Диагностика, профилактика и меры борьбы при туберкулезе сельскохозяйственных животных. Методическое пособие

собой серые полупрозрачные узелки размером от булавочной головки до чечевичного зерна. Затем они мутнеют и становят- сябело-желтогоцвета,заполняющаяихнекротизированнаясу- хая крошковатая масса напоминает творог.

У взрослого крупного рогатого скота чаще всего поражаются легкие, лимфатические узлы головы и легких, а у молодняка – брыжеечные лимфатические узлы.

В легких очаги поражения обычно выделяются над легочной плеврой, чаще по тупому краю. Очаги бывают различной величины, плотные, с творожистым некрозом и перифокальным воспалением.

Печень, почки, селезенка и молочная железа поражаются обычно при генерализации туберкулезного процесса.

Туберкулезные поражения серозных покровов (жемчужница) встречаются с одновременным поражением паренхиматозных органов и региональных лимфатических узлов.

При милиарном туберкулезе (наблюдается в основном у молодых и истощенных животных) в различных органах и лимфатических узлах обнаруживают многочисленные плотные узелки величиной с просяное зерно.

Мелкие туберкулезные узелки следует отличать от гранулем паразитарного, микотического и иного происхождения. Микотические гранулемы макроскопически трудно отличить от туберкулезных. Узелки паразитарного происхождения содержат некротическую массу, легко выдавливающуюся; внутренняя поверхность капсулы таких узелков блестящая и гладкая.

При заражении крупного рогатого скота микобактериями туберкулеза человеческого и птичьего видов патолого-анато- мические изменения обнаруживают редко.

Изменения при туберкулезе у животных других видов имеют некоторые особенности. У свиней чаще находят обызвествленные инкапсулированные единичные или конгломери-

21

рующие некрозы в лимфатических узлах головы и брыжейки, редковлегкихипечени.Умараловипушныхзверейрегистрируют генерализованный процесс с образованием множественных туберкулов. У птиц чаще всего обнаруживают поражение печени, селезенки и кишечника.

В случае отсутствия у крупного рогатого скота видимых изменений или возникших затруднениях в определении характера патологических изменений послеубойный материал направляют для лабораторного исследования. От свиней и птиц материал отбирают независимо от характера патологических изменений, обнаруженных в органах и тканях.

Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности. Для бактериологического исследования направляют от млекопитающих лимфатические узлы: заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, средостенные, брыжеечные; лимфатические узлы, взятые в области илеоцекального соединения и подвздошной кишки, упаковывают отдельно от остальных лимфатических узлов. Портальные, предлопаточные, надвыменные, поверхностные паховые лимфатические узлы и внутренние органы (легкие, печень, почки) направляют только при наличии туберкулезных изменений.

Парные лимфатические узлы отбирают оба, указав их название на этикетке, которую помещают вместе с пробой.

Трупы (тушки) птиц в лабораторию направляют целиком. Пробы патологического материала, отобранные для бактериоскопического,культуральногоибиологическогоисследований, доставляют в лабораторию в свежем или замороженном виде. Для гистологического исследования отбирают кусочки патологически измененных органов и фиксируют их в 10 %-м нейтральном водном растворе формалина. Пробы хранят до

окончания лабораторного исследования.

На отправляемый в лабораторию материал составляют сопроводительный документ установленной формы с указани-

22

ем результатов аллергических и патолого-анатомических исследований.

1.6. Лабораторные методы диагностики

1.6.1. Бактериологический метод

Бактериологическое исследование материала и идентификация выделенных культур микобактерий имеют решающее значение для правильной оценки эпизоотической ситуации и проведения оздоровительных мероприятий, тем более что туберкулез крупного рогатого скота может протекать в форме латентного микробизма, когда в организме отсутствуют пато- лого-анатомические изменения, хотя животное заражено возбудителем туберкулеза.

Лабораторная диагностика туберкулеза в настоящее время необходима и в связи с сенсибилизацией сельскохозяйственных животных и птицы атипичными и сапрофитными микобактериями. Только бактериологический метод исследований материала от животных и птицы, павших или убитых с диагностической целью, дает возможность достоверно установить причину их сенсибилизации и, соответственно, аллергическую реакцию на туберкулин. При бактериологическом исследовании используют бактериоскопический, культуральный, биологический и биохимические методы.

1.6.1.1. Бактериоскопический метод

Преимущество бактериоскопического метода состоит в скорости и легкости его проведения. Однако при бактериоскопии мазка микобактерии могут быть обнаружены только в случае, если их количество в 1 мл патологического материала составляет 100000 и более. Этот метод не позволяет дифференцировать вид находящихся в мазке микобактерий.

Материалом для такого исследования являются поражен-

23

ные ткани, мокрота, молоко, фекалии, гной, моча и сперма животных, а также смывы с объектов внешней среды. Патологический материал для исследования в лабораторию доставляют в свежем виде в стерильной посуде. В летнее время его можно отправлять в термосе со льдом. Допускается также консервация проб 30 %-м стерильным водным раствором химически чистого глицерина. Пробы молока берут из всех четвертей вымени в количестве 150 - 200 мл. Перед взятием их вымя обмывают теплой водой с мылом, соски вымени дезинфицируют 50 %-м этиловым спиртом, протирают стерильной ватой или свежепроглаженным полотенцем. Первые струи молока выдаивают в отдельную посуду, а последующие – в стерильную бутылку. Для взятия мокроты полость рта коровы освобождают от остатков корма, принудительно выпаивая ей бутылку воды, затем для вызывания кашля нос и рот животного обматывают куском полотна, сжимая при этом носовые отверстия,

инадавливают на гортань. После кашля на полотне остается немного мокроты, которую собирают в стерильную пробирку

изакрывают стерильной резиновой пробкой. Кроме указанного метода, имеются еще и другие способы отбора мокроты, но они более трудоемки.

Микобактерии обнаруживают в виде тонких прямых или изогнутых красных неравномерно прокрашенных палочек (окраскапоЦилю-Нильсену).Атипичныемикобактерии– толстые, грубые, короткие (или длинные) незернистые палочки. Однако морфологические признаки микобактерий нестабильны, они изменяются в зависимости от многих факторов. Поэтому чрезвычайно трудно бактериоскопически дифференцировать атипичные микобактерии от возбудителей туберкулеза.

Иногда важно знать, находятся ли в препарате живые микобактерии или погибшие. Решить такой вопрос невозможно путем окраски их по Цилю-Нильсену. Для этой цели предложен цитохимический метод определения жизнеспособности

24

микобактерий. Он заключается в различной окрашиваемости нативной и деполимеризованной ДНК микробной клетки.

1.6.1.2. Культуральный метод

Культуральный метод имеет ряд преимуществ перед бактериоскопическим, поскольку с его помощью можно выделить из патологического материала культуру микобактерий, если в 1 мл его имеется 20 - 100 микобактерий. Он дает возможность также выделить чистую культуру микобактерий и определить видовую принадлежность, что имеет большое значение в эпизоотологии туберкулеза. Недостаток культурального метода обусловлен продолжительностью роста видимых колоний микобактерий. В первичных посевах человеческий вид растет около 90 дней, бычий – 60, птичий – 30, атипичные

исапрофитные – от 3 дней до полутора месяцев. Кроме того, при обработке патологического материала кислотами, щелочами или другими препаратами с целью уничтожения побочной микрофлоры маложизнеспособные микобактерии погибают, и посевы дают отрицательные результаты.

Цель культурального исследования – выделение из патологического материала культуры микобактерий и определение ее вида.

Появление первичного роста микобактерий туберкулеза на различных питательных средах во многом зависит от количества и жизнеспособности микобактерий, находящихся в исследуемом материале. Для нормального роста культур микобактерий большое значение имеют наличие достаточной влажности среды, а также соответствие и постоянство температуры

ирН среды. М. bovis в первой генерации растет на плотных яичных средах скудно. Рост появляется обычно на 30 - 60-е сутки в виде мелких, круглых, влажных, почти прозрачных колоний цвета слоновой кости (R-форма). Оптимальная температура роста 37 … 38°С. Глицерин задерживает рост культуры,

25

поэтому на плотных яичных средах, содержащих глицерин, она растет очень плохо или вообще не растет. На мясопептонном агаре и бульоне, а также на яичных средах при комнатной (18 … 22°С) и повышенной (45°С) температуре культура не растет. Поскольку М. bovis является микроаэрофилом, то на среде Сотона с сывороткой и агаром колонии микобактерий растут на глубине 9 - 20 мм от поверхности среды. На жидких питательных средах они образуют нежную пленку. При пассаже культура растет быстрее (на 15 - 30-е сутки инкубации).

М. tuberculosis в первой генерации растет медленно. На плотных яичных средах рост появляется на 20 - 30-е сутки в виде сухих, неправильной формы колоний, напоминающих бородавки или миниатюрные кочаны цветной капусты (R-форма). В редких случаях колонии могут быть гладкими (S-форма). Оптимальная температура роста 37 … 38°С. Глицерин содействует росту культур. Но без глицериновой плотной яичной среды культура растет скудно или вообще не растет. На мясопептонном агаре и бульоне, а также при комнатной и повышенной (45°С) температуре она также не растет. М. tuberculosis – аэроб, на среде Сотона с сывороткой и агаром растет на поверхности или в верхних слоях среды. На жидких питательных средах рост микобактерий появляется к 15 - 30-м суткам инкубации в виде мелких крупинок на дне пробирки, в прозрачной среде, или в виде пленки на поверхности жидкости, которая затем утолщается и приобретает морщинистый вид. Достигнув стенки пробирки, пленка поднимается по стеклу. На картофельной среде Павловского М. tuberculosis дает плотный рост – толстые складчатые слои; на глицериновой воде – в виде пленки.

Как M. bovis, так и М. tuberculosis при выращивании в кровяной или полусинтетической средах на предметных стеклах, начиная с 7-х суток инкубации, образуют характерные микроколонии в виде кос или жгутов, которые в дальнейшем

26

заметно увеличиваются, образуя сплетения жгутов или кос. Образование жгутов и кос обусловлено корд-фактором, способствующим склеиванию микобактерий и наблюдающимся, почти без исключения, только у штаммов М. bovis и М. tuberculosis.

М. avium растет на плотных яичных средах в первой генерации, начиная с 20-х суток инкубации, в виде гладких, влажных, блестящих колоний (S-форма) цвета слоновой кости. У культур старше 1,5 - 2 месяцев появляются кольцеобразные колонии с валикообразными краями. М.аvium растет как при 37 … 38°С, так и при 45°С и очень часто – при комнатной температуре (18 … 22°С). При длительном хранении, в частности на свету и при комнатной температуре, культуры могут окрашиваться в желтый цвет. Примерно половина штаммов М. avium растет на мясопептонном агаре и бульоне. В жидких питательныхсредахштаммыМ.avium наднепробиркиобразуют микроколонии в виде ватообразного осадка. При микроскопировании микроколоний в препаратах-мазках обнаруживают звездчатые или отдельные округлые кучки с беспорядочно расположенными палочками. При пассаже рост культуры появляется на 10 - 14-е сутки инкубации а виде влажного налета цвета слоновой кости.

Характерными особенностями наиболее часто встречающихся атипичных микобактерий являются скорость роста и температурный режим. Большинство атипичных микобактерий растут при 25 … 45°С, и первичный рост наблюдается на 2-10-й день после посева.

Следует отметить, что результат бактериологического исследования на туберкулез зависит от многих факторов. Так, большое значение имеют правильность и своевременность отбора патологического материала.

Для лабораторного исследования следует отбирать заглоточные, подчелюстные, средостенные, портальные, брыжееч-

27

ные, в том числе находящиеся в области илеоцекального соединения и подвздошной кишки, надвыменные, предлопаточные и коленной складки лимфатические узлы, а также кусочки органов с изменениями, похожими на туберкулезные.

На высеваемость микобактерий оказывает влияние также качество питательных сред. Поэтому для получения более достоверного результата при исследовании патологического материала желательно использовать две разные среды.

Следует также подчеркнуть, что от одного животного иногда удается одновременно выделить две разные культуры микобактерий. Поэтому при выделении из исследуемого материала культуры быстрорастущих микобактерий бактериологическое исследование необходимо продолжать до 3 месяцев, чтобы не пропустить роста медленнорастущих микобактерий.

1.6.1.3. Биологический метод

Наиболее чувствительным из вышеперечисленных методов является биологический, позволяющий обнаружить туберкулез у исследуемого животного даже если во взятом материале (1 мл) имеются лишь единичные экземпляры микобактерий. Однако бывают случаи, когда из-за снижения вирулентности микобактерий туберкулеза для лабораторных животных под влиянием химиопрепаратов посев из патологического материала может дать положительный результат при отрицательном исходе биопробы.

Выявление возбудителя туберкулеза в биологическом материале проводят параллельно с культуральным исследованием путем введения посевной суспензии трем морским свинкам. Определение видовой принадлежности микобактерии проводят путем введения первичных культур трем морским свинкам, трем кроликам и при необходимости – трем курам.

Лабораторных животных (морских свинок, кроликов, кур), используемых для исследования, проверяют аллерги-

28

чески туберкулином. Морских свинок и кроликов исследуют ППД-туберкулином для млекопитающих, кур – ППДтуберкулином для птиц.

Накануне исследования у свинок на боку выщипывают или выбривают шерсть. ППД-туберкулин для млекопитающих вводят внутрикожно в дозе 25 МЕ (международных единиц) в объеме 0,1 мл растворителя или стерильного физиологического раствора. Реакцию на туберкулин учитывают через 24 ч. Положительная реакция проявляется гиперемией кожи в месте введения туберкулина и образованием уплотненной припухлости диаметром 5 мм и более, иногда с некрозом в центре. Кроликам туберкулин в дозе 50 МЕ в 0,1 мл вводят в кожу наружной поверхности уха. Реакцию учитывают через 24 и 48 ч. Положительная реакция проявляется гиперемией кожи диаметром от 5 мм и более и образованием припухлости в месте введения туберкулина.

Курам вводят 0,1 мл ППД-туберкулина для птиц внутрикожно в бородку, реакцию учитывают через 30-36 ч. Положительная реакция характеризуется опуханием бородки.

Биопробу проводят на животных, не реагирующих на введение туберкулина. Биопробу ставят с материалом от каждого животного в отдельности, иногда допускается составлять общую пробу не более чем от двух животных одного стада. Этот метод дает положительные результаты при наличии в инъецируемом материале единичных клеток микобактерий туберкулеза.

Для постановки биопробы берут трех морских свинок массой 300-500 г (желательно светлой масти). Взвесь материала, использованного для посевов на питательные среды и нейтрализованного 10%-м раствором аммиака или 10%-м стерильным водным раствором двууглекислой соды до получения рН 7,0-7,2, отстаивают до оседания крупных частиц и образовавшуюся надосадочную суспензию в дозе 1-2 мл вводят мор-

29

ским свинкам подкожно в области паха.

При развитии туберкулезного процесса у морских свинок через 14-28 суток в месте инъекции материала наблюдают увеличение и уплотнение регионарного лимфатического узла, уплотнение кожи, а затем образование язвы. Свинки прогрессивно худеют. Туберкулез у морских свинок может протекать без проявления клинических симптомов.

За животными ведут наблюдение в течение трех месяцев. При гибели морских свинок в течение срока наблюдения проводят вскрытие трупов и патолого-анатомическое исследование. При отсутствии падежа свинок убивают через 3 месяца после заражения и проводят патолого-анатомическое исследование.

Из участков органов и лимфатических узлов готовят мазки и окрашивают по Цилю-Нильсену. При положительном результате бактериоскопии материала дают положительное заключение на туберкулез.

Для определения вида возбудителя туберкулеза, выделенного при культуральном исследовании, заражают трех морских свинок, трех кроликов и при необходимости трех кур. Биопробу ставят отдельно с каждой культурой.

Для постановки биопробы берут кроликов массой не менее 2 кг, морских свинок массой 300-500 г и кур не моложе 5 месяцев.

Заражение животных проводят 3-4- недельной культурой: морских свинок – подкожно, кроликов – внутривенно в краевую вену уха, кур – внутривенно в подкрыльцовую вену или внутримышечно в область грудины в дозах по 1 мг микобактерий, суспендированных в 1 мл физиологического раствора.

Для приготовления суспензии бактериальную массу в количестве 8-10 мг снимают шпателем с поверхности плотной питательнойсредыи,соблюдаямерыпредосторожности,пере-

30