Ветеринарная радиобиология. Учебное пособие

з районах с их повышенным содержанием в кормах. Радионуклиды церия -141-144, иттрия - 91, бария - 140, йода -131, рутения - 103-106,

циркония-95 определяют в случае "свежих" выпадений радиоактивных осадков после проведения атомных испытаний или загрязнения сельскохозяйственных угодий продуктами ядерного деления в результате незапланированных выбросов (аварий) на ядерноэнергетических предприятиях. На содержание трития исследуют только продукты и сырье животного происхождения, зерно-фураж, ввозимые из-за рубежа.

Радиологические отделы на основании радиохимических, спектрометрических и радиометрических исследований дают заключение на пригодность к использованию отечественной и импортной сельхозпродукции (фураж, продукты и сырье животноводства).

Все операции радиационной экспертизы радиологические отделы выполняют в соответствии с Инструктивно-методическими указаниями по радиохимическим методам определения радиоактивности в объемах ветеринарного надзора, утвержденными Главным управлением ветеринарии.

Основы радиохимического анализа.

Радиохимический анализ состоит из ряда последовательных этапов, основными из которых являются: отбор и подготовка проб исследуемых объектов, переведение зольных остатков проб с растворенное состояние, разделение радиоактивных элементов на химические группы, выделение и химическая очистка интересующего радионуклида, его радиометрия, определение радиоактивности пробы и статистическая обработка полученных результатов.

Радиоактивные изотопы обладают теми же химическими свойствами, что и стабильные, и поэтому выделяют их из пробы так же, как и стабильные изотопы тех же элементов, применяя соответствующие методы аналитической химии. Значительные трудности возникают при этом в связи с тем, что радионуклиды содержатся в исследуемом материале в очень малых весовых количествах. Свойства вещества в таких ультрамалых количествах могут отличаться от свойств того же вещества, содержащегося в больших количествах. Эти особенности радиохимического анализа учитывают уже при отборе проб. Объем (масса) отбираемого материала должен обеспечивать возможность выделения радионуклида из пробы в достаточном количестве. Для этого следует ориентироваться на количественный выход золы при обогащении пробы путем ее озоления. В среднем на один радиохимический анализ требуется 10-50 г золы исследуемой пробы. Используемые для определения того или иного радионуклида методические приемы должны учитывать как специфическую осо-

81

бенность исследуемых проб, так и характер и степень их радиоактивного загрязнения.

От правильного выполнения первых этапов радиохимического анализа во многом зависит объективность данных о концентрации радионуклидов в исследуемых объектах. Поэтому непременным условием качественного выполнения радиохимического исследования является четкое выполнение правил отбора проб и их последующей обработки, включая переведение золы пробы в растворенное состояние.

Важно соблюдать режим термической обработки исследуемого материала. Высушивание рекомендуется проводить при 80-100°С до постоянной массы, т.е. до совпадения 2-3 показаний взвешивания высушенного материала; продолжительность высушивания около 1 часа после каждого контрольного взвешивания, которое проводится после охлаждения пробы до комнатной температуры.

Особенно важно соблюдать температурный режим при озолении пробы. Озоление проводят в муфельной печи после обугливания высушенной пробы на электроплитке или газовой горелке. Некоторые радионуклиды (йод - 131, цезий - 137, калий -40) возгоняются при высоких температурах. Так, например, сублимация цезия - 137 происходит при температуре 450°С и выше. Поэтому пробу для анализа на цезий - 137 следует озолять при температуре не выше 400°С. Для выделения из пробы только стронция - 90 (из кости) озоление можно проводить при температуре 500-600°С, т.к. стронций не разрушается от действия этих температур, а возгонка из зольного остатка калия - 40, цезия -137 и других термолабильных радиоизотопов в данном случае даже желательна, т.к. это способствует получению радиохимического чистого стронция - 90.

В связи с особенностями поведения ультрамалых количеств радионуклидов в сравнении с известными для данных элементов свойствами в ходе химического анализа применяют носители, которые вводят в пробу в начале анализа.

Доозоленяе и переведение золы в раствор.

При недостаточно полной минерализации зольного остатка (зола имеет темный или темно-серый цвет) перед проведением анализа проводят доозоление его, чтобы предотвратить потери радиоизотопов при растворении золы. Для этого взятую на анализ навеску золы 20-30 г помещают в фарфоровую чашку или термостойкий стакан, вносят растворы носителей определенных радионуклидов, увлажняют концентрированной азотной кислотой с добавлением 2-3 мл пергидроля до кашицеобразной консистенции и выпаривают досуха на электроплитке или газовой горелке. Надо следить, чтобы было именно выпа-

82

ривание при слабом нагреве, а не прокаливание высокой температурой, так как может произойти спекание зольного остатка.

После выпаривания чашку помещают в муфельную печь с температурой 300-350°С на 20 мин. Затем чашку с пробой золы охлаждают и операцию доозоления повторяют не менее 2 - 3 раз для растительных проб, а для золы молока, мяса, костей - до светло-серого цвета золы. После процесса доозоления золу обрабатывают один раз концентрированной соляной кислотой из расчета 2-3 мл соляной кислоты на 1 г золы. Кислоту выпаривают досуха. Этот прием проводится для того, чтобы перевести содержащиеся в золе минеральные вещества в солянокислые соли (хлориды).

Далее, чтобы проводить радиохимический анализ пробы по выделению радионуклидов, надо перевести соли, содержащиеся в золе, в растворенное состояние. Проводят процедуру переведения золы в раствор. Применяют жесткие условия - высокую температуру (длительное кипячение), перемешивание, воздействие сильными кислотами (соляная, азотная) в высококонцентрированных растворах. Несмотря на это, есть золы, которые можно полностью растворить (зола костей, молока), но большинство зольных остатков проб объектов не растворяются. В связи с этим применяют два метода - растворение золы, экстрагирование (вымывание, выщелачивание) золы. В первом случае сухой остаток золы помещают в термостойкий стакан, заливают 200-300 мл 2н раствора соляной кислоты и кипятят 30 мин при периодическом помешивании до полного растворения золы. Можно добавить 1-3 мл перекиси водорода.

При экстрагировании золы сухой остаток помещают также в химический стакан, приливают 200-300 мл 2н раствора соляной кислоты, кипятят 20 - 30 мин.

Нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием через складчатый фильтр. Затем фильтр с осадком переносят в стакан, заливают 100-150 мл 2н раствора соляной кислоты, вновь кипятят 20-30 мин. Раствор отфильтровывают. Осадок на фильтре промывают горячей водой. Фильтраты объединяют и этот раствор используют в анализе, а нерастворившийся осадок на фильтре отбрасывают.

Последовательные приемы при выполнении радиохимического анализа.

При проведении радиохимического анализа пробы исследуемого объекта в определенной последовательности выполняют специальные приемы, направленные на выделение интересующего радиоизотопа в радиохимически чистом виде для установления удельной радиоактивности объекта, обусловленной содержанием данного радионуклида.

83

В самом начале анализа в навеску золы пробы, взятой для анализа, вносят изотопные носители, чтобы они в ходе анализа следовали вместе с радионуклидами, претерпевая те же химические превращения и отражая неизбежные потери. Удерживающие носители можно вносить и в процессе анализа на этапе радионуклида. Например, перед отделением иттрия - 90,отлантана-90 вносят носитель лантана. При необходимости проводится доозоление пробы.

Далее, учитывая, что химические реакции протекают в водных растворах веществ, осуществляют перевод химических веществ, содержащихся в золе пробы, в растворенное состояние (растворенные золы).

Так как кислотный раствор золы представляет собой сложную по минеральному составу систему, на следующем этапе проводят разделение химических элементов на химические группы, применяя специфические реагенты с учетом характерного поведения элементов в данной реакции. Например, элементы второй и третьей аналитических групп (кальций, стронций, барий, иттрий, лантан) при взаимодействии с ионами щавелевой кислоты образуют нерастворимые в воде соли щавелевой кислоты (оксалаты), а элементы первой группы (калий, натрий, цезий) - растворимые. Поэтому с помощью щавелевой кислоты проводят разделение элементов этих групп путем осаждения оксалатоз второй и третьей групп и последующего отделения их фильтрованием или центрифугированием от элементов первой и других групп. Затем проводят разделение элементов второй и третьей аналитических групп, опять же основываясь на особенностях поведения этих элементов. Известно, что элементы третьей группы (иттрий, лантан и др.) при взаимодействии с щелочами образуют нерастворимые в воде гидроксиды, а образующиеся при этом гидрокеиды элементов второй группы (кальций, стронций, барий и др.) растворимы. Используя водный раствор аммиака, осаждают из смеси гидроксиды элементов третьей группы и отделяют их фильтрованием от растворенных гидроксидов элементов второй группы.

При отделении одних химических элементов от других методом осаждения может проявляться частичное совместное осаждение тех элементов, от которых стремятся отделиться. Это не позволяет выделить элементы в химически чистом виде. Поэтому используют в таких случаях растворение осадка и его переосаждение тем же реактивом, которым осаждали в первый раз. Операция переосаждения может проводиться 2-3 раза. В целях получения более чистого в химическом отношении осадка после отделения его фильтрованием или центрифугированием проводится промывание.

Следующий этап в анализе - выделение интересующего химиче-

84

ского элемента из группы, к которой он относится. Для этого, так как химические свойства элементов и той же аналитической группы очень близки, используют особенности поведения элементов в химических реакциях. Например, лантан, находящийся вместе с иттрием, при взаимодействии с насыщенным раствором сернокислого калия (^04) выпадает в осадок в виде двойных солей сульфатов калия и лантана, а иттрий остается в растворе. Таким приемом отделяют иттрий от лантана. В этом случае с двойной солью сульфата лантана будут осаждаться радиоактивные изотопы церия - 141 - 144, свинца - 210 и других редкоземельных элементов.

Таким образом, ряд последовательных операций выделения и концентрирования радиоактивного элемента, в результате которых достигается отделение основной массы макро-примесей, а затем проведение радиохимической очистки выделяемого элемента с помощью удерживающих носителей позволяет получить радиохимически чистый элемент который подвергается радиометрии.

Радиохимически чистым можно условно назвать препарат, в котором скорость счета от других присутствующих радионуклидов равна или меньше 1% скорости счёта выделяемого радиоизотопа. Проверка радиохимической чистоты каждого выделенного радиоизотопа - обязательный этап радиохимического анализа.

ТЕМА №15. ДИАГНОСТИКА ЛУЧЕВОЙ БОЛЕЗНИ. КЛИНИКО-ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ

И ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ОСТРОЙ ФОРМЕ ЛУЧЕВОЙ БОЛЕЗНИ У ЖИВОТНЫХ

(6 часов). Клиническая характеристика течения острой лучевой болезни у животных.

Цель занятий - изучить клинические проявления острой лучевой болезни в зависимости от дозы, мощности и времени после воздействия ионизирующей радиации.

Содержание занятий.

Дать определение лучевой болезни и ее форм - острой и хронической, - описать причины их возникновения. Кратко охарактеризовать клиническое течение (периоды) острой лучевой болезни и особенности хронической лучевой болезни. Для лучшего усвоения материала по данной теме целесообразно создать экспериментальную модель острой лучевой болезни на подопытных животных (мыши, крысы, кролики или собаки), подвергнув их облучению разными дозами на рентгеновской или гамма-установке. Облученных и контрольных животных обследовать клинически вразличныепериодылучевой болезни.

85

Порядок выполнения работы.

У животных при внешнем облучении рентгеновским или гаммаизлучением можно вызвать хроническую или острую лучевую болезнь. Хроническая форма развивается в результате многократных облучений малыми дозами, течение длительное. Острая форма развивается в результате однократного воздействия большими дозами облучения.

Вразвитии патологического процесса при острой лучевой болезни выделяют четыре периода:

начальный (первичная общая реакция); скрытый (латентный);

разгара (выраженных клинических признаков); терминальный (исхода болезни).

Начальный период развития лучевой болезни проявляется в виде первичной общей реакции, длится в зависимости от дозы от нескольких часов до 1-2 суток после облучения. Наблюдается вялость, понижение аппетита, иногда жажда и рвота, расстройство пищеварения, повышается температура тела; шокоподобное состояние особенно резко выражено у кроликов (около 30 % облученных животных погибают вскоре после облучения).

Скрытый период тем короче, тем больше доза облучения. Видимые клинические проявления лучевой болезни отсутствуют, однако

вэтот период наблюдаются нарушения физиологических и биохимических процессов в органах кровообращения, кроветворения, пищеварения и др.

Смена первичной реакции периодом мнимого благополучия объясняется включением в патологический процесс защитных механизмов организма.

Период разгара болезни характеризуется появлением либо всего симптомокомплекса лучевой болезни, либо различных комбинаций ее симптомов. В этот период нарушаются все основные биохимические и физиологические процессы: уменьшается масса животных, ухудшается аппетит, снижается реакция на внешние раздражители, возникают точечные и очаговые кровоизлияния, некрозы, изъязвления слизистой глаз и носа, анемия, расстройство функции желудочнокишечного тракта, отек тканей.

Втерминальный период указанные изменения выражены особенно сильно. Появляются многочисленные кровоизлияния под кожей, в легких, сердечной мышце, кишечнике, желудке и других органах. Облученные животные часто страдают от инфекционных заболеваний вследствие ослабления иммунобиологической реактивности организма.

86

Вслучае выживания животных происходит постоянное улучшение их состояния, выздоровление и нормализация основных биохимических и физиологических процессов. При хронической форме лучевой болезни также наблюдается периодичность развития заболевания. Однако в отличие от острой формы первый период, как правило, не улавливается, а латентный период характеризуется большой длительностью.

Течение лучевой болезни в зависимости от дозы и времени после воздействия ионизирующей радиации удобно изучать на белых мышах или крысах. Животных облучают дозами, которые вызывают различную степень тяжести лучевого поражения, и проводят наблюдения в начальный и скрытый периоды лучевой болезни, в разгар болезни и в терминальный период. Так, после облучения дозой 200 Р (нелетальной) животных исследуют в первые часы, затем на 3, 7, 11,

15.20, 30-е сутки; после облучения дозами 300-600 Р (летальных не для всех облученных животных) - в первые часы, на 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 30-е сутки; после облучения дозами 800 Р и выше (летальная для всех облученных животных) - в первые часы, на 1, 2, 3-й сутки, а также незадолго до гибели животных. Дозы облучения и сроки наблюдений могут быть изменены.

Всвязи с дефицитом времени для учебных занятий целесообразно облучать животных дозами 200, 400 и 800 Р в различные сроки до начала занятий (за 2, 7, 15 и 30 суток), чтобы на одном 4- или 6- часовом занятии изучить основные клинические проявления лучевой болезни по периодам.

При обследовании животных определяют их массу, наблюдают за поведением, исследуют состояние слизистых оболочек и кожного покрова, частоту дыхания, характер выделений, прием воды, корма и т. д. Одновременно с клиническими исследованиями проводят анализ крови по периодам лучевой болезни. В случае гибели животных отмечают время, прошедшеепосле облучения, проводятвскрытиеживотных.

Изменения показателей периферическое крови при острой форме

лучевой болезни.

Цель занятия - на основании самостоятельного исследования препаратов (мазков) крови больных животных изучить характер количественных и качественных изменений форменных элементов в различные периоды острой лучевой болезни.

Содержание занятия.

Продемонстрировать мазки периферической крови экспериментальных животных, характеризующие изменения в различные периоды лучевой болезни разной тяжести, показать нарушения белой крови в третий период болезни в виде дегенеративно-деструктивных изме-

87

нений лейкоцитов, наблюдаемых при лучевой болезни.

На занятиях студенты должны самостоятельно изучить изменения скорости оседания эритроцитов (СОЭ), количество гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов, тромбоцитов, вычислить цветной показатель у облученных животных в различные периоды лучевой болезни, сделать мазки крови и определить лейкоцитарную формулу, изучить качественные изменения форменных элементов периферической крови (вакуолизация, распад клеток, гиперсигментоз, анизоцитоз и пойкилоцитоз эритроцитов и др.).

Порядок выполнения работы.

При лучевой болезни раньше всего обнаруживаются изменения со стороны белой крови, несколько позже выявляются нарушения количества тромбоцитов и эритроцитов. Для ранней диагностики наибольшее значение имеет первый период.

Впервые часы и дни после облучения наблюдается нейтрофильный лейкоцитоз (до 20-30 тыс. лейкоцитов в 1 мм3 крови) со сдвигом влево при относительной и абсолютной лимфопении, которая является наиболее ранним показателем. Абсолютная лимфопения отмечена в течение всей болезни.

Во второй период (латентный) гематологические изменения нарастают. Степень лейкопении зависит от тяжести лучевой болезни и является характерной особенностью лучевого поражения. Так, при лучевой болезни средней тяжести количество лейкоцитов уменьшает-

ся до 2000, в период разгара лучевой болезни тяжелой степени этот показатель снижается до нескольких сот и десятков в 1 мм3 крови, вплоть до полного исчезновения.

Втретий период тяжелой формы лучевой болезни развивается резкая лейкопения за счет уменьшения количества нейтрофилов. В этот период наблюдается максимум дегенеративно-деструктивных изменений со стороны лейкоцитов: гиперсегментоз, фрагментоз, гипер- или гипохроматоз ядер и протоплазмы, токсическая зернистость

впротоплазме нейтрофилов.

Следует иметь в виду, что степень тяжести лучевой болезни по характеру изменений только белой крови в начальный период установить трудно. Это связано с тем, что в первый период количество лейкоцитов (нейтрофилов) в периферической крови не бывает постоянным, содержание колеблется в больших пределах, только в более поздние сроки развиваются закономерные изменения в виде прогрессивно нарастающей лейкопении.

Содержание лимфоцитов тоже не может служить достаточным показателем тяжести лучевого поражения. Это зависит от чрезвычай-

88

но высокой чувствительности лимфоцитов уже в первые 18-48 ч как к большим, так и к сравнительно малым дозам ионизирующей радиации. Количество эритроцитов в начальный период не изменяется или несколько увеличивается.

Во второй период количество эритроцитов и содержание гемоглобина существенно не изменяется, однако постепенно начинают выявляться признаки анизоцитоза и пойкилоцитоза эритроцитов и развивается ретикулопения, доходящая до полного исчезновения ретикулоцитов из периферической крови к концу второго периода.

В третий период развивается гипопластическая анемия, чаще всего с макроцитозом, нарастанием цветного показателя и качественных изменений эритроцитов.

В терминальный период, если животные не погибают, восстановление состава периферической крови идет крайне медленно. В этот период возможно то улучшение состава крови, то повторное ухудшение.

Морфологическое исследование крови. Подсчет эритроцитов

Подсчет количестваэритроцитов производитсявкамере Горяева. Перед заполнением камеры Горяева ее и покровное стекло необходимо тщательно вымыть дистиллированной водой, протереть спирт-эфиром и насухо вытереть. Затем шлифовальное стекло тщательно притирают до появления Ньютоновских (радужных) колец, что будет соответствовать необходимой высоте и объему камеры. Кровь для подсчета эритроцитов разводят в меланжере - смесителе

или в пробирке (по Н. М. Николаеву, 1954).

Меланжерный метод разведения. В меланжер для эритроцитов набирают кровь до метки 0,5 или 1 и физиологический (0,85%) раствор до метки 101, при этом получается разведение соответственно в 200 и 100 раз. Затем содержимое меланжера тщательно перемешивают в течение 2-4 мин, после чего из него удаляют 3-4 капли разведенной крови, а пятой каплей заполняют сетки счетной камеры Горяева. Камеру заполняют так, чтобы вся поверхность, на которую нанесена сетка, была заполнена жидкостью без пузырьков воздуха. Затем камеру оставляют на 1 мин в покое до оседания форменных элементов.

Пробирочный метод разведения крови. В сухую чистую про-

бирку вносят 4 мл физиологического раствора и капиллярной пипеткой от гемометра Сали - 0,02 мл (20 мкл) крови. Предварительно кончик пипетки хорошо вытирают, кровь выдувают на дно пробирки и промывают капилляр 2-3 раза этой же жидкостью. Содержимое пробирки хорошо перемешивают, получают разведение крови 1:200. Пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой берут 1-2 капли смеси

89

крови из пробирки и заполняют ими камеру. Эритроциты подсчитывают через 1 мин после заполнения камеры при малом увеличении микроскопа (объектив - 8х, окуляр - 10х или 15х) с полузакрытой диафрагмой или опущенным конденсатором. Счет ведут в пяти больших квадратах (или 80 малых), расположенных по диагонали, или в разных точках сетки камеры с целью получения объективных данных количества эритроцитов. При подсчете учитывают эритроциты, лежащие внутри малого квадрата, а также левой и верхней его линиях. Клетки, находящиеся на правой и нижней линиях квадрата, не считают.

Количество эритроцитов в 1 мкл крови определяют по формуле

Х=A×4000×в/б

где х - количество эритроцитов в 1 мкл крови; а-количество эритроцитов, сосчитанных в 5 большие квадратах;

б - количество малых квадратов в 5 больших (5×16=80); в-степень разведения крови (200 или 100); 4000 - множитель,

приводящий результат к объему 1 мк; крови, так как объем малого квадрата равен 1/4000 мкл.

Количество эритроцитов выражают в 1012/л (табл. 14).

Таблица 14. Количество эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в 1012/л крови здоровых животных (по Л.А. Кудрявцеву и Л.А.Кудрявцевой).

Для подсчета клеток в 1 литре необходимо найденное число умножить еще на 1000000 (1012×л). Ошибка при подсчете может достигать 2-3%. Причинами ошибки могут быть неправильное прижатие покровного стекла - без образования радужных колец; образование сгустков при взятии крови; несвоевременный подсчет эритроцитов - сразу, не выждав 1-2 мин после заполнения камеры; плохо вымытые и недостаточно высушенные капилляры и пробирки; недоброкачественность разводящего' раствора, вызывающая гемолиз эритроцитов, несоблюдение точности насасывания крови, разводящей жидкости до определенных меток меланжеров, капилляров и т.д.

90