Ветеринарная радиобиология. Учебное пособие

Подсчет ретикулоцитов.

Ретикулоинты — молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции, представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.

Подсчет ретикулоцитов производим по методике А.С. Хрусталева в камере Горяева. В меланжер для эритроцитов набираем кровь из ушной вены или стабилизированную до метки 0,5, затем - разводящую жидкость (0,05 % раствор метиленовой сини на физиологическом растворе) до метки 101, получаем разведение в 200 раз, перемешиваем, выпускаем 2-3 капли на ватку, а последующими каплями заряжаем сетки камеры Горяева. После 1-2 мин отстаивания ведем подсчет ретикулоцитов в 225 больших квадратах.

Подсчет на объем 1 ммЗ производим по формуле

Х=A×4000×в/б

где а - количество ретикулоцитов в определенном объеме камеры; 4000 - емкость каждого квадрата; в - степень разведения крови;

б - количество сосчитанных малых квадратов.

Общее количество ретикулоцитов в крови здоровых животных колеблется (в % к числу эритроцитов) в следующих пределах: у лошадей - 0,013-0,32; у крупного рогатого скота -0,03-0,2; овец - 0,02- 0,18; у свиней - 2,7-14, у собак - 0,1-0,3.

Подсчет лейкоцитов.

Меланжерный метод разведения крови. В смеситель набирают кровь до метки 0,5 или 1, а до метки 11 - жидкость Тюрка (3% раствор уксусной кислоты, подкрашенный раствором метиленовой сини. Встряхивают 1-2 мин. Уксусная кислота гемолизирует эритроциты, а метиленовая синька окрашивает лейкоциты. Получают разведение соответственно 20 и 10 раз. Выпускают 2-3 капли на вату, а следующей каплей заполняют сетки камеры Горяева.

Пробирочный метод разведения крови. Для разведения крови пробирочным методом в пробирку отмеривают 0,4 мл жидкости Тюрка, затем набирают кровь капилляром от гемометра Сали до метки 0,02 мл (20 мкл), осторожно выдувают на дно пробирки и 2-3 раза промывают капилляр этой же жидкостью. Пробирку закрывают резиновой пробкой и тщательно перемешивают. Пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой берут каплю раствора и заряжают счетную камеру. Через 1-2 мин после оседания лейкоцитов на дно камеры начинают подсчет клеток в 100 больших неразделенных квадратах под

91

малым увеличением микроскопа, при объективе х8 и окуляре х!5. Количество лейкоцитов в крови животных приведено в таблице 6.

Количество лейкоцитов определяют по формуле

X=A×4000× в/б

где х - количество лейкоцитов в 109/л крови; а - количество подсчитанных лейкоцитов в 100 больших квадра-

тах;

в - степень разведения (20 или 10); б - количество маленьких квадратов (100×16=1600); 4000 - мно-

житель, приводящий результат к объему 1 мкл крови, так как объем малого квадрата равен 1/4000 мкл.

Подсчет тромбоцитов.

Количественные сдвиги тромбоцитов говорят о нарушении костного мозга, его мегакариоцитов, от которых они происходят. Ряд инфекционных болезней сопровождается изменением числа тромбоцитов. Так, при мыте, зоспалении легких, плеврите, гемоглобинемии, саркоме и других болезнях наблюдается увеличение числа тромбоцитов - тромбоцитоз. При инфекционной анемии, воспалениях кишечника, пироплазмозе развивается тромбопения.

Прямой метод в камере. Капиллярной пипеткой от гемометра Сали набирают 20 мкл крови (0,02 мл), выдувают в пробирку с 4 мл 5% раствора трилона Б, закрывают резиновой пробкой и осторожно перемешивают. Заполняют сетки камеры Горяева, оставляют на 5 мин для оседания форменных элементов. Подсчитывают число тромбоцитов в 25 больших квадратах при увеличении в 280-400 раз. Количество тромбоцитов в 1 мкл крови узнают, умножая найденное число на

2000.

Метод Фонио (подсчет в мазках крови). Метод основан на определении количества кровяных пластинок в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов. Капилляром Папченкова набирают раствор трияона Б до метки 75 и вносят в пробирку размером 10x1 см. Туда же вливают кровь, взятую капилляром Папченкова, до отметки 0. Содержимое пробирки хорошо перемешивают и из смеси готовят тонкие мазки, которые фиксируют и окрашивают по РомановскомуГимзе. Определяют количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов. Вычисляют количество кровяных пластинок в 1 мкл крови, зная абсолютное число эритроцитов в 1 мкл крови. Например, при подсчете установлено, что на 1000 эритроцитов приходится 45 кровяных пластинок, а в 1 ммЗ крови содержится 7000000 эритроцитов. Делаем расчет:

на 1000 эритроцитов - 45 пластинок; на 7000000 эритроцитов - X пластинок;

X=7000000×45/1000=315000 тромбоцитов в 1 мм3 крови.

92

Определение гемоглобина.

В клинической практике наибольшее распространение имеют два метода - колориметрический гематиновый (метод Сали) и циангемоглобиновый (по Драбкину).

По методу Сали пользуются гемометром ГС-2 и ГС-3, состоящим из двух или трех стеклянных пробирочек - одной пустой, градуированной для разведения крови, и одной или двух стандартных, заполненных 1 % раствором солянокислого гематина в глицерине. Градуированная пробирка с делениями от 2 до 23 применяется для определения количества гемоглобина в граммах на 100 мл крови (г%), а в пробирке с делениями от 12 до 140 определяют гемоглобин в единицах Сали. Для перевода показателей из г % в единицы Сали количество гемоглобина в г% умножают на коэффициент 6, так как 100 ед. соответствуют 16,67 г% гемоглобина (100: 16,67 = 6). При переводе показателей содержания гемоглобина из единиц Сали в г% их делят на коэффициент 6.

Техника определения заключается в следующем. В градуированную пробирку гемометра наливают глазной пипеткой до нижней метки 0,1H раствор соляной кислоты. Раствор можно приготовить из фиксанала. При отсутствии фиксанала берут 8,2 мл химически чистой соляной кислоты (уд. вес 1,19), помещают в мерную колбу емкостью 1 л, затем доливают до метки дистиллированной водой. Капилляром от гемометра Сали набирают кровь до метки 20 мкл (0,02 мл), очищают капилляр. Затем его опускают на дно градуированной пробирки и выдувают кровь, капилляр 2-3 раза промывают прозрачным слоем раствора и выдувают в пробирку. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют стоять на 5-10 мин (при исследовании крови кур - на 15мин). За это время жидкость в пробирке принимает коричневый цвет вследствие гемолиза эритроцитов и образования солянокислого гематина. Затем в эту пробирку прибавляют дистиллированную воду или 0,1Н раствор соляной кислоты до тех пор, пока цвет жидкости не будет одинаковым со стандартами. Отмечают уровень жидкости по нижнему мениску и определяют содержание гемоглобина в г% или в единицах Сали (табл. 15).

Таблица 15 Содержание гемоглобина в крови животных, г/л.

93

Определение цветного показателя.

Цветной показатель (гемоглобиновый индекс) выражает соотношение между количеством гемоглобина и числом эритроцитов. Вычисляется по формуле

ЦП=Hb2E1/Hb1E2

где ЦП - цветной показатель; НВ2 - найденное количество гемоглобина у животного (г/100 мл;

г/л);

Е1 - среднее количество эритроцитов у данного вида животных

(млн./мкл; 1012/л);

НВ1 - среднее количество гемоглобина у данного вида животных

(г/100 мл, г/л);

Е2 - найденное количество эритроцитов у животного (млн. /мкл; 10"12/л).

У здоровых животных цветной показатель приближается к единице. Патологическим считается отклонение в ту или иную сторону свыше 15%. Цветной показатель у здоровых животных составляет: у лошадей - 0,8-1,2; у крупного рогатого скота - 0,7-1,1; у овец - 0,5-0,7;

у коз - 0,44-0,49; у свиней - 0,8-1,0; у собак - 0,8-1,2; у кроликов - 0,8- 1,0, у кур - 2,0-3,0.

Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ).

Скорость оседания эритроцитов определяют по методу Панченкова и Неводова.

Таблица 16. СОЭ у здоровых животных (по методу Неводова)

По методу Панченкова берем градуированные капилляры. Каждый капилляр имеет 100 делений и метки: К (кровь) - в верхней части на уровне цифры 0 и Р (реактив) - в середине капилляра на уровне цифры 50. Для постановки реакции в капилляр, предварительно смоченный доверху 5% раствором лимоннокислого натрия, набирают этот раствор до метки Р и выдувают на часовое стекло. Затем этим же капилляром набирают 2 раза кровь до метки К, выдувают ее на то же стекло и смешивают реактивом. Полученную смесь (цитрированную

94

кровь) насасывают в тот же капилляр до метки 0 и ставят в штатив. Через 1 и 24 ч с начала постановки СОЭ отмечают высоту столба эритроцитов. Показатель СОЭ по способу Панченкова у здоровых животных за 1 ч (мм): у крупного рогатого скота - 0,5-1,5; у овец - 0,5- 1; у коз - 0,3-1,0; у лошадей - 40-70; у свиней - 2-9; у собак - 2-6; у

кроликов - 1-2; у кур - 2-3.

Определение лейкоцитарной формулы.

Готовят мазки крови, которые высушивают на воздухе при комнатной температуре, подписывают (дата и номер опыта) и фиксируют абсолютным этиловым спиртом и эфиром поровну (смесь Никифорова) в течение 10-30 мин.

Для окраски лейкоцитов по Романовскому употребляют раствор стандартной краски Гимзы из расчета две-три капли краски на 1 мл дистиллированной воды (рабочий раствор).

Стекла с мазками помещают в чашки Петри на спички мазками вниз и заливают рабочим раствором краски. Время окраски (20-40 мин) зависит от качества краски, окружающей температуры, рН воды. Окрашенный мазок обмывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и исследуют под микроскопом при большом увеличении с иммерсионным маслом.

Для здоровых животных характерно относительно постоянное процентное соотношение между видами лейкоцитов. Это соотношение выражается так называемой лейкоцитарной формулой (лейкограммой).

Лейкограмму выводят по окрашенным мазкам под микроскопом с иммерсией, для чего используют объектив х90 и иммерсионное масло. При микроскопировании диафрагма должна быть полностью открыта, осветитель поднят до отказа. При дневном свете лучше пользоваться плоским зеркалом, при искусственном - тем, каким удобнее.

Лейкоциты в мазке распределяются неравномерно: лимфоциты - чаще всего в середине мазка, а моноциты, нейтрофилы -по периферии мазка, поэтому при подсчете используют несколько методов в зависимости от вида животных. Метод Шиллинга - четырехпольный метод, Филиппченко - трехпольный, однопольный методы, метод зигзага, цель которых охватить мазок и получить объективные данные. При выведении лейкоцитарной формулы у животных с нейтрофильной кровью чаще всего используют метод Шиллинга, по которому подсчет клеток лейкоцитов ведут в четырех точках мазка. Объектив микроскопа ставят на край мазка и постепенно движутся в его глубь на 3-4 поля зрения, затем в сторону на 2-3 поля зрения и вновь возвращаются к краю мазка. Таким образом, получается ломаная П- образная линия. В данном участке подсчитывают 25 или 50 клеток лейкоцитов. Переходят на другой участок мазка и так охватывают че-

95

тыре участка. В итоге подсчитывают 100 или 200 лейкоцитов.

Характеристика клеток белой крови.

Базофилы - округлые клетки, величина 11 -17 микрон. Форма ядра различна: у лошадей и свиней - в виде боба, у крупного рогатого скота - розетки. Ядро окрашено в фиолетово-бордовый цвет, протоплазма бесцветна или слабофиолетового цвета, заполнена темнофиолетовой зернистостью, иногда можно видеть обесцвеченные гранулы.

Эозннофилы - клетки округлой или овальной формы, величина их колеблется у разных видов животных от 9 до 22 микрон. Протоплазма нежно-голубая или бесцветная, заполнена красно-розовыми гранулами большей или меньшей величины в зависимости от вида животных. Ядро полиморфно, часто сегментировано от 2 до 5 сегментов, окрашивается диффузно в фиолетовый или красно - фиолетовый цвет.

Нейтрофилы. У лошадей и плотоядных они составляют главную массу клеток белой крови. Нейтрофилы имеют величину от 7 до 15 микрон. Протоплазма бледно-розового цвета, равномерно заполнена пылевидной зернистостью, которая окрашивается как основными, так и кислыми красителями в розовый цвет. Ядро нейтрофилов неравномерно окрашено в фиолетовый цвет, имеет более темные и более светлые участки. Нейтрофилы обладают способностью фагоцитировать микроорганизмы. Они содержат ферменты оксидазу и протеазу. Принимают участие в создании иммунитета и являются носителями антител. В зависимости от степени зрелости нейтрофилы делятся на миелоциты, юные, палочкоядерные и сегментоядерные.

Таблица 17. Лейкограмма различных видов животных, %

Примечание. Б - базофилы, Э - эозинофилы, Ю - юные; М - миелоциты; П - палочкоядерные; С - сегментоядерные, Л - лимфоциты; М - моноциты.

96

Миелоциты. Встречаются только при патологии. Величина клетки от 10 до 13 микрон. Протоплазма неравномерно окрашена в голубовато-дымчатый или голубой цвет и содержит слабо выраженную мелкую зернистость с розовым или красно-фиолетовым оттенком. Ядро миелоцита чаще всего имеет неправильную круглую, иногда бобовидную форму. Окрашивается неравномерно (тигроидно) в светло-фиолетовый цвет. По мере созревания миелоцит превращается в юный нейтрофил.

Юные нейтрофилы. Протоплазма бледно - розового цвета или с голубым оттенком, с розовой мелкой зернистостью. Ядро бобовидной формы, окрашивается равномерно в фиолетовый цвет, но менее интенсивно, чем у палочкоядерных и сегментоя-дерных.

Палочкоядерные нейтрофнлы. Это зрелые клетки, в перифе-

рической крови у здоровых животных встречаются в небольшом количестве. Протоплазма имеет мелкую пылевидную зернистость, что придает клетке розовый оттенок. Ядро вытянутое в виде палочки или в виде подковы, полумесяца, буквы з, окрашивается в темнофиолетовый цвет.

Сегментоядерные нейтрофилы - самые зрелые клетки нейтро-

фильного ряда. Протоплазма с нежной пылевидной зернистостью, которая окрашивается в розовый или красно-фиолетовый цвет. Ядро их делится на 2-5 сегментов у здоровых животных. Вследствие сильного уплотнения в ядре хроматина оно окрашивается в густой темнофиолетовый цвет. Структура хорошо выражена. У здоровых животных около 90% нейтрофилов всех форм участвуют в акте фагоцитоза.

Лимфоциты - имеют округлую, овальную форму, величина их варьирует от 7 до 19 микрон. В зависимости от зрелости лимфоцита их подразделяют на малые, средние и большие.

Малые лимфоциты - самые зрелые клетки в периферической крови. Величина их от 7 до 10 микрон. Ядро относительно большое, круглое, окрашивается в темно-фиолетовый или черно-синий цвет, расположено эксцентрично. Протоплазма в виде полумесяца, окрашивается в небесно-голубой цвет, лишена зернистости.

Средние и большие лимфоциты. Величина от 10 до 19 микрон.

Ядро расположено центрально и окружено со всех сторон довольно большим слоем протоплазмы. Вдоль ядра четко выступает светлая полоска - перинуклеарная зона. Ядро окрашивается в темнофиолетовый цвет, протоплазма - в небесно-голубой.

Моноциты - самые крупные клетки белой крови, величина их от 12 до 24 микрон. Они содержат много протоплазмы дымчатосерого или серовато-синего цвета. Окраска слабее, чем у лимфоцитов.

.Ядро разной формы, чаще подковообразной, окрашивается слабее,

97

чем ядро лимфоцита, в слабо-фиолетовый цвет. Перинуклеарная зона отсутствует. Основная функция моноцита сводится к фагоцитозу возбудителей хронических инфекций и продуктов клеточного распада.

Клетки Тюрка - у здоровых животных не обнаруживаются, кроме свиней. Это клетки округлой или овальной формы величиной от 12 до 17 микрон. Протоплазма окрашивается в интенсивно синий цвет. Перинуклеарная зона хорошо выражена. Ядро круглое или овальное, расположено посредине клетки или сильно сдвинуто в сторону. Окрашивается неравномерно в темно-фиолсговый цвет.

98

ГЛОССАРИЙ

Авария - нарушение эксплуатации ядерной установки (например, атомной станции), при котором произошел выход радиоактивных материалов и/или ионизирующих излучений за границы, предусмотренные проектом для нормальной эксплуатации, в количествах, приводящих к значительному облучению персонала, населения и окружающей среды.

Авария в пределах АЭС - событие на АЭС, при котором произошло нарушение барьеров безопасности с частичным повреждением активной зоны реактора и выходом радиации, приводящем к переоблучению части персонала АЭС; при этом облучение населения выше установленных санитарных норм не происходит. Однако требуется контроль продуктов питания населения. По международной шкале такая авария классифицируется 4-м уровнем.

Авария радиационная - потеря управления источником ионизирующего излучения, вызванная неисправностью оборудования, неправильными действиями работников (персонала), стихийными бедствиями или иными причинами, которые могли привести или привели к облучению людей выше установленных норм и/или радиоактивному загрязнению окружающей среды.

Авария с риском для окружающей среды - событие на АЭС,

при котором произошло нарушения барьеров безопасности и выброс в окружающую среду продуктов деления и которое привело к незначительному превышению дозовых пределов для проектных аварий, радиологически эквивалентных выбросу порядка сотни ТБк I131 и разрушению большей части активной зоны. По международной шкале авария классифицируется 5-м уровнем.

Активность - число самопроизвольных ядерных распадов в данном количестве радиоактивного материала за единицу времени. Измеряется в беккерелях (Бк) или кюри (Ки).

Актиноиды - общее название элементов с атомными номерами от 89 до 103. Первые четыре элемента в этом ряду (актиний, торий, протактиний и уран) встречаются в природе. Другие, так называемые трансурановые элементы, могут быть получены в результате ядерных реакций. Все изотопы этих элементов радиоактивны.

Альфа-излучение - вид ионизирующего излучения - поток положительно заряженных альфа частиц, испускаемых при радиоактивном распаде и ядерных реакциях. Проникающая способность альфаизлучения невелика (задерживается листом бумаги). Чрезвычайно опасно попадание источников альфа-излучения внутрь организма с пищей, воздухом или черезповреждениякожи.

Альфа-частица - ядро атома гелия-4, испускаемое при альфараспаде радиоактивных ядер или в результате ядерных реакций.

99

Аннигиляция - взаимодействие элементарной частицы и античастицы, в результате которого они исчезают, а их энергия превращается в электромагнитное излучение.

Атом - наименьшая частица химического элемента, сохраняющая его свойства. Состоит из ядра с протонами и нейтронами и электронов, движущихся вокруг ядра. Число электронов в атоме равно числу протонов в ядре.

Атомная единица - единица, используемая для выражения масс атомов, молекул и элементарных частиц и равная 1/12 массы нуклида углерод-12.

Атомная масса - масса атома химического элемента, выраженная в атомных единицах массы (а.е.м.). За 1 а.е.м. принята 1/12 часть массы изотопа углерода-12. Она равна 1,66 × 10-27 кг. Атомная масса складывается из масс всех протонов и нейтронов в данном атоме.

Атомная энергетика - отрасль энергетики, использующая ядерную энергию для целей электрификации и теплофикации. Как область науки и техники, разрабатывает методы и средства преобразования ядерной энергии в электрическую и тепловую.

Атомное ядро - положительно заряженная центральная часть атома, вокруг которой вращаются электроны и в которой сосредоточена практически вся масса атома. Состоит из протонов и нейтронов. Заряд ядра определяется суммарным зарядом протонов в ядре и соответствует атомному номеру химического элемента в периодической системе элементов.

Атомный номер - номер химического элемента в периодической системе элементов; равен числу протонов в атомном ядре.

Аэрозоль радиоактивный - взвешенные в воздухе в виде тумана или дыма мельчайшие твёрдые или жидкие частицы, обладающие радиоактивностью; образуются в атмосфере при поступлении радиоактивных изотопов и осаждении их продуктов распада на частицах обычной пыли.

Беккерель - единица активности нуклида в радиоактивном источнике, равная активности нуклида, при которой за 1 с происходит один распад.

Бета-излучение - электронное и позитронное ионизирующее излучение с непрерывным энергетическим спектром, испускаемое при ядерных превращениях.

Бета-источник - радиоактивное ядро, распадающееся с испусканием бета-излучения; устройство, создающее бета-излучение.

Бета-радиоактивность - радиоактивность, обусловленная испусканием бета-излучения.

Бета-распад - самопроизвольные превращения нейтрона в протон и протона в нейтрон внутри атомного ядра, а также превращение сво-

100