Иммунологические методы анализа белковых молекул
.pdfЦель работы – определение содержания регуляторных Т-лимфоцитов в клетках крови лабораторной мыши.
Оборудование и материалы
1.Проточный цитометр Novocyte 3000.
2.Микроцентрифуга «MiniSpin» для микропробирок типа Эппендорф («Eppendorf», Германия).
3.Центрифуга медицинская с бакет-ротором для пробирок типа Фалькон на 15 мл.
4.Весы технические 0,1–200 г.
5.Вортекс.
6.Автоматические дозаторы переменного объема (от 0,5 до 10 мкл, от 5 до 20 мкл, от 20 до 200 мкл, от 200 до 1000 мкл).
7.Одноразовые наконечники с фильтром для дозаторов переменного объема до 10 мкл, до 20 мкл, до 200 мкл, до 1000 мкл.
8.Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до
200 мкл.
9.Штативы для микропробирок объемом 0,5 и 1,5 мл.
10.Одноразовые полипропиленовые пробирки типа Эппендорф на 0,5
и1,5 мл.
11.Серологические пипетки объемом 5 и 10 мл.
12.Механический дозатор для серологических пипеток.
13.Пробирки типа Фалькон на 15 и 50 мл.
14.Пробирки цитометрические.
15. Холодильник от +2 до +8 °С с морозильной камерой не выше ‒16 °С для хранения конъюгатов маркеров иммунных клеток.
16.Отдельный халат, шапочка и одноразовые перчатки.
17.Раствор 70 %-го спирта, вата.
18.Емкость с дезинфицирующим раствором (0,2 % водный раствор «Део-Хлор», ООО «Део») для сбрасывания наконечников.
19.Тонкий перманентный маркер-фломастер, грифельный карандаш.
Реактивы
1.Образец крови человека, полученный в клинической лаборатории, собранный в вакуумную пробирку, содержащую антикоагулянт ЭДТА.
2.Конъюгаты маркеров иммунных клеток CD45, CD3, CD4, CD8.
3.Гипотонический лизирующий буфер для разрушения эритроцитов.
4.Стерильный фосфатно-солевой буферный раствор.
5.Бычий сывороточный альбумин.
6.Раствор иммуноглобулина G человека с концентрацией 1мг/мл.
31
ВНИМАНИЕ! Работа с экспериментальными животными проводится по согласованию с биоэтическими комитетом ИХБФМ СО РАН. Исследования с лабораторными животными должны выполняться в соответствии с законодательством РФ, положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (ETS N 123), в частности приложения А и статьи N 5 Кон-
венции, положениями Guide for the Care and Use of Laboratory Animals
(Washington D.C., 2011) и другими нормами международного права, регламентирующими вопросы содержания и использования лабораторных (экспериментальных) животных.
ВНИМАНИЕ! Флуоресцентно-меченные антитела должны храниться при +4 оС и находиться при комнатной температуре только на время отбора требуемого объема антител.
Меры предосторожности
Перед началом работы надеть чистый халат, одноразовые перчатки и шапочку, протереть рабочее место, штатив для пробирок и автоматические дозаторы раствором 70 %-го спирта.
Работать только в одноразовых перчатках, использовать для автоматических дозаторов одноразовые наконечники с аэрозольным барьером, менять их при каждой операции, а также при подозрении на загрязнение.
Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раствор. Способы утилизации отходов описаны на с. 37.
По возможности держать реагенты и реакционные пробирки закрыты-
ми.
Порядок работы
Часть 1. Выделение клеток периферической крови животного
1)Получить из вивария института кровь мышей линии C57Bl6/J, собранную в пробирку типа Эппендорф, содержащую 10 мкл 0,01М ЭДТА.
2)Взвесить пробирку, центрифугировать при 300 g 10 минут, предварительно уравновесив. В результате пробирка должна содержать два слоя: верхний слой, представленный плазмой, и нижний слой, представленный осадком эритроцитов и лейкойцитов.
3)Удалить слой плазмы. Перенести взвесь клеток в пробирку объемом 15 мл
4)Добавить раствор лизирующего буфера в объеме 10-кратно превосходящем объем осадка. Инкубировать 10 минут при +4оС. В результате должен получиться прозрачный раствор с алым лаковым оттенком. Прозрачность свидетельствует о том, что эритроциты лизированы.
32
5)Добавить 2 объема раствора фосфатно-солевого буфера. Аккуратно перемешать. Центрифугировать 10 минут при 300g.
6)Ресуспендировать в 600 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 0,5% бычий сывороточный альбумин.
7)Переместить по 100 мкл клеточной суспензии в 6 новых пробирок.
Часть 2. Окраска флуоресцентно-меченными антителами
1)Извлечь из холодильника флаконы с меченными антителами к белкам CD45, CD3, CD4, CD8 мыши. Приготовить коктейль из указанных антител, путем смешивания 5 мкл каждого раствора.
2)Для получения компенсационной матрицы в первые 4 пробирки из п.3. добавить по 5 мкл каждого раствора одного из антител индивидуальным носиком.
3)Приготовить одну пробирку, не содержащую антитела.
4)Приготовить одну пробирку, содержащую коктейль антител.
5)Инкубировать клетки в течение 30 минут при комнатной темпера-
туре.
6)Добавить в каждую пробирку по 900 мкл раствора фосфатносолевого буфера, центрифугировать в течение 5 минут при 300 g. Ресуспендировать клетки в 200 мкл фосфатно-солевого буфера. Перенести в цитометрические пробирки.
Часть 3. Работа с цитометром в ИХБФМ СО РАН
Для проведения исследования клеток на проточном цитометре необходимо:
1)Заранее согласовать дату и время работы на проточном цитометре
Novocyte 3000 с оператором.
2)Обозначить пробирки последовательной сквозной нумерациией с занесением шифров образцов в лабораторный журнал.
3)Предоставить оператору список используемых для детекции маркеров и соответствующих им флуорохромов.
4)Для транспортировки полученных данных необходим портативный носитель памяти. Сетевая передача данных с прибора невозможна.
Работа на проточном цитометре осуществляется оператором прибора. Для проведения анализа необходимо передать оператору штатив с пробирками, подписанными заранее оговоренным способом идентификации образцов. Наиболее удобным способом является «сквозная нумерация», при которой пробирки с образцами последовательно нумеруют, а в лабораторном журнале производят запись соответствия номера пробирки одному из образцов.
33
При запуске прибора оператор помещает образцы в специальные штативы для цитометрических пробирок, из которых будет производиться автоматический отбор образцов.
После этого производится настройка параметров записи данных, при которой критичным моментом является установка каналов детекции, соответствующих флуорохромам, используемым в антителах. Так, если один из необходимых флуорхромов не был указан при настройке прибора, он не попадет в окончательный файл данных, и эта информация будет утрачена.
Анализ данных Цитометрическое событие – единичная частица, зарегистрированная
прибором. Цитометрическим событием может быть любой объект размера, достаточного чтобы пройти через капилляр прибора. В случае иммунологических исследований одно цитометрическое событие соответствует одной клетке. В то же время в образце всегда присутствуют остатки погибших в ходе пробоподготовки клеток, остаточное количество тромбоцитов, эритроцитов, которые также детектируются прибором, что может помешать правильной оценке результатов исследования.
Информация обо всех цитометрических событиях записывается программным обеспечением прибора в файл формата *.FCS, который является стандартом цитометрии. Программа формирует таблицу, в строках которой – цитометрическое событие, а в колонки записываются данные о каналах прибора, включая интенсивность флуоресценции или светорассеяния. Данные, содержащиеся в таком файле, можно анализировать с помощью различного программного обеспечения сторонних разработчиков, в том числе бесплатных. Наиболее популярной, хотя и платной, является программа FlowJo (практически любая платная программа предоставляет возможность 30-дневного бесплатного использования с полноценным аналитическим арсеналом).
Для визуализации данных полученной таблицы строят двумерные графики, каждым измерением которых является один из флуоресцентных каналов, или каналы FSC и SSC. Анализ данных цитометрии начинают именно с двух последних параметров, поскольку они позволяют отделить клетки от субклеточных объектов, а также среди всех представленных клеток выделить нужную группу (рис. 7). Обычно клетки крови на таком графике представлены тремя главными популяциями: лимфоциты, моноциты и нейтрофилы. Лимфоциты – клетки наименьшие по размеру и гранулярности; чуть больше размером, но также со сниженной гранулярностью – моноциты. Больше всего в крови нейтрофилов, и эти клетки отличаются большими размерами и ярко выраженной гранулярностью, поэтому им соответствуют большие значения FSC и SSC.
34
Довольно часто одни типы клеток резко отличаются по содержанию в клетке одного и того же белка, и такая особенность характерна практических для всех типов клеток. Это позволяет ограничить описание клеток качественными признаком присутствия или отсутствия белка: присутствующий белок обозначают знаком «+», отсутствующий – знаком «–». Так фенотип CD3+ представляют множество Т-лимфоцитов, и позволяет отличить эти клетки от фенотипа CD19+, представляющего
Рис. 7. Типичный график светорассеяния клеток крови
множество В-лимфоцитов. Однако этих маркеров недостаточно, чтобы сказать, какие именно Т- или В-лимфоциты составляют эти множества.
Для того чтобы более глубоко исследовать данную популяцию клеток, ее необходимо выделить и в дальнейшем работать только с ней. Эта процедура называется гейтированием, и для нее в любом цитометрическом ПО существует специальный набор инструментов.
Алгоритм анализа
Рассмотрим последовательность поиска основных популяций Т- лимфоцитов среди клеток крови мыши (Рис. 8).
1)На графике светорассеяния FSC/SSC идентифицируют популяцию лимфоцитов.
2)Выделяют эту популяцию, и проводят гейтирование, т.е. оставляют в анализе только эти клетки.
3)Для гейтированных клеток строят график CD45/CD3. В норме, на графике должно отобразиться две популяции: CD45+CD3- (не Т- лимфоциты), CD45+CD3+ (все Т-лимфоциты).
35
4)Проводят повторное гейтирование, агентируясь только на
CD45+CD3+ клетках.
5)Выделенные хелперные клетки анализируют в координатах
CD4/CD8.
6)На таком графике выделяют две основные популяции: CD4+/CD8- (хелперные Т-лимфоциты), CD4-CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты).
7)Основной мерой представленности клеток в популяции является процент клеток от общего количества лимфоцитов. Для подсчета процента клеток выделяют требуемую популяцию, а в параметрах анализа указывают родительскую популяцию клеток (в данном случае лимфоциты).
Рис. 8. Анализ клеточного состава лимфоцитов крови. А. Выделение лимфоцитов из всех цитометрических событий. Б. Выделение хелперных клеток. В. Выделение популяции регуляторных лимфоцитов
36
Процедура уничтожения твердых и жидких отходов
Медико-биологические отходы разделяют на несколько классов, в зависимости от их опасности для здоровья человека и окружающей среды. Для целей практикума актуальны отходы классов «А» и «Б». К первому относятся бытовые отходы, такие как бумага, пакеты, неиспользованный пластик и пластик, контактировавший только с буферными растворами, неиспользованные фрагменты гелей. К отходам класса «Б» в программе практикума относят наконечники дозаторов, пробирки и планшеты, контактировавшие с белками и другими биологическими материалами, использованные гели. Отходы класса «А» не требуют специальной обработки и могут быть утилизированы вместе с обычными бытовыми отходами.
Отходы класса «Б» необходимо обработать дезинфицирующими средствами, такими как «ДезХлор» или раствор перекиси водорода (6 %). Материалы после использования помещают в емкость, содержащую готовый дезинфицирующий раствор на 60 минут. Также возможно автоклавирование материалов в пластиковых пакетах, пригодных для обработки водяным паром при повышенном давлении. Далее материал перемещают в пакеты, предназначенные для утилизации отходов класса «Б», и передают в специализированную организацию.
Утилизация отходов регламентируется правилами, описанными в СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».
37
Библиографический список
1.Галактионов В. Г. Иммунология. М.: РИЦ МКД, 2000.
2.Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000.
3.Reading S. A., Dimmock N. J. Neutralization of animal virus infectivity by antibody // Arch. Virol. 2007. V. 152 (6). P. 1047−1059.
4.Goldsby R. A., Kuby J., Osborne B. A. Immunology. W. H. Freeman & Co, 2003.
5.Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987.
6.Хаитов Р. М. Иммунология: учебник. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2018.
7.Анцилевич Л. М., Ягудина Л. А. Практическое применение иммуноферментного анализа в диагностике заболеваний // Практ. медицина, совр. вопр. диагностики. 2014. Т. 03. № 14. С. 28−32.
8.Тараканова Ю.Н., Дмитриев А.Д., Дмитриев Д.А. и др. Твердофазный иммуноферментный анализ: история, теория и практическое использование // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2019. Т. 96 (3). C. 117–125.
9.Самойленков П. В. Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике. М.: РГМУ, 2009.
10.Долгов В. В. и др. Иммуноферментный анализ в клиникодиагностических лабораториях. М.; Тверь: Триада, 2007.
11.Бурместер Г.-Р., Пецутто А. Наглядная иммунология. М.: Лаборатория знаний, 2019.
12.Pappas M. G. Recent applications of the Dot-ELISA in immunoparasitology // Vet Parasitol. 1988. V. 29(2). P. 105–129.
13.Написанова Л. А., Бережко В. К., Сивкова Т. Н. Эффективность точечной иммуноферментной реакции (дот-ИФА) в диагностике трихинеллеза и эхинококкоза // Вят. мед. вестн. 2015. Т. 4 (48). С. 18−21.
14.Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование: практ. пособие. М.: Наука, 1981.
15.Laemmli U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680−685.
16.Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Anal. Biochem. 1987. V. 166. P. 368−379.
17.Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76 (9). P. 4350–4354.
38
Научное издание
Тикунова Нина Викторовна, Хлусевич Яна Александровна, Чечушков Антон Владимирович, Емельянова Людмила Александровна, Нетесов Сергей Викторович
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ
Подписано в печать 05.12.2023 г.
Формат 60×84 1/16. Уч.-изд. л. 2,5. Усл. печ. л. 2,3.
Тираж 50 экз. Заказ № 284 Издательско-полиграфический центр НГУ. 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2.