 (0,1 M цитрат натрия, 0,1 М лимонная кислота).

8.3% перекись водорода.

9.4-хлор-1-нафтол 3,6 мг/мл в метаноле (20х раствор).

Меры предосторожности

Перед началом работы вымыть руки, надеть чистый халат, одноразовые перчатки и шапочку, протереть рабочее место, штатив для пробирок и автоматические дозаторы раствором 70 %-го спирта.

Работать только в одноразовых перчатках, использовать для автоматических дозаторов одноразовые наконечники с аэрозольным барьером, менять их при каждой операции, а также при подозрении на загрязнение.

Использованную одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раствор. Способы утилизации отходов описаны на стр. 37.

По возможности держать реагенты и реакционные пробирки закрыты-

ми.

Инкубацию планшетов проводить при температуре 37±1 °С в термошейкере. Нельзя проводить анализ при температуре в помещении ниже 17 °С и выше 27 °С, так как в этом случае производитель не гарантирует поддержание нужной температуры внутри термошейкера.

ВНИМАНИЕ! При работе с антителами, антигенами, конъюгатами и субстратом ферментативной реакции необходимо использовать только одноразовые стерильные пластиковые расходные материалы.

Порядок работы

1.Нарезать по две полоски нитроцеллюлозной мембраны шириной 0,5 см и длиной 3 см, подписать их О и К (Образец и Контроль), используя грифельный карандаш, а затем поместить в планшет для дот-блота.

2.Фильтрованными наконечниками нанести на полоску К 1 мкл первичного антитела (будет использоваться в качестве положительного контроля), а на вторую ‒ три антигена по 1 мкл, один из которых, предположительно, имеет сродство к первичному антителу.

3.Оставить полоски на 5 мин до высыхания.

4.Приготовить 5 %-й раствор обезжиренного молока. Для этого сделать навеску 0,5 г сухого обезжиренного молока. В пробирку типа Фалькон на 50 мл налить 10 мл буфера ФСБР и перенести взвешенное сухое обез-

10