Диагностика, профилактика и меры борьбы при туберкулезе сельскохозяйственных животных. Методическое пособие

носят в стерильный, предварительно взвешенный пенициллиновый флакон. Флакон с бакмассой взвешивают на аналитических весах. Разница между вторым и первым взвешиванием показывает массу взятой культуры. Для приготовления суспензии физиологический раствор берут из расчета 1 мл на 1 мг бактериальной массы. Если бактериальная масса трудно гомогенизируется (суспензия должна быть однородной), ее сначала тщательно растирают с несколькими каплями физиологического раствора пестиком в ступке или стеклянной палочкой в пробирке, а затем к суспензии частями добавляют необходимый объем физиологического раствора.

За животными ведут наблюдение в течение 3 месяцев. При гибели животных в течение срока наблюдения проводят вскрытие трупов. При отсутствии падежа животных убивают через 3 месяца после заражения.

Определение вида микобактерий туберкулеза проводят на основании результатов патолого-анатомических исследований зараженных животных.

Возбудитель туберкулеза бычьего вида вызывает у морских свинок и кроликов генерализованный процесс в период от 20-х до 90-х суток после введения культуры. У морских свинок в регионарных к месту введения паховых лимфатических узлах на разрезе обнаруживают казеозные очаги. Аналогично поражены и другие лимфатические узлы. Селезенка и печень увеличенные, плотные, с серо-белыми или серо-жел- тыми мелкими сливающимися узелками, в легких множество серо-белых очажков.

У кроликов резко увеличены легкие, в них множество очажков, часто с наличием некрозов. В печени и селезенке поражения наблюдаются чаще в виде отдельных небольших узелков. В почках могут развиваться очаговые поражения.

Микобактерии человеческого вида вызывают у мор-

ских свинок генерализованный туберкулез, а у кроликов про-

31

грессирующий процесс не развивается. Единичные очажки можно обнаружить в легких и редко в почках, чаще поражения отсутствуют.

Микобактерии туберкулеза птичьего вида у мор-

ских свинок, как правило, вызывают только абсцесс в месте введения культуры и увеличение регионарного пахового лимфатического узла, у кроликов – сепсис, характеризующийся резким увеличением селезенки и гибелью животных в течение 10-30 суток, а у кур гибель в течение 30 суток. Иногда куры выживают до 2-3 месяцев. У кур, павших в ранние сроки, на вскрытии находят резкое увеличение селезенки и печени, при микроскопии обнаруживают обилие кислотоустойчивых микобактерий. У кур, убитых через 3 месяца после заражения, на вскрытии находят множественные серо-желтые бугорки в печени и селезенке, а в окрашенных по Цилю-Нильсену мазках из органов – микобактерии туберкулеза.

Микобактерии туберкулеза человеческого и бычьего видов при внутривенном заражении кур не вызывают у них заболевания и каких-либо изменений в органах.

Принадлежность микобактерий туберкулеза к тому или иному виду определяют по следующим данным:

•при генерализованном процессе у морских свинок и кроликов – бычий вид;

•при отсутствии поражений или наличии единичных типичных очажков в легких у кроликов и генерализованном процессе у морских свинок – человеческий вид;

•при наличии поражений у кур и септического процесса

укроликов – птичий вид.

1.6.2. Гистологический метод

Гистологическое исследование проводят для дифференциации патолого-анатомических изменений, типичных для туберкулеза, и сходных изменений, наблюдаемых при других болезнях.

32

Присланный для гистологического исследования патологический материал осматривают, подозрительные участки тканей вырезают вместе с прилегающей нормальной тканью и помещают для фиксации в 10%-й раствор формалина при комнатной температуре на 3-5 суток. Из фиксированного материала вырезают небольшие кусочки, отмывают их в течение 2-3 ч в проточной воде, подвергают целлоидиновой или парафиновой­ проводке, наклеивают на блоки и готовят срезы толщиной 1015 мкм. Для ускорения гистологического исследования можно готовить срезы из отмытых от формалина кусочков на замораживающем микротоме. Срезы окрашивают гематоксилин-эо- зином и при необходимости по Цилю-Нильсену.

Вположительных случаях при гистологическом исследовании в тканях находят гранулемы с некротизированным центром, окруженные зоной эпителиоидных, отдельных гигантских и лимфоидных клеток и соединительнотканной капсулой.

Вспецифической капсуле, как правило, формируются дочерние резорбтивные узелки.

При дифференциальной диагностике следует учитывать гранулемы, образующиеся при актиномикозе, нокардиозе, коринебактериозе, паразитарных поражениях, паратуберкулезе.

Вгранулемах микотического происхождения находят в некрозе мицелий гриба, паразитарных – тело паразита и эози- нофильно-клеточную пролиферацию в капсуле.

При паратуберкулезе наблюдают в брыжеечных лимфатических узлах и кишечной стенке эпителиоидно-клеточную пролиферацию без образования некрозов.

33

1.6.3. Молекулярно-генетический метод исследования (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является молеку- лярно-генетическим экспресс-методом исследования, основанным на обнаружении в исследуемом материале специфического фрагмента ДНК, характерного только для определенного вида возбудителя. Принцип ПЦР заключается в выделении и многократном повторении циклов амплификации (копирования) специфического фрагмента ДНК возбудителя в исследуемой пробе и выявлении его с помощью электрофореза в агарозном геле или другим способом.

ПЦР применяют при постановке диагноза на туберкулез:

•у крупного рогатого скота – при отсутствии видимых изменений или возникших затруднениях в определении характера патолого-анатомических изменений;

•у других видов млекопитающих животных – независимо от характера патолого-анатомических изменений;

•у птиц – при отсутствии видимых изменений или возникших затруднениях при определении характера изменений.

ПЦР применяют также для определения видовой принадлежности выделенных микобактерий.

1.6.4. Реакция ингибирования миграции лейкоцитов (РИМЛ)

Метод основан на том, что выход лейкоцитов из капилляров больного туберкулезом животного, предварительно отмытых и помещенных в миграционную камеру с питательной средой, замедляется в присутствии специфического антигена (ППД-туберкулина), в то время как лейкоциты здоровых животных свободно мигрируют из них. Механизм реакции заключается в выделении лимфоцитами периферической кро-

34

ви больных туберкулезом животных биологически активного гликопротеида, угнетающего миграцию лейкоцитов из капилляров. Биологическое значение указанного феномена заключается в задержке миграции лейкоцитов из очага воспаления, которая, возможно, способствует также активации макрофагов.

РИМЛ обладает выраженной специфичностьюи высокой чувствительностью и может использоваться как дополнительный метод в диагностике туберкулеза животных; при контроле благополучия стад; в научных целях – при изучении вопросов патогенеза иммунного ответа при туберкулезе, для контроля иммуногенности препаратов, обладающих лимфокининдуцирующими свойствами.

1.6.5. Серологические методы диагностики туберкулеза

В настоящее время в качестве дополнительных серологических методов диагностики применяются реакция связывания комплемента (РСК), реакция иммунофлюоресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА).

1.6.5.1. Реакция связывания комплемента (РСК)

РСК основана на том, что при взаимодействии в системе «антиген –антитело» (АГ+АТ) при наличии комплементарности (родства между АГ и АТ) образуется специфический иммунный комплекс, который адсорбирует комплемент. При отсутствии специфического родства между АГ и АТ образование иммунного комплекса не происходит, и комплемент остается свободным. Образование комплекса визуально не видно. Для индикации ярко выраженной реакции подключают гемолитическую систему – эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. В присутствии комплемента эритроциты барана лизируются гемолитической сывороткой и окрашивают пробу в кровянистый цвет – это отрицательная РСК. При отсутствие

35

гемолиза – положительная РСК.

ЭффективностьРСКвомногомзависитоткачестваантигена и способа постановки реакции. Наибольшее распространение получили антигены, предложенные Ю.Я.Кассичем (антиген КТА УНИИЭВ) и Э.Д.Лакман (антиген СибНИВИ). Эти же антигены могут использоваться и в других серологических реакциях – РДСК, РНГА, РИД (РДП), но чувствительность и специфичность этих реакций могут существенно отличаться.

1.6.5.2. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

РИФ может применяться как для прижизненной, так и посмертной диагностики туберкулеза. С ее помощью можно проводить индикацию возбудителей туберкулеза и атипичных микобактерий.

При помощи меченных флюорохромами специфических антител в испытуемом материале находят соответствующие антигены.

Различают два метода окрашивания препарата люминесцирующими антителами: прямой и непрямой.

При прямом методе препарат одноэтапно окрашивают флюоресцирующей специфической искомому антигену сывороткой. При положительной реакции образуется между меченым антителом и антигеном светящийся комплекс, просматриваемый в люминесцентном микроскопе в виде ярких желтовато-зеленых образований (если краситель – изоционат флюоресцеин).

Непрямой метод – двухэтапный: на первом этапе происходит реакция между антигеном и обычной (кроличьей) неокрашенной иммунной сывороткой, а на втором этапе на препарат наносят флюоресцирующую иммунную сыворотку против гамма-глобулина кролика. При положительном результате образовавшийся комплекс «антиген – антитело» начинает светиться при просмотре в люминесцентном микроскопе.

36

При сравнительной оценке прямого и непрямого способов окрашивания туберкулезного антигена флюоресцирующими антителами существенной разницы в чувствительности и специфичности ученые не обнаружили.

1.6.5.3. Иммуноферментный анализ (ИФА)

ИФА – метод ферментзависимого иммуносорбентного анализа (ELIZA). Применяется для выявления гуморальных антител при туберкулезе.

Принцип иммуноферментного метода заключается в специфическом взаимодействии антител, меченных ферментом, с антителами к испытуемому антигену, в результате чего достигается индикация образовавшегося комплекса «антиген

– антитело». В реакции энзиммеченых антител применяют различные ферменты: пероксидазу хрена, кислую и щелочную фосфатидазу, глюкооксидазу, лактатдегидрогеназу. Наиболее часто применяется иммунопероксидазная методика.

После инкубации исследуемого материала (1 ч при 37°С) из него готовят мазки, добавляют иммунопероксидазный конъюгат. Несвязавшиеся меченые антитела отмывают и окрашивают препарат особым красителем (диаминобензидином). Результаты учитывают по образованию коричневых гранул в цитоплазме инфицированных клеток в обычном световом микроскопе. При окраске жидких материалов степень окраски определяют с помощью спектрофотометра. Для точности диагноза исключительное значение имеют активность пероксидазы и степень ее очистки. Исключают также неспецифические реакциизасчетэндогеннойпероксидазы,действиекоторойподавляют азидом натрия или другими реагентами.

ИФА имеет высокую чувствительность, непродолжительное время постановки реакции, но из-за ряда трудностей, связанных с отсутствием высококачественных туберкулезных антигенов, конъюгатов и реагентов, специального оборудова-

37

ния (пипеточные дозаторы, иммуноферментный анализатор и др.), не нашел широкого применения в диагностике туберкулеза животных.

1.7.Сроки исследования на туберкулез

иоснования для подтверждения диагноза

Лабораторные исследования на туберкулез проводятся в срок до 6 месяцев.

Лабораторный диагноз на туберкулез у млекопитающих животных считается установленным в следующих случаях:

-получен положительный результат полимеразной цепной реакции (ПЦР) и из исследуемого материала выделена культура микобактерий туберкулеза бычьего, человеческого или птичьего вида со свойствами, характерными для этих возбудителей болезни;

-получен положительный результат биологического исследования на туберкулез.

Лабораторный диагноз на туберкулез у птиц считается установленным в следующих случаях:

-при обнаружении микобактерий в мазках из патологического материала при бактериоскопическом исследовании или положительных результатах ПЦР;

-из исследуемого материала выделена культура микобактерий птичьего вида (от попугаев – птичьего или человеческого видов).

О результатах лабораторного исследования ветеринарные лаборатории обязаны сообщить специалистам хозяйств, руководству предприятий и организаций, приславшим материал, и одновременно главному ветврачу района (города) по местонахождению хозяйства. Ответ дается по утвержденной форме, в нем должны быть подробно и понятно указаны результаты проведенных исследований и конкретное заключение лаборатории о наличии или отсутствии туберкулеза.

38

Занятие 2. ПРОФИЛАКТИКА И МЕРЫ БОРЬБЫ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ

Цель занятия: ознакомить студентов с основными правилами профилактики и мерами борьбы с туберкулезом животных:

-профилактика туберкулеза сельскохозяйственных животных;

-эпизоотологический контроль за туберкулезом животных в России;

-оздоровительные мероприятия в неблагополучных по туберкулезу животноводческих хозяйствах.

2.1. Требования по профилактике туберкулеза животных и человека

Владельцы животных, руководители хозяйств, независимо от форм собственности, фермеры, арендаторы и другие лица обязаны:

-при наличии или приобретении животных произвести их регистрацию в ветеринарном учреждении, получить регистрационный номер в форме бирки и следить за его сохранностью;

-покупку, продажу, сдачу на убой, выгон, размещение на пастбищах, все другие перемещения и перегруппировки животных, реализацию животноводческой продукции проводить только с ведома и разрешения органов государственной ветеринарной службы;

-оборудовать необходимые объекты ветеринарно-сани- тарного назначения;

-соблюдать меры предосторожности при заготовке кормов с целью исключения их инфицирования;

-карантинировать в течение 30 дней вновь поступивших животных для проведения ветеринарных исследований и обработок;

39

-своевременно информировать ветеринарную службу о всехслучаяхзаболеванияживотныхсподозрениемнатуберкулез (потеря упитанности, признаки воспаления легких, увеличение поверхностных лимфатических узлов);

-предъявлять по требованию ветеринарных специалистов все необходимые сведения о приобретенных животных и создавать условия для проведения их осмотра, исследований и обработок;

-соблюдать зоогигиенические и ветеринарные требования при перевозках, содержании и кормлении животных, строительстве объектов животноводства;

-осуществлять своевременную сдачу больных животных или полную ликвидацию всего неблагополучного поголовья по указанию ветеринарных специалистов;

-обеспечивать проведение ограничительных, организа- ционно-хозяйственных, специальных и санитарных мероприятий по предупреждению заболевания животных туберкулезом,

атакже по ликвидации эпизоотического очага в случае его возникновения с выделением необходимых материально-техниче- ских и финансовых средств.

Лица, обслуживающие животных в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах, должны быть ознакомлены с правилами личной профилактики и привиты против туберкулеза. Каждые 6 месяцев они должны проходить медицинский осмотр с обязательным рентгенологическим исследованием.

Руководители хозяйств обязаны:

-установить по согласованию с центрами санитарноэпидемиологического надзора порядок обследования на туберкулез всех лиц, занятых на работах в животноводстве и кормопроизводстве;

-обеспечить всех работников животноводства спецодеждой и обувью, оборудовать помещения для ее хранения,

атакже иметь в животноводческих помещениях умывальники,

40