Иммунологические методы анализа белковых молекул

жиренное молоко. Плотно закрытую пробирку тщательно перемешать на вортексе.

5.Добавить по 3‒4 мл раствора обезжиренного молока к полоскам мембраны в штативе (мембрана должна быть полностью в жидкости). Заклеить планшет пленкой и поместить в термошейкер на 30 мин при

600 rpm и 37 °С.

6.С помощью автоматической пипетки удалить раствор обезжиренного молока и добавить 4 мл ФСБР. Поместить планшет на 2 мин в термошейкер при 600 rpm. Повторить отмывку три раза.

7.Приготовить раствор антитела. Для этого в пробирку типа Фалькон на 15 мл налить 3 мл ФСБР-0,02% Tween-20 и с использованием наконечника с аэрозольным барьером внести 2 мкг раствора антитела. Пробирку плотно закрыть и тщательно перемешать на вортексе.

8.Добавить 3 мл полученного раствора к полоске мембраны О в планшете. Добавить 3 мл ФСБР-0,02% Tween-20 к полоске мембраны К в планшете. Заклеить планшет пленкой и поместить в термошейкер на 50 мин при 600 rpm и 37 °С.

9.Повторить отмывку ФСБР-0,02% Tween-20, следуя п. 6.

10.Приготовить раствор конъюгата антивидового моноклонального антитела (вторичного антитела) с пероксидазой хрена против первичного IgG. Для этого в пробирку типа Фалькон на 15 мл налить 6 мл ФСБР-0,02% Tween-20 и фильтрованным наконечником внести 3 мкл конъюгата. Пробирку плотно закрыть и тщательно перемешать на вортексе.

11.Добавить по 3 мл полученного раствора к каждой полоске мембраны в планшете. Заклеить планшет пленкой и поместить в термошейкер на 50 мин при 600 rpm и 37 °С.

12.Повторить отмывку ФСБР-0,02% Tween-20 шесть раз, следуя п. 6.

13.Приготовить раствор для проявления. Для этого в пробирку типа Фалькон на 15 мл налить 5,7 мл цитратного буфера: и внести 300 мкл 4- хлор-1-нафтола, 20 мкл перекиси водорода. Плотно закрытую пробирку с раствором тщательно перемешать на вортексе.

14.Внести по 3 мл раствора для проявления к каждой полоске. При появлении пятна в области нанесения антитела на контрольной полоске выложить полоски на фильтровальную бумагу.

Оценка результатов

Учет результатов дот-блот-анализа проводится по наличию или отсутствию на полоске специфических цветовых пятен в области нанесения белков, что свидетельствует о связывании белков с антителом. И, таким образом, можно определить, к какому из белков-антигенов оказалось специфично первичное антитело.

11

Лабораторная работа № 2. Белковый электрофорез в полиакриламидном геле и последующий перенос белков на мембрану

Электрофорез в полиакриламидном геле

Электрофорез в полиакриламидном геле – стандартный метод, ис-

пользуемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК и белков. Электрофорез позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размер (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут играть роль в степени продвижения в геле как порознь, так и в совокупности [Остерман, 1981].

Биологические макромолекулы – белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и др. – находятся в водном растворе в виде частиц, несущих определенный электрический заряд. Заряд макромолекулы определяется входящими в ее состав группами, способными к электролитической диссоциации. Степень диссоциации групп зависит от многих факторов, в частности от рН среды. Общий заряд биологической макромолекулы также может изменяться при ее взаимодействии с ионами или другими молекулами. Варьируя концентрацию образующего гель полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов.

Для получения полиакриламидного геля (ПААГ) используют акриламид и какой-либо агент, образующий поперечные сшивки – обычно N,N'- метилен-бис-акриламид (сокращенно – бис-акриламид).

Реакция полимеризации протекает по свободнорадикальному механизму и требует наличия свободных радикалов акриламида. В качестве инициаторов реакции полимеризации используют вещества, разрушающиеся с образованием свободных радикалов, которые затем взаимодействуют с молекулами акриламида и запускают (инициируют) полимеризацию. Наиболее широко в качестве инициатора процесса полимеризации используют персульфат аммония (NH4+ O--SO2-O-O-SO2-O- NH4+) или калия, образующий в водном растворе радикалы (NH4-SO4•) за счет гомолитического разрыва связи. Поскольку реакция полимеризации акриламида протекает медленно, то для ускорения процесса полимеризации в качестве катализа-

12

тора обычно используют N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин (СH3)2 – N – CH2 – CH2 – N – (CH3)2 (ТЕМЭД).

Для характеристики полиакриламидного геля необходимо указывать процентное содержание каждого из мономеров. Процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к объему раствора обычно варьируется

впределах 3‒30 %, а процентное отношение массы бис-акриламида к общей массе обоих мономеров в пределах 1‒5 %. Выбор значений С и Т определяется диапазоном фракционирования белков и ограничивается механическими и адсорбционными свойствами геля. Чем больше содержание акриламида, тем гуще нити полимера, меньше промежутки между ними и сильнее трение.

Электрофоретическая подвижность – это скорость движения части-

цы (обычно выражаемая в см/c) при напряженности электрического поля

в1 В/см. Эта величина имеет размерность см2 с-1 В-1, а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда макромолекулы.

Электрофорез в ПААГ с использованием додецилсульфата натрия

Электрофоретическая подвижность каждого белка зависит от ряда параметров: от молекулярной массы белка, его суммарного заряда, конфигурации и жесткости упаковки полипептидной цепи. Вклад каждого из этих факторов может существенно меняться в зависимости от условий электрофореза.

Одним из наиболее популярных методов является электрофорез в ПААГ с использованием додецилсульфата натрия (ДСН), который позволяет фракционировать белки в зависимости от значения только одного параметра – их молекулярной массы. Основной принцип метода – снижение влияния заряда макромолекулы на ее электрофоретическую подвижность. В этом случае должна наблюдаться пропорциональность между молекулярной массой макромолекулы и ее сопротивлением трения (коэффициентом задержки). Для этого белки обрабатывают избытком ДСН, который примерно одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг ДСН с 1 мг белка. Кроме того, при обработке белка ДСН полипептидная цепочка распрямляется и приобретает форму жесткого эллипсоида вращения, размер большой оси вращения которого линейно связан с числом аминокислотных остатков, а, следовательно, и с молекулярной массой белка.

Наиболее широко используемым вариантом электрофореза с добавлением ДСН является диск-электрофорез по Лэммли [Laemmli, 1970]. Этот метод позволяет значительно улучшить разделение фракционируемых белков за счет введения дополнительного так называемого формирующего слоя крупнопористого геля, в котором белки не фракционируются, а только

13

концентрируются в виде очень узких полос перед переходом в разделяющий гель. Электрофорез по Лэммли позволяет хорошо разделять белки с диапазоном Mr = 15‒200 кДа. Для анализа низкомолекулярных белков и пептидов наиболее широко используется другая система, предложенная Шаггером [Schagger и др., 1987].

Цель работы

Провести электрофорез антител в 12 %-м ПААГ; провести оценку молекулярных масс полноразмерных антител, а также тяжелых и легких цепей антител; перенести белки с геля на нитроцеллюлозную мембрану для последующего определения видовой принадлежности моноклональных антител методом вестерн-блот-анализа (лаб. работа № 3).

Оборудование и материалы

1.Камера для вертикального электрофореза (BioRad).

2.Система с зажимом для заливки полиакриламидного геля BioRad.

3.Стекла для заливки геля.

4.Гребенка.

5.Источник питания для гель-электрофореза (BioRad).

6.Камера для переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану.

7.Термостат.

8.Шейкер ELMI SkyLine.

9.Микроволновая печь.

10.Система визуализации и документирования гелей либо ПК со ска-

нером.

11.Весы технические 0,1–200 г.

12.Контейнер для окрашивания гелей из термостойкого пластика.

13.Мерные цилиндры 50 и 1000 мл.

14.Автоматические дозаторы переменного объема от 0,5 до 10 мкл, от 5 до 20 мкл, от 20 до 200 мкл, от 200 до 1000 мкл.

15.Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 10 мкл, до 20 мкл, до 200 мкл, до 1000 мкл.

16.Штативы для микропробирок объемом 0,5 мл.

17.Одноразовые полипропиленовые пробирки типа Эппендорф на

0,5 мл.

18.Пробирки типа Фалькон на 15 и 50 мл.

19.Нитроцеллюлозная мембрана 0,2 мкм (BioRad).

20.Фильтровальная бумага.

21.Ножницы.

22.Пинцет.

23.Чистый халат, шапочка и одноразовые перчатки.

24.Раствор 70 %-го спирта, вата.

14

25. Емкость с дезинфицирующим раствором для сбрасывания наконечников.

Реактивы

1. Концентрированный трис-глициновый буфер (Tris-Gly) × 10 (250 мМ Tris HCl, рН 8,3, 1,92 М глицин, 1 %).

2.Акриламид 30 %.

3.1,5М Tris HCl (pH 8,8).

4.0,5М Tris HCl (pH 6,8).

5.10 % ДСН.

6.10 % ПСА.

7.TEMED.

8.Буфер для нанесения на гель с DTT (100 мМ Tris-HCl, рН 6,8, 200 мМ DTT, 4 % SDS, 0,2 % бромфеноловый синий, 20 % глицерол, вода).

9.Буфер для нанесения на гель без DTT.

10.Вода.

11.Краситель Кумасси синий (Coomassie Brilliant Blue).

12.Пленка Parafilm.

13.Буфер для переноса (5,8 г Tris-HCl, 39 мМ глицин, 0,037 % SDS, 20 % этанол).

14.Маркер молекулярных масс белковый.

15.Дистиллированная вода.

16.Образцы исследуемых антител с концентрацией 1 мкг/мкл.

Меры предосторожности

Перед началом работы надеть чистый халат, одноразовые перчатки и шапочку, протереть рабочее место, штатив для пробирок и автоматические дозаторы раствором 70 %-го спирта.

Работать только в одноразовых перчатках, использовать для автоматических дозаторов одноразовые наконечники, менять их при каждой операции, а также при подозрении на загрязнение. При работе с хирургическим скальпелем будьте особенно аккуратны, опасайтесь порезов.

Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раствор. Способы утилизации отходов описаны на с. 37. По возможности держать реагенты и реакционные пробирки закрытыми.

Приготовление рабочих растворов и полиакриламидного геля

1. Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 100 мл концентрированного трис-глицинового буфера (Tris-Gly, довести дистиллированной водой до 1000 мл, тщательно закрыть цилиндр пленкой Parafilm и перемешать).

15

аккуратно перемешать переворачивая пробирку и залить разделяющий гель до отметки.

6. Для выравнивания границы между разделяющим и концентрирующим гелями сверху осторожно наслоить примерно 1 мл воды на гель, оставить примерно на 10 мин до полимеризации.

7. Дождаться, пока разделяющий гель застынет и появится четкая граница между водой и гелем. После этого, наклонив стекло, удалить наслоенную ранее воду, остатки убрать фильтровальной бумагой.

8. В раствор для концентрирующего геля добавить 4 мкл TEMED. Аккуратно перемешать и залить концентрирующий гель до верха стекла.

9. Вставить гребенку и оставить полимеризоваться.

10. Приготовить четыре пробы для нанесения, для этого смешать:

М – маркер.

Поставить пробы в термостат при 95°С на 10 мин.

11. Каждую пробу разделить на две объемом 4,5 мкл, каждая из которых будет содержать 1,5 мкг белка. Буфер с дитиотрейтолом в пробах 1ДТТ и 2ДТТ используется для разделения легких и тяжелых цепей, так как он расщепляет дисульфидные связи в белке. В пробах 1 и 2 находятся полноразмерные антитела.

16

подключить ее к источнику тока: сначала форез проводить при токе 15 мА, после перехода лидирующего красителя из концентрирующего в разделяющий гель силу тока увеличить до 30 мА (в случае использования ограничения по напряжению – 50 В и 120 В соответственно).

6. Выключить систему после того, как полоса лидирующего красителя дойдет до нижней границы геля (около 70 мин).

7. Подготовить шесть листов фильтровальной бумаги и лист нитроцеллюлозной мембраны по размеру разделяющего геля.

8. Часть геля для переноса (карманы 1-5) отрезать и снять со стекла, собрать кассету для переноса. Три слоя фильтровальной бумаги смочить в буфере для переноса, уложить к катоду, сверху поместить гель, на гель положить нитроцеллюлозную мембрану (внутренней стороной) и накрыть еще тремя слоями фильтровальной бумаги, смоченной в буфере для переноса. Манипуляции проводить осторожно, чтобы не образовались пузыри воздуха между слоями. Закрыть кассету для переноса, поместить ее в систему для переноса и установить систему в камеру. Залить буфер для переноса до отметки.

9. Подключить камеру к источнику постоянного электрического тока, соблюдая полярность (белки движутся к положительному электроду), и включить источник. Выставить параметры источника: напряжение ‒ 80 В, сила тока ‒ 200 мА, время ‒ 4 ч.

10. Вторую часть геля (карманы 6-10) снять со стекла и поместить в раствор красителя Кумасси синего, разогреть в микроволновой печи до кипения, а затем поставить на шейкер на 5 мин для окраски.

11. Для отмывки от избыточного фона слить раствор красителя, промыть несколько раз водой, добавить воду и прогреть до кипения, поставить на шейкер на 5 мин, повторить процедуру отмывки несколько раз.

17

Оценка результатов

1.Задокументировать полученную картину разделения белков в полиакриламидном геле после проведения электрофореза при помощи

Molecular Imager GelDoc™ XR System BioRad, либо отсканировав гель,

используя ПК со сканером.

2.Включить Molecular Imager GelDoc™ XR System, запустить про-

грамму Image Lab 3.0 на компьютере, выбрать “New”. Кликнуть на надпись

“Select” в открывшемся окне и выбрать “Protein Gels”, “Coomassie Blue”.

3.Из прибора выдвинуть трансиллюминатор, расположить гель по центру рабочей поверхности и задвинуть обратно до щелчка. Нажать кнопку “Position Gel”, выбрать “Filter 1” и кликнуть “ОK”. На экране появится изображение геля.

4.Отрегулировать размер изображения с помощью кнопок «+» и «-» инструмента “Camera Zoom”.

5.Cфотографировать изображение, нажав “Run Protocol”.

6.Отрегулировать четкость и яркость изображения c помощью ин-

струмента “Image Transform”.

7.Сохранить изображение, нажав “Export» и затем “Export for Publicatiom” в меню “File”.

8.Из прибора выдвинуть трансиллюминатор, удалить гель и протереть 70 %-м спиртом досуха.

9.Определить размер белков, сравнивая с распределением полос в маркере. Пример полученного изображения на рис. 3.

Рис. 3. Пример электрофореграммы (А) и электропереноса на нитроцеллюлозную мембрану (Б) антител человека и мыши в денатурирующих (с ДТТ) и не денатурирующих условиях (без ДТТ) в 12 % ПААГ

18

Лабораторная работа № 3. Определение видовой принадлежности антител из образцов методом вестерн-блот-анализа

Вестерн-блот-анализ

Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) — аналитический метод, используемый для идентификации специфичных белков в сложных смесях или экстрактах различных тканей [Мейл и др., 2007].

На первом этапе смесь белков разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле по длине (как правило, в присутствии додецилсульфата натрия) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии).

Затем белки переносят на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга. Гель после электрофореза помещают на нитроцеллюлозную мембрану между слоями фильтровальной бумаги и вводят в электрическое поле так, что комплексы «белок-ДСН» движутся из геля на нитроцеллюлозную мембрану иммобилизуются на поверхности нитроцеллюлозной мембраны. При этом на мембране воспроизводится картина электрофоретического разделения.

После переноса белков на мембрану места неспецифического связывания блокируют помещением мембраны в разбавленный раствор бычьего сывороточного альбумина или обезжиренного сухого молока. Белок из разбавленного раствора прикрепляется к мембране во всех местах, где не прикрепился целевой белок. Поэтому при дальнейшем добавлении антител единственное свободное место на мембране, куда они могут прикрепиться,

— это сайты связывания на специфичных целевых белках.

Далее мембрану инкубируют последовательно с антителами, специфичными к исследуемому белку, а затем с вторичными антителами, специфичными к Fc-фрагментам первичных антител, конъюгированными с ферментной меткой. Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы проявляют с помощью хромогенного субстрата (зависит от типа метки). Стадию проявления с помощью конъюгированных антител называют иммунохимическим окрашиванием [Towbin et al., 1979].

После проведения электрофореза, электропереноса и сорбции белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану третичная конформация белка сильно изменяется, поэтому для иммунохимической детекции исследуемого белка обычно используются только моноили поликлональные антитела, специфичные к линейным участкам белковой молекулы. Антитела, специфичные к конформационным эпитопам, как правило, не пригодны для использования в методе вестерн-блота.

19

Метод вестерн-блота чаще всего применяют для определения состава и молекулярных размеров антигенов, но, кроме того, он очень эффективен для определения специфичности антител (в частности, моноклональных) и поиска антигенно родственных молекул в однотипных или различных антигенных препаратах (например, различные виды бактерий, вирусные мутанты, клеточные экстракты и т. д.) [Мейл и др., 2007].

Цель работы – определить видовую принадлежность моноклональных антител с помощью вестерн-блот-анализа.

Оборудование и материалы

Оборудование и материалы аналогичны используемым в лаб. работе № 1.

Реактивы

1.Нитроцеллюлозная мембрана с перенесенными антителами из лабораторной работы № 2.

2.Краситель Понсо С.

3.Конъюгат антивидового моноклонального антитела мыши с пероксидазой хрена против IgG человека («Биосан», Россия).

4.Конъюгат антивидового моноклонального антитела козы с пероксидазой хрена против IgG мыши («Биосан», Россия).

5.Фосфатно-солевой буферный раствор.

6.Детергент Tween-20.

7.Сухое обезжиренное молоко.

8.Цитратный буфер, pH 5.0 (0,1 M цитрат натрия, 0,1 М лимонная кислота).

9.3% перекись водорода.

10.4-хлор-1-нафтол 3,6 мг/мл в MeOH (20х раствор).

Меры предосторожности

Перед началом работы надеть чистый халат, одноразовые перчатки и шапочку, протереть рабочее место, штатив для пробирок и автоматические дозаторы раствором 70 %-го спирта.

Работать только в одноразовых перчатках, использовать для автоматических дозаторов одноразовые наконечники с аэрозольным барьером, менять их при каждой операции, а также при подозрении на загрязнение.

Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раствор. Способы утилизации отходов описаны на с. 37.

По возможности держать реагенты и реакционные пробирки закрыты-

ми.

20