Методологические принципы биотехнологии. Монография

живых клеток. В этой модели имеются две характеристики, аналогичные живой клетке: наличие биологически активных агентов (ферментов) и полупроницаемой мембраны (границы живого организма) и окружающей среды. Однако наиболее принципиальная характеристика живой клетки – активный транспорт и биосинтез входящих в нее компонентов – остается неосуществимым идеалом.

2 . 9 . 3 . И н т е н с и ф и ц и р у ю щ и е ф а к т о р ы ф и з и ч е с к о й , х и м и ч е с к о й и б и о л о г и ч е с к о й п р и р о д ы

В литературе встречается много терминов с неоднозначным употреблением – например регуляция, лимитация, ингибирование, интенсификация, стимулирование, индукция, репрессия, активация. Например, термин «лимитация», который приобрел своеобразное значение и который сейчас многие исследователи отождествляют с влиянием: «Обычно при этом имеется в виду такое влияние, когда удельная скорость роста увеличивается при возрастании величины влияющего фактора среды. Противоположное влияние среды, когда увеличение некоторого фактора вызывает снижение μ, называют ингибированием» [85].

Введем рабочее определение ключевого понятия интенсифицирующие факторы – это ингредиенты или какие-либо невещественные воздействия, повышающие те или иные удельные характеристики получения целевого результата, но при этом не являющиеся необходимыми элементами питательной среды и факторами роста. Также следует иметь в виду методологическую установку: система, в которой участвует биологически активный агент, представляет собой комплекс биофизикохимических процессов, где всякое дополнительное воздействие безусловно должно вызвать положительный или отрицательный эффект. Исходя из этого, будем рассматривать только интенсифицирующие факторы, эффективность которых достаточно обоснована. Соответственно интенсификаторами будем называть такие добавки вне зависимости от их природы, структуры состава, а также фазового состояния в среде. Это могут быть и нерастворимые частицы, и какие-либо агрегаты, которые, не являясь необходимыми и обязательными для осуществления данного процесса, все же интенсифицируют его.

51

Иногда интенсифицирующие добавки называют стимуляторами, подразумевая в первую очередь добавки, внесение которых в среду биореактора увеличивает удельную скорость продуцирования целевого продукта – биомассы в целом или отдельного продукта биосинтеза. В этом смысле термин «стимулятор» имеет более узкое значение. Кроме того, сами понятия «стимуляция», «стимулирование» по своему исходному значению больше относятся к добавкам, воздействие которых представляет собственно стимуляцию, толчок, инициацию процесса, что не всегда совпадает с механизмом воздействия интенсифицирующих добавок.

Рассмотрим интенсифицирующие факторы химической и биологической природы. Такого рода факторы могут приводить к повышению удельной скорости продуцирования целевого продукта по различным механизмам, например, путем повышения проводимости мембран нейтрализацией ингибиторов роста или интенсификацией транспорта кислорода. Добавки могут быть предшественниками биосинтеза целевого продукта и тем самым повышать его выход. Повышенный синтез какого-либо продукта может также достигаться защитой ферментов от ферментных ядов или активацией путем воздействия на субъединицы фермента.

Практически неосуществим путь увеличения удельной скорости роста биомассы через влияние на многостадийные процессы, если не найдена какая-либо лимитирующая стадия. Для большей ясности приведем примеры.

Если весь биотехнологический процесс условно разделить на следующие основные стадии: подготовка питательной среды и посевного материала; основной процесс ферментации; процесс выделения целевого продукта, то в этом случае примерами добавок интенсификаторов будут соответственно:

1)добавки целлюлолитических ферментов для предобработки – ферментативного гидролиза целлюлозы [62, 113];

2)добавки-катализаторы щелочного и кислотного гидролиза;

3)нуклеазы, ускоряющие частоту клеточного деления и увеличивающие в целом удельную скорость роста;

4)полиэлектролиты, приводящие к флокуляции клеток на стадии выделения; протекторы, приводящие к сохранению химической структуры целевых продуктов (например, в процессах сушки).

52

Также следует учитывать явление ингибирования избытком субстрата, что еще раз показывает малоэффективность повышения удельной скорости биосинтеза полезного продукта добавками исходного субстрата. При определенных концентрациях он индуцирует процесс,

втом числе биосинтез «индуцибельных» ферментов, а в случае превышения некоторой величины может быть ингибитором [48].

При анализе результатов экспериментов следует учитывать, что

вряде случаев увеличивается только скорость размножения клеток, но не скорость увеличения биомассы, которая мало изменяется ввиду мельчания быстро размножающихся клеток. Например, одним из вариантов объяснения действия нуклеаз может быть следующая логическая цепь:

–добавки нуклеаз ускоряют частоту клеточного давления, что приводит к увеличению числа клеток;

–увеличение числа клеток при одной и той же исходной биомассе приводит к уменьшению их размеров;

–площадь поверхности клетки увеличивается пропорционально квадрату ее линейных размеров, а объем – пропорционально кубу линейных размеров – в этом случае получается, что при уменьшении размера клетки соотношение площади ее поверхности и объема больше, чем это соотношением для более крупных клеток;

–лучшее соотношение обусловливает более интенсивный поток питательных компонентов на единицу объема (массы) клетки и, соответственно, интенсифицирует биосинтез.

Любопытно отметить, что культура микроорганизмов усваивает какие-либо компоненты не только в том случае, если это полезный питательный субстрат, но и в том случае, если это вредный инородный продукт, от которого нужно поскорее избавиться. «В микробиологическом синтезе триптофана своего рода предшественником служит антраниловая кислота. Внесенная в определенных концентрациях в питательный субстрат кислота как бы отравляет его. Чтобы избавиться от этого неблагоприятного компонента среды, некоторые микроорганизмы трансформируют антраниловую кислоту в триптофан и выделяют его в окружающую среду» [9, 41].

Остановимся на методических вопросах экспериментального определения эффективности применяемых интенсификаторов, обратив внимание на аналог уравнения Михаэлиса–Ментен – уравнение Моно, приближенно описывающего зависимость удельной скорости роста популя-

53

ции от концентрации лимитирующего субстрата. Очевидно, что если интенсифицирующий фактор (добавка) будет непосредственно влиять на максимальную удельную скорость роста, то эксперименты с целью получения наиболее выраженных результатов нужно проводить при избытке субстрата. Напротив, если интенсифицирующая добавка оказывает влияние на сродство фермента к субстрату или клетки к субстрату питательной среды, эксперименты следует проводить при пониженных концентрациях субстрата. Наконец, если механизм неизвестен, лучше всего золотая середина – умеренные концентрации субстрата.

Таким образом, мы рассмотрели проблему интенсификации, связанную с решением вопросов стимуляции биосинтеза и повышением эффективности ферментативных реакций как таковых. Нужно иметь в виду также взаимосвязанные вопросы повышения удельной скорости роста биомассы в целом и коррелирующей с ней скорости биосинтеза первичных метаболитов.

Отдельное место занимает проблема повышения выхода вторичных метаболитов. Как известно, первичные метаболиты продуцируются в ростовую (экспоненциальную) фазу, которая получила название профазы, а вторичные – в фазу замедленного роста биомассы – идиофазу. Поэтому некоторые промышленно важные продукты биосинтеза накапливаются в процессе ферментации только в идиофазе. В связи с этим повышенный выход вторичных метаболитов может достигаться при комплексном воздействии интенсификаторов. Вначале целесообразно вырастить определенную концентрацию продуцента, применяя для этого собственно интенсификаторы удельной скорости роста. Затем следует применить ингибиторы, которые, замедляя удельную скорость роста клеточной массы, интенсифицируют биосинтез целевого вторичного метаболита. В данном случае ингибиторы роста биомассы будут интенсификаторами биотехнологического процесса продуцирования целевого продукта – продукта биосинтеза вторичного метаболизма, например антибиотика.

Следующим подходом является интенсификация биосинтеза (клеточной массы в целом или отдельных продуктов) путем оказания влияния на транспортные механизмы. В первую очередь это касается вопросов управления транспортными процессами мембран. К сожалению, мы располагаем ограниченными знаниями и методами для влияния на активный механизм транспорта мембранной проводимости. В силу этого обстоятельства применяются только грубые способы частичного разрушения

54

иразрыхления мембран, интенсифицирующие пассивный, диффузионный транспорт компонентов вне и внутрь клетки. В этом случае происходят нежелательные процессы, связанные с нарушением нормальной физиологии клетки – транспортом вредоносных компонентов внутрь клетки

иоттоком физиологически необходимых компонентом из нее.

Таким образом, увеличение пассивной проводимости (разрыхление мембраны) уменьшает жизнеспособность живой клетки. Поэтому при применении названного метода следует искать режим оптимального воздействия (если он вообще возможен). Ввиду сложности теоретического описания функционирования клеточной мембраны такой оптимум можно находить преимущественно экспериментальным путем.

Целесообразно остановиться еще на одной «транспортной проблеме», уже не связанной непосредственно с физиологией продуцента: «При выращивании микроорганизмов на питательных веществах, которые являются незаменимыми для роста, но не растворяются в воде, рост может ограничиться скоростью диффузии или скоростью растворения этих веществ… Растворимость в воде кислорода ограничена, следовательно, необходимо непрерывно передавать его из воздушных пузырьков в окружающую клетку жидкую среду, или, иными словами, обновлять поверхность раздела фаз газ–жидкость в культуральной среде» [128].

Приводится ряд примеров, когда специально создаваемая лимитация роста вызывает накопление полезных продуктов [106]:

1.Лимитация кислородом: у дрожжей образуется спирт, у факультативных аэробных бактерий усиливается брожение.

2.Лимитация железом: у некоторых продуцентов рибофлавина наблюдается его сверхсинтез.

3.Лимитация фосфором: сверхсинтез антибиотиков у многих актиномицетов.

4.Лимитация азотом: сверхсинтез липидов у дрожжевых форм, накопление различных продуктов неполного окисления у самых различных форм.

5.Лимитация биотином: сверхсинтез глутамата у некоторых бак-

терий.

6.Лимитация углеродом: синтез липазы у многих форм.

Для поддержания культуры в состоянии сверхсинтеза необходимо хорошо знать физиологию хемостатных культур, которая мало изучена [106].

55

Обсуждая механизм интенсифицирующего действия лимитации кислородом, мы можем предположить переключение механизма роста биомассы на биосинтез целевого продукта. Такое переключение эффективно для синтеза вторичных метаболитов. Но в случае использования мутантов, обладающих способностью к сверхсинтезу первичных метаболитов (например, триптофана и лизина), такие метаболиты в смысле их физиологии уже являются вторичными.

С другой стороны, интенсификация биосинтеза при лимитации кислородом может происходить по тем же механизмам, которые обсуждались при применении веществ, повышающих проводимость мембран.

Рассмотрим интенсифицирующие факторы физической природы. Эта область менее значима по своим эффектам, чем область использования вещественных ингредиентов (добавок). Какие физические факторы воздействия (кроме механических – типа перемешивания и пр.) могут оказать влияние на процесс действия БАА? Такие показатели как pH и температура не являются предметом нашего рассмотрения, поскольку они имеют место в любом процессе. Потенциально можно ожидать эффекты при влиянии на среду, содержащую БАА, постоянных электрических и магнитных полей, переменных электромагнитных полей, механических воздействий колебательного характера (например, ультразвуковых), вариаций давления и др.

Назовем следующие физические факторы биотехнологических процессов.

1.Ультразвук определенной частоты может разрушать клетки, дезинтегрировать их. Вполне возможно, что ультразвук определенной частоты интенсифицирует транспортные мембранные механизмы или действует каким-то иным образом [134].

2.Магнитные поля сказываются на ходе некоторых химических реакций (эффекты химической поляризации ядер), но это воздействие слабое и вряд ли стоит ожидать заметного влияния этих полей на процессы с участием БАА.

3.Некоторые биохимические процессы, протекающие в клетке, проходят по ионному механизму. Другие внутриклеточные процессы сопровождаются переносом зарядов. Этот факт предполагает возможное влияние электрических полей и токов, ими вызываемых, на систему

сфункционирующим БАА.

56

2 . 1 0 . Б и о т е х н о л о г и ч е с к о е м а с ш т а б и р о в а н и е :

о т л а б о р а т о р н ы х и с с л е д о в а н и й к п р о м ы ш л е н н о й т е х н о л о г и и

На этапе функционирования научно-прикладной биотехнологии формируется научная база, включающая конкретные решения по основным компонентам реализации биотехнологического процесса: объекту биологически активной переработки, биологически активному агенту и конечному (целевому) результату. Кроме того, дополнительная научная продукция предполагает повышение эффективности промышленного биотехнологического процесса.

Этап реализации промышленного технологического процесса заключается в переходе от результатов лабораторно-научных исследований к реальным крупномасштабным промышленным системам. Это означает, что биологически активный агент представлен большой популяцией, а процесс промышленной ферментации реализуется в аппаратах значительно большего масштаба, чем в лабораториях.

В связи с этим рассмотрим проблемы популяционного подхода. Здесь следует принимать во внимание особенности работы микробио- лога-ученого и микробиолога-технолога. Первый хотя чаще всего и имеет дело с колониями или малыми популяциями, результаты своих исследований экстраполирует к свойствам отдельной клетки, отдельного микроорганизма. А микробиолог-технолог обязан рассматривать физиологические свойства популяции в целом, которые не сводятся к свойствам отдельного микроорганизма и не выводятся полностью из них, хотя определенным образом они взаимно детерминированы. С точки зрения системного подхода популяции следует рассматривать совместно со всеми другими компонентами: среда и ее состав, физикохимические факторы культивирования.

Таким образом, популяционный подход можно условно назвать биологическим масштабированием в отличие от масштабирования фи- зико-технического, связанного с процессами и аппаратами, реализующими соответствующие технологические процессы. Обе проблемы масштабирования взаимосвязаны. Причем они осложнены тем, что фи- зико-химические свойства популяции (в отличие от неживых физикохимических процессов в химической технологии) изменяются в ходе самого процесса: «К сожалению, до настоящего времени даже применение известных законов химической термодинамики и кинетики

57

к микробным популяциям встречает значительные трудности, которые еще усугубляются тем, что микробная клетка, как и все живое, обладает изменчивостью и способностью постепенно приспосабливаться к условиям внешней среды» [11].

Какие сложности возникают в популяции и какие проблемы решает популяционный подход сверх тех, что уже решены на предшествующем этапе по выбору и селекции штамма-продуцента?

Конечно, характеристика продуцента, состав питательной среды, стимулирующие агенты и синтезируемый целевой продукт будут иметь значение для жизни популяции. Однако при масштабном переходе изменятся условия устойчивости культуры, возникнут вопросы изменчивости и автоселекции наиболее резистентных мутантов, проблемы стерилизации при подготовке основного процесса и многие другие проблемы взаимосвязи биологического и физико-технического масштабирования.

Относительно специфических проблем масштабирования в биотехнологии, связанных с живой природой процесса, надо сказать, что в промышленных технологиях (в отличие от лабораторных) используются реакторы и вспомогательные аппараты больших объемов в другом материальном исполнении (например, не в стекле, а в металле). Живая природа процесса проявляется также в том, что если в химической технологии нежелательная примесь может только уменьшаться в концентрации, то в биотехнологии все обстоит иначе. Если примесью является нежелательная культура микроорганизмов, даже присутствие одной клетки (например, одной споры, оставшейся в живых после стерилизации в технологической среде) может привести в результате ее активного размножения к полному заражению среды и срыву биотехнологического процесса.

Физические процессы на металлических поверхностях и физикобиохимические процессы взаимодействия компонентов среды и клеток с металлами также могут оказывать заметное влияние на биотехнологический процесс.

Все сказанное относится и к проблеме вытеснения продуцента другой культурой, которой заражена технологическая среда.

Вторая сторона специфики живого технологического процесса связана с «внутренними проблемами» самого продуцента – образованием жизнеспособных мутантов исходного штамма-продуцента и, со-

58

ответственно, вытеснением, замещением исходной формы жизнеспособным, но не продуктивным (в отношении к целевому продукту) штаммом. Другими словами, искусственный отбор, который имеет место на предварительных лабораторных этапах, заканчивается при реализации промышленного процесса, где вновь господствует естественный отбор дикой природы. Здесь без вмешательства человека природа все возвращает вспять – жизнеспособные и активные мутанты вытесняют менее жизнеспособные и устойчивые, а такими как раз и являются сверхпродуценты, полученные искусственным путем.

Популяционный подход к биотехнологическим процессам дает важную методологическую установку: в системе культивирования продуцента в силу неизбежных мутаций и значительной величины вероятности появления мутанта, имеющего селективное преимущество по сравнению с исходной формой, происходят процессы естественного отбора, приводящего к вытеснению исходной культуры. Эта методологическая установка определяет специальную разработку средств предотвращения нежелательных процессов в условиях промышленных биотехнологий. Конкретные способы решения проблемы находятся,

впервую очередь, при исследовании различных типичных форм устойчивых мутантов.

Специально-научная методология и описание организации биотехнологического процесса с учетом популяционных проблем и проблем автоселекции представлена в довольно давней работе [97], что не мешает ей быть актуальной и в наше время. Анализу кинетики взаимодействия «паразита» и «хозяина» в проточных условиях значительное место отведено в работе [109], где выводятся критерии устойчивости

всмешанной непрерывной культуре для системы из трех популяций: «паразита», «хозяина» и комплекса «паразит – хозяин».

Мы дали характеристику особенностей биотехнологии, обусловленных живой природой основных агентов биотехнологического процесса.

2 . 1 1 . М е т о д о л о г и я а п п а р а т у р н ы х р е ш е н и й и и н ж е н е р н ы е п р о б л е м ы м а с ш т а б и р о в а н и я

Даже оптимальное решение задач в лабораторных условиях требует воспроизведения биотехнологического процесса в масштабах реального промышленного производства. Для большинства продуктов

59

биотехнологии это связано с задачами получения продукта в значительно больших количествах, чем это можно сделать с помощью лабораторных аппаратов (за исключением некоторых препаратов для аналитических целей и ряда лекарственных препаратов).

Вопросам анализа размерностей и масштабирования при анализе проблем взаимоотношений химической технологии и биотехнологии отводится значительное место в работе [13].

Здесь уместно еще раз сказать о направлениях связи химической

ибиотехнологии. Например, если обеспечить инвариантность физиологического состояния продуцента в аппаратах различного масштаба, то все остальные задачи масштабирования будут точно такими же, как

идля химико-технологических процессов: проблемы геометрического, механического и химического подобия.

Изменения размеров аппарата, массообменных гидродинамических и тепловых характеристик приводят к качественной перестройке характера протекания процессов. Это требует реализации таких конструкций аппаратов и режимов осуществления процессов, которые не могут быть прямыми аналогами лабораторных. Таким образом, проблема инженерно-технологического масштабирования – это реализация технологического процесса с наибольшей эффективностью на основе отработанного технологического процесса лабораторного уровня.

Вцелом при рассмотрении проблемы подобия биотехнологических процессов выделяют четыре типа подобия: геометрическое, механическое, тепловое, химическое, причем каждый из этих типов подобия связан с остальными [9, 80]. Кардинальным решением проблемы масштабирования является уход от нее совсем. Например, это делается при постановке научных исследований и отработке технологии на аппаратах с производительностью, достаточной для промышленного производства. Такой подход приемлем только для дорогостоящих и малотоннажных препаратов: лекарственных, диагностических, аналитических. Нужно также иметь в виду, что на практике нередко приходится использовать не наиболее подходящую систему, спроектированную для соответствующего процесса, а некоторый ограниченный номенклатурный ряд выпускаемых промышленностью аппаратов.

Взаключение выделим наиболее существенные подходы:

а) дальнейшее решение проблем масштабирования, связанное с математическим моделированием и интеллектуальными системами;

б) обращение к принципам системного подхода, согласно которому масштабирование отдельной технологической стадии, пусть даже

60