Иммунологические методы анализа белковых молекул

Порядок работы

1. Проверить качество переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану из лабораторной работы № 2. Для этого извлечь кассету из системы для переноса, достать нитроцеллюлозную мембрану и поместить ее в емкость для окрашивания. Залить 20 мл красителя Понсо С. Инкубировать 15 мин при качании. Аккуратно слить краситель, промыть 40‒50 мл дистиллированной водой три – четыре раза. Мембрана должна быть аналогичной окрашенному гелю.

2. Грифельным карандашом вертикально расчертить мембрану на полоски в соответствии с количеством образцов (4), а затем удвоить количество полосок. Подписать полоски сверху либо снизу.

лать навеску 1,5 г сухого обезжиренного молока. В пробирку типа Фалькон на 50 мл налить 30 мл буфера ФСБР и перенести взвешенное сухое обезжиренное молоко. Плотно закрытую пробирку тщательно перемешать на вортексе до полного растворения сухого молока.

5. Добавить по 3‒4 мл раствора обезжиренного молока к полоскам мембраны в штативе (мембрана должна быть полностью в жидкости). Заклеить планшет пленкой и поместить в термошейкер на 45 мин при

600 rpm и 37 °С.

6. С помощью автоматической пипетки удалить раствор обезжиренного молока и добавить 4 мл ФСБР. Поместить планшет на 2 мин в термошейкер при 600 rpm и 37 °С. Повторить отмывку три раза.

7. Приготовить растворы антивидовых конъюгатов с пероксидазой хрена. Для этого в пробирку типа Фалькон на 15 мл налить 12 мл буфера ФСБР-0,1 % Tween20 и фильтрованным наконечником внести 4 мкл конъюгата антивидового моноклонального антитела мыши с пероксидазой хрена против IgG человека. В пробирку типа Фалькон на 15 мл налить 12 мл буфера ФСБР-0,1 % Tween20 и фильтрованным наконечником внести 6 мкл конъюгата антивидового моноклонального антитела козы с пероксидазой хрена против IgG мыши. Плотно закрытые и подписанные пробирки с растворами антител тщательно перемешать на вортексе.

8. Добавить по 3 мл конъюгата анти-IgG человека к полоскам с обозначением «Ч». Аналогично конъюгат анти-IgG мыши внести к полоскам «М». Заклеить планшет пленкой и поместить в термошейкер на 45 мин при

600 rpm и 37 °С.

9. Повторить отмывку ФСБР-0,1 % Тween20 шесть раз, следуя п. 6.

21

10.Приготовить раствор для проявления. Для этого в пробирку типа Фалькон на 15 мл налить 11,4 мл цитратного буфера: и внести 600 мкл 4- хлор-1-нафтола, 40 мкл перекиси водорода. Плотно закрытую пробирку с раствором тщательно перемешать на вортексе.

11.Внести по 1,5 мл раствора для проявления к каждой полоске. При появлении пятен в области перенесенных антител, выложить полоски на фильтровальную бумагу.

Оценка результатов

1.Задокументировать полученные результаты, сфотографировав или же отсканировав мембрану, используя ПК со сканером.

2.Определить, какое из антител выявилось только конъюгатом антивидового моноклонального антитела мыши с пероксидазой хрена против IgG человека, а какое – только конъюгатом антивидового моноклонального антитела козы с пероксидазой хрена против IgG мыши.

Предполагаемые варианты результата:

В зависимости от полученного результата определить видовую принадлежность антитела. Например, в первом случае: антитело 1 – человеческое, антитело 2 – мышиное (рис. 4).

Рис. 4. Результат вестерн-блот-анализа антител человека и мыши с антивидовыми конъюгатами

22

Лабораторная работа № 4. Определение константы связывания антитела методом иммуноферментного анализа

Определение константы связывания антитела методом иммуноферментного анализа

Аминокислотные остатки в гипервариабельных участках (CDR) VL- и VH-доменом антитела взаимодействуют с эпитопом антигена, формируя активный центр антитела (паратоп). Наибольший вклад в формирование антигенсвязывающего центра вносит участок CDR-3. Кроме того, важную роль в формировании правильной конформации активного центра антитела вносят и каркасные регионы VL- и VH-доменов. Формирование прочной связи между антигенсвязывающим центром антитела и эпитопом антигена происходит за счет нековалентных связей, таких как водородные, гидрофобные, электростатические, ван-дер-ваальсовые и др. Образование комплекса антиген-антитело − процесс обратимый, так как нековалентные связи могут диссоциировать, а также из-за сил отталкивания между молекулами, возникающими в результате перекрывания электронных облаков [Мейл и др., 2007; Галактионов, 2000].

Аффинностью антитела к антигену называют силу связи одного антигенсвязывающего центра с эпитопом антигена. Чем больше комплементарность между антигенсвязывающим центром и эпитопом и разница сил притяжения и отталкивания, тем выше аффинности антитела. Поскольку в природе часто встречаются поливалентные антигены, а молекула иммуноглобулина содержит два антигенсвязывающих центра, то существует понятие авидность антитела – это суммарная сила взаимодействия антитела с антигеном.

Константа аффинности антитела или равновесная константа образования иммунного комплекса Ka (размерность л/моль) характеризуется отношением константы скорости ассоциации k+1 к константе скорости диссоциации комплекса k-1. Также часто используется равновесная константа распада иммунокомплекса (Кд = 1/Ka, размерность моль/л). Высокой аффинностью антитела принято считать Ка = 1012 М−1, а низкой ‒ Ка = 105 М−1.

Существует много методов измерения аффинности антитела к антигену. Некоторые из них основаны на равновесии [АТ]+[АГ]↔[АТАГ] и дальнейшем измерении концентрации свободного и связанного антигена методами флуоресценции, гель-фильтрации, диализа и другими. Также константу аффинности можно приблизительно оценить методом иммуноферментного анализа. В ситуации, когда половина антигенсвязывающих цен-

23

тров связана с антигеном (оптическая плотность раствора в такой ситуации снижена на 50 % от максимальной) и [АГ] = [АТАГ], значение Ка = 1/[АТ], а Kd = [АТ] [Мейл и др., 2007; Галактионов, 2000].

Молярная концентрация (молярность) – С – показывает число молей растворённого вещества, содержащееся в одном литре раствора:

где V – объём раствора (в литрах), nв-ва – количество вещества (в молях), m

– масса вещества (в граммах), M – молекулярная масса (г/моль) Молярная концентрация выражается в моль/л, эту размерность иногда обозначают M.

Цель работы – определить константу связывания антигена с первичным антителом методом иммуноферментного анализа.

Оборудование и материалы

1.Термошейкер для иммунологических планшетов, ELMI SkyLine.

2.Микроцентрифуга «MiniSpin» для микропробирок типа Эппендорф

(«Eppendorf», Германия).

3.Тонкий перманентный маркер.

4.Промыватель планшетов автоматический ПРОПЛАН (Пикон).

5.Планшетный фотометр iMark (BioRad).

6.Весы технические 0,1–200 г.

7.Встряхиватель вортекс.

8.Автоматические дозаторы переменного объема (от 0,5 до 10 мкл, от 5 до 20 мкл, от 20 до 200 мкл, от 200 до 1000 мкл).

9.Одноразовые наконечники с фильтром для дозаторов переменного объема до 10 мкл, до 20 мкл, до 200 мкл, до 1000 мкл.

10.Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до

200 мкл.

11.Штативы для микропробирок объемом 0,5 и 1,5 мл.

12.Одноразовые полипропиленовые пробирки типа Эппендорф на 0,5

и 1,5 мл.

13.Пробирки типа Фалькон на 15 и 50 мл.

14.Шпатель.

15.Емкость для взвешивания.

16.Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше -16 °С для хранения антивидовых конъюгатов.

17.Отдельный халат, шапочка и одноразовые перчатки.

18.Раствор 70 %-го спирта, вата.

19.Емкость с дезинфицирующим раствором для сбрасывания наконечников.

24

Реактивы

1.Первичное антитело с константными доменами мыши или челове-

ка.

2.Антиген.

3.Фосфатно-солевой буферный раствор – рН 7,5.

4.Детергент Tween-20.

5.Сухое обезжиренное молоко.

6.Конъюгат антивидового моноклонального антитела с пероксидазой хрена против IgG мыши или человека («Биосан», Россия).

7.Цитратный буфер, pH 5.0 (0,1 M цитрат натрия, 0,1 М лимонная кислота).

8.Диметилформамид (ДМФА).

9.Субстрат – тетраметилбензидин (ТМБ).

10.3% перекись водорода.

11.Стоп-реагент – 1M HCl.

Меры предосторожности

Перед началом работы надеть чистый халат, одноразовые перчатки и шапочку, протереть рабочее место, штатив для пробирок и автоматические дозаторы раствором 70 %-го спирта.

Работать только в одноразовых перчатках, использовать для автоматических дозаторов одноразовые наконечники с аэрозольным барьером, менять их при каждой операции, а также при подозрении на загрязнение.

Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раствор. Способы утилизации отходов описаны на с. 37.

По возможности держать реагенты и реакционные пробирки закрыты-

ми.

Порядок работы

1. Приготовить раствор антигена. В 4,8 мл буфера ФСБР внести 9,6 мкг антигена, рассчитав требуемый объем, исходя из известной концентрации раствора антигена. (Концентрация антигена в разных препаратах может отличаться. Например, при концентрации исходного препарата 1 мг/мл, необходимо отобрать 9,6 мкл раствора антигена и внести в 4,8 мл буфера ФСБР.)

2.Для сорбирования нанести по 100 мкл раствора антигена в 44 лун-

ки полистирольного планшета (конечная концентрация белка 200 нг/лунку). Заклеить планшет пленкой и поместить в термошейкер на 50 мин при 600 rpm и 37 °С.

3. Приготовить 5 %-й раствор обезжиренного молока. Для этого сделать навеску 0,6 г сухого обезжиренного молока. В пробирку типа Фалькон

25

на 50 мл налить 12 мл буфера ФСБР и перенести взвешенное сухое молоко. Плотно закрытую пробирку тщательно перемешать на вортексе.

4.Аккуратно вылить раствор антигена из лунок и три раза промыть 275 мкл ФСБР с помощью автоматического промывателя для удаления не связавшихся пептидов.

5.Добавить по 200 мкл раствора обезжиренного молока в каждую лунку. Заклеить планшет пленкой и поместить в термошейкер на 50 мин при 600 rpm и 37 °С.

6.С помощью автоматической пипетки удалить раствор обезжиренного молока и повторить отмывку ФСБР, следуя п. 4.

7.Приготовить раствор антитела. Для этого в пробирку типа Эппендорф на 1,5 мл налить 400 мкл ФСБР-0,1 % Тween20 и фильтрованным наконечником внести 4 мкг первичного антитела, рассчитав требуемый объем, исходя из концентрации раствора антитела. Конечная концентрация антитела составит 10 мкг/мл. Известно, что молекулярная масса антитела

составляет 150 000 г/моль. Тогда молярная концентрация составит

66,67 нМ.

8.Плотно закрытую пробирку с раствором антитела тщательно перемешать на вортексе.

9.Раститровать антитело в двух повторах согласно таблице. В лунку А1 и А2 добавить 200 мкл раствора антитела в концентрации 10 мкг/1 мл,

востальные лунки добавить по 100 мкл ФСБР-0,1 % Тween20. Аккуратно раститровать, последовательно перенося 100 мкл из предыдущей лунки; каждый раз использовать новый наконечник и тщательно ресуспендировать.

10.Заклеить планшет пленкой и поместить в термошейкер на 50 мин при 600 rpm и 37 °С.

11.Повторить отмывку ФСБР-0,1 % Тween20, следуя п. 4.

12.Приготовить раствор конъюгата антивидового моноклонального антитела с пероксидазой хрена. Для этого в пробирку типа Фалькон на 15

26

мл налить 6 мл ФСБР-0,1 % Тween20 и фильтрованным наконечником внести 2 мкл конъюгата. Плотно закрытую пробирку с раствором антитела тщательно перемешать на вортексе.

13.Добавить по 100 мкл полученного раствора в каждую лунку. Заклеить планшет пленкой и поместить в термошейкер на 50 мин при

600 rpm и 37 °С.

14.Повторить отмывку ФСБР-0,1 % Тween20 шесть раз, следуя п. 4. Аналогично промыть планшет ФСБР три раза.

15.Приготовить раствор ТМБ. Для этого в пробирку типа Фалькон на 15 мл налить 10 мл ДМФА и внести 100 мг ТМБ.

16.Приготовить раствор для проявления. Для этого в пробирку типа Фалькон на 15 мл налить 5,4 мл цитратного буфера и внести 600 мкл разведенного ТМБ (10 мг/мл в ДМФА), 20 мкл 3% перекиси водорода. Плотно закрытую пробирку с раствором тщательно перемешать на вортексе. Внести по 100 мкл в каждую лунку.

17.Заклеить планшет пленкой и поместить в термошейкер при 600 rpm и 37 °С на 5 мин или до появления синей окраски раствора (продукт каталитической реакции пероксидазы хрена и ТМБ), что свидетельствует о связывании антитела с антигеном.

18.Добавить 100 мкл 1М HCl, раствор поменяет цвет на желтый.

19.Провести измерение оптической плотности раствора при 450 нм

спомощью планшетного фотометра iMark (Bio-Rad).

Оценка результатов

1.С помощью программного обеспечения Microsoft Excel или Origin Pro 8. составить таблицу зависимости оптической плотности раствора от концентрации антитела для двух повторов. Учитывая отрицательный контроль, посчитать среднее значение оптической плотности и погрешности измерений.

2.Построить кривую зависимости среднего значения оптической плотности от концентрации антитела и рассчитать константу связывания с антигеном, численно равную обратной величине концентрации антитела при оптической плотности раствора, сниженной на 50 % от максимальной.

3.Оценить константу аффинности Ka данного первичного антитела.

Ka= 1 = 1 ;

27

Лабораторная работа № 5. Проточная цитометрия с использованием флуоресцентно-меченных моноклональных антител

Методы иммунофенотипирования и проточной цитометрии

Антитела могут связываться не только с растворенными или сорбированными белками, но и с белками, находящимися на мембранах клеток или внутриклеточных белковых комплексах. В настоящее время разработаны исследовательские и диагностические антитела практически ко всем известным белками человека и мыши, а также ко многим белкам других млекопитающих, прочих животных, растений, бактерий и грибов.

Благодаря применению антител удалось установить, что лимфоциты представляют собой не один единственный тип клеток, как можно было заключить, глядя в микроскоп, а огромное разнообразие, отличающееся функциями, расположением в тканях организма, временем жизни.

Основным отличительным признаком одних типов клеток от других оказалась композиция белков, экспрессированных в этих клетках. Такие белки называют маркерными, и многие расположены на поверхности клеток. Маркеры иммунных клеток принято обозначать аббревиатурой CD (cluster differentiation) с последующей сквозной нумерацией (Например, CD3, CD154 и т.д.). В настоящий момент для иммунных клеток описано около 400 таких белков. Кроме поверхностных белков, некоторые типы клеток возможно отличить друг от друга на основании экспрессии внутриклеточных белков или белков, секретируемых этими клетками. Так, регуляторные Т-клетки (Treg) отличаются от хелперных Т-лимфоцитов наличием внутриклеточного белка FOXP3, который отвечает за поддержание фенотипа Treg. В то же время отдельные типы хелперных Т-лимфоцитов (Тх) могут отличаться друг от друга продуцируемыми цитокинами. Так, маркером клеток Тх1 является цитокин интерферон-гамма, тогда как маркером клеток Tx2 выступает цитокин интерлейкин-4.

Для того чтобы сделать заключение об отличии двух клеток по содержанию одного белка, этот параметр необходимо измерить. Метод проточной цитометрии основан на измерении интенсивности свечения клетки при окраске антителом, меченным флуоресцентным зондом. Преимуществами этого способа является высокая чувствительность и возможность использования одновременно большого количества антител (чего, например, не позволяет распространенная гистологическая окраска с использованием хромогенных красителей). Последняя особенность является крайне важной, так как на практике наибольшую ценность представляет исследование одновременно нескольких маркеров.

28

Общие принципы проточной цитометрии

Для проведения исследования методом проточной цитометрии необходимо соблюдение нескольких условий:

1)наличие биологического образца, содержащего суспензию клеток или клеточных продуктов (тромбоциты, эритроциты, экзосомы и т.д.);

2)возможность разделения анализа во времени для каждой единич-

ной клетки или «цитометрического события»;

3)возможность количественного измерения сигнала от «цитометрического события».

Самым частым объектом исследования методом проточной цитометрии являются клетки крови человека или подопытных животных. Кроме того, в качестве объекта исследования могут выступать экзосомы, тромбоциты, эритроциты и другие субклеточные структуры, которые обладают достаточным размером для того, чтобы быть детектированы прибором.

В основе проточной цитометрии лежит механизм разделения во времени измерений, проводимых над каждой клеткой, находящейся в исследуемом образце (рис. 5). Это достигается за счет пропускания клеточной суспензии через специальное сопло (механизм пропускания может отличаться в зависимости от конкретного прибора). По ходу движения клетки вдоль капилляра, ее путь пересекает серия параллельно расположенных лазерных лучей, проходящих перпендикулярно движению клеток, а рассеянный и переизлученный свет от клетки улавливается детекторами, расположенными вокруг капилляра.

Рис. 5. Устройство проточной ячейки цитометра

29

Основной источник информации о клетке в проточной цитометрии – флуоресцентный сигнал. Для его детекции необходим источник падающего света, излучающий определенную длину волны, соответствующую используемому флуорохрому, а также детектор, измеряющий интенсивность флуоресценции. В проточной цитометрии в качестве источника света используют монохроматические лазеры, например лазеры с длиной волны

488 или 405 нм.

Каждой паре лазер-детектор соответствует канал флуоресценции. В одном флуоресцентном канале при правильном выборе комбинации флуоресцентных меток попадает информация только об одном клеточном маркере. В зависимости от количества лазеров и детекторов, количество каналов может варьировать от 1 до 20.

Помимо флуоресценции, важную информацию о клетках несут два канала, которые анализируют рассеяние света в прямой и боковых проекци-

ях лазерного луча (FCS – forward scatter, SSC – side scatter) (рис. 6). Если флуоресценция сообщает о количестве антитела, связавшегося с определенным маркером, то светорассеяние указывает на физические параметры клеток.

Рис. 6. Принцип детекции светорассеяния

FSC получается в результате рассеивания лазерного луча по направлению света, чем больше клетка, тем больше разброс светорассеяния (в этом случае клетка работает как рассеивающая линза), а специальный детектор определяет величину этого разброса.SSC возникает, если в клетке присутствует выраженная негомогенность, например гранулы нейтрофилов. В этом случае свет, рассеиваясь гранулами, попадает на детектор, расположенный в стороне от хода лазерного луча.

30