Методологические принципы биотехнологии. Монография

2)наличие принципиальных возможностей реализации данного социального заказа в технологическом процессе с участием биологически активных агентов (определяется современным уровнем базисных наук).

Сочетание этих двух факторов приводит к формированию основных составляющих биотехнологических исследований и разработок.

Встановлении биотехнологии от стадии научных лабораторных исследований до их реализации промышленных масштабах выделим триаду общей технологической задачи:

1)объект биологически активной переработки – ОБАП;

2)биологически активный агент, определяющий основную стадию переработки – БАА;

3)конечный результат (чаще всего продукт) – КР.

Эта триада выглядит как ОБАП–БАА–КР. Для типичного случая – субстрат–продуцент–целевой продукт. При формировании данной триады биотехнологическая цель, или конечный результат (КР) обусловливает использование необходимых для его достижения наук и технологий.

Для понимания сути биотехнологических исследований важно понять, что после этапа конкретизации и обогащения содержанием составляющих названной «триады» должен следовать этап разработки собственно технологии и инженерно-аппаратурного ее оформления. Проблемы технологии и инженерии на этом этапе играют только ориентирующую и регулирующую роль. Исследователи и организаторы работы должны знать технологические и инженерные проблемы для того, чтобы научные решения были приемлемы для их практической реализации.

Выделим принципиальные разновидности биотехнологических процессов:

–получение биомассы микроорганизмов или тканей;

–производство отдельных продуктов биосинтеза (в широком понимании биосинтез – образование каких бы то ни было продуктов

впроцессах и анаболизма, и катаболизма);

–осуществление биохимических превращений каких-либо соединений в нужный целевой продукт;

–превращение некоторого исходного экологически опасного продукта в любой продукт, менее опасный или нейтральный, свободно включающийся в естественные процессы биогеосферы.

41

2 . 8 . П р и н ц и п ы м о д и ф и к а ц и и б и о л о г и ч е с к и а к т и в н ы х а г е н т о в

2 . 8 . 1 . С т р у к т у р а п р о б л е м ы

На этапе функционирования научно-прикладной биотехнологии проводятся исследования, начиная от бедного содержанием представления о триаде ОБАП–БАА–КР к обогащенному знанию, составляющему основу для технологических разработок и аппаратурных решений.

Основные методологические проблемы функционирования научно-прикладной биотехнологии концентрируются на БАА, т. е. на средствах достижения конечного результата. Именно в части биологически активного процесса и сосредоточена суть биотехнологического достижения цели.

Рассмотрим общие проблемы, связанные с исследованиями в данном направлении. Прежде всего в соответствии с биотехнологической целью выбирается БАА, например микроорганизмы, отдельные ферменты (или их комплексы), клетки растений или животных. В случае использования в качестве БАА целых клеток ценно то, что фабрика живой клетки полностью включается в технологический процесс. В свою очередь, применение отдельных ферментов, или энзимов, позволяет проводить ограниченное число химических или биохимических превращений, самое большое преимущество которых – высокая специфичность.

После того как определены ОБАП, БАА и КР, начинается этап усовершенствования выделения БАА под действием главного технологического регулятора: обеспечения максимальной производительности биологически активного процесса. Решение этой задачи в случае использования в качестве БАА микроорганизмов или культур каких-либо клеток в настоящее время осуществляется:

1)традиционным способом неселективного индуцирования мутагенеза с последующим искусственным отбором мутантов с нужными свойствами, а также гибридизацией (путем скрещивания);

2)методами генной инженерии, т. е. на основе технологии рекомбинантных ДНК и РНК.

42

2 . 8 . 2 . И с к у с с т в е н н ы й м у т а г е н е з , г и б р и д и з а ц и я и м е т о д ы г е н н о й и н ж е н е р и и

Данный параграф в наибольшей степени соответствует стилю и содержанию учебного пособия.

Традиционный способ искусственного мутагенеза заключается в искусственном увеличении частоты мутаций, происходящих в клетках, путем неселективного воздействия различными физико-химиче- скими факторами, нарушающими структуру и одновременно генетический код информационных макромолекул ДНК и РНК. В результате таких воздействий могут возникать жизнеспособные организмы с непредсказуемыми свойствами, т. е. искусственный мутагенез приводит к образованию клеток с различными морфологическими и физиологическими свойствами. Особенность этого метода – большая частота мутаций, что повышает вероятность возникновения штамма с нужными свойствами.

Длительность такого процесса с наглядной схемой эволюции, последовательности отбора штаммов (продуцентов пенициллина) с указанием мутагенных факторов подробно описана в работе [13]. В ней показано, как путем искусственного мутагенеза и отбора в 1940–1975 гг. было последовательно выделено более 20 штаммов-продуцентов пенициллина, последний из которых имел продуктивность в 55 раз большую, чем исходный штамм.

При выделении мутантов прямой отбор продуцентов с повышенным выходом целевого продукта не всегда возможен, поскольку не удается создать селективные условия для роста только мутантных искомых штаммов. В силу этого применяют метод скрининга, т. е. размножение выживших мутантных клеток и отбор наиболее активных продуцентов целевого продукта. Традиционным общепринятым является скрининг с использованием чашек с агаром [13].

Другой способ выделения нужных БАА заключается в создании условий, когда мутанты с искомыми свойствами не растут, а растущие клетки исходной культуры (клетки дикого типа) «устраняются» путем добавления веществ, убивающих растущие культуры. К примеру, пенициллин и нистатин при добавлении в культуральную среду вызывают гибель растущих клеток бактерий или грибов соответственно.

43

Анализ различных подходов при выделении искомых штаммовпродуцентов, образующихся в результате мутагенеза, позволяет сделать заключение, что наиболее эффективным способом является прямой отбор. При этом необходимо найти условия, при которых растут только искомые мутанты. Например, такой подход удается реализовать при выделении сверхпродуцентов аминокислот: «Обработанную мутагеном культуру выращивают в присутствии ингибитора (например, аналога аминокислоты), в результате чего отбираются мутанты, преодолевающие нарушение обмена за счет образования избытка желаемого соединения. Отбор чашек с агаром основан на том, что часть организмов отвечает на воздействие по принципу «все или ничего». Колонии мутантов растут, а диких клеток – нет» [13].

Для промышленных штаммов, особенно используемых в длительных процессах ферментации, стараются выделить продуктивные мутанты, не обязательно с высокой скоростью роста. Для этого используют непрерывное культивирование в хемостатах: «В хемостатах при длительном выращивании культура все время находится в экспоненциальной фазе роста, и это позволяет выделить даже те мутанты, у которых сродство к субстрату, удельная скорость роста или устойчивость к токсическому воздействию высоких концентраций субстрата ил продукта лишь немного превышает исходный уровень» [13].

Таким образом, принципы выведения штаммов, или БАА, с максимальной активностью в случае использования традиционного метода мутагенеза и отбора основаны на неконтролируемом воздействии мутагенного фактора.

Традиционным путем создания нужных штаммов является гибридизация путем скрещивания: «Наиболее простой путь создания организмов с желаемым комплексом генетически обусловленных признаков – это скрещивание штаммов, принадлежащих к противоположным половым типам. Как про-, так и эукариотические микроорганизмы скрещиваются при контакте клеток, и этот процесс используется при получении рекомбинантов. У бактерий половой процесс называют конъюгацией. Контакт между двумя клетками осуществляется за счет образования длинного конъюгационного мостика, который служит для переноса ДНК из одной клетки в другую. У грибов существуют разнообразные типы скрещивания…» [13]. Поскольку вопросы гибридизации путем скрещивания относятся к классическим методам генетики, начиная с Г. Менделя, мы не будем их рассматривать далее и ограничимся вышеприведенными характеристиками.

44

Другим путем генетического обмена являются методы слияния протопластов бактерий, грибов и клеток животных. «С целью преодоления преград для генетического обмена, существовавших в обычных системах скрещивания, был разработан метод слияния протопластов (клеток с удаленными клеточными оболочками), который пригоден для получения межвидовых и даже межродовых гибридов. Его можно использовать при гибридизации клеток одного вида, которые принадлежат к несовместимым группам спаривания, или же когда природная система скрещивания малоэффективна в плане образования генетических рекомбинатов» [13].

С конца прошлого века самым прогрессивным путем создания БАА является генная (генетическая) инженерия. По авторитетному мнению академика А. А. Баева, генетическую инженерию можно определить как «конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК) или иначе – создание искусственных генетических программ» [4]. Здесь, конечно, надо иметь в виду и другую генетическую структуру – РНК. В этой же работе находим пояснения: «В отечественной литературе в ходу два названия – генетическая инженерия и генная инженерия, употребляемые как синонимы. Однако их смысловое содержание неодинаково: генетическая – значит связанная с генетикой, генная – имеющая отношение только к гену (генам). Генетическая инженерия соответствует английскому genetic engineering; она точнее передает суть дела: генетическая программа – это не просто ген. Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 г., когда П. Берг и сотрудники создали первую рекомбинантную ДНК. Исторически генетическая инженерия, как и многие другие направления, возникла на стыке нескольких биологических наук. Она является прямым потомком молекулярной генетики. Ее становление, однако, зависело от прогресса генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот» [4]. В связи с этим Баев пишет: «Анализируя ход событий, приведших к возникновению генетической инженерии, нужно отметить, что она не возникла, подобно Афродите, из морской пены, и не принесла с собой нового видения биологических явлений, новых познавательных идей и необходимости ломки сложившихся представлений. (При этом я имею в виду представления современные, а не 40-х годов). Проблематика наследственности осталась прежней, изменились в благоприятную сторону возможности исследований, был найден как бы ключ к до того закрытой двери, и на какое-то время исследование получило возможность свободного поступательного движения. Прихо-

45

дится лишь удивляться тому, что столь относительно малый методический шаг, как открытие и применение рекстриктаз и лигаз, т. е. фрагментирующих и сшивающих ферментов, привел к необыкновенному расширению экспериментальных возможностей» [5].

Впримечании к книге А. Сассона «Биотехнология: свершения

инадежды» сказано: «В русской терминологии «методология рекомбинации in vitro, «использование рекомбинантных ДНК» и «генная инженерия» эквивалентны. Однако чаще принято пользоваться термином «генная (или генетическая) инженерия». Недопустимо употреблять термин «генетическая рекомбинация» без добавления in vitro, что часто делает автор, ибо этим термином обозначается гомологическая рекомбинация in vivo, происходящая при скрещивании живых организмов, трансформации и других процессах естественного генетического обмена. Поэтому далее в тексте, где необходимо по смыслу, термин «генетическая рекомбинация» заменен словами "генная инженерия"» [111].

Основа метода рекомбинантных ДНК – встраивание природной или чужеродной ДНК в генетический аппарат вектора (агента переноса целевой генетической информации в клетку), в качестве которого чаще всего используются бактериальные плазмиды или вирусы.

Одна из целей биотехнологии – получить клоны трансформированных клеток, способных к экспрессии.

Вот краткое описание истории и принципов генной инженерии: «Экспрессия гена – путь реализации генетической информации, закодированной в последовательности нуклеотидов молекулы ДНК, состоит из двух основных стадий – транскрипции и трансляции. Предпосылкой прогресса в этой области послужило открытие в 1972 г. Арбером

иСмитом и Натансом (лауреатами Нобелевской премии 1978 г.) ферментов рестрикции, которые расщепляют ДНК в специфических участках. Не менее важным оказалось открытие лигаз (ферментов, способных «сшивать» фрагменты ДНК) и обратной транскриптазы, синтезирующей ДНК на матрице РНК. Для встраивания одного или нескольких генов в ДНК с последующим введением в клетки микроорганизма необходимы как рестрикционные эндонуклеазы, так и лигазы» [111].

Вгенной инженерии, в том числе применительно к биотехнологии, можно выделить две основные проблемы.

1. Установление структуры ДНК, ее выделение или синтез, обеспечивающий перенос необходимой информации в соответствии с биотехнологической целью. Эта проблема чрезвычайно обширна и является междисциплинарной. Отметим только, что в ряде случаев большое значение имеет определение структуры белков, которую эффективно

46

устанавливают по структуре кодирующих их ДНК, и, наоборот, по последовательности аминокислот в этом белке определяют последовательность нуклеотидов ДНК.

2. Реализация технологии переноса генетической информации в клетку-продуцент. Это проблема вектора, в качестве которого часто применяются внехромосомные генетические системы – плазмиды (кольцевые молекулы ДНК, автономно от хромосомы реплицирующиеся в клетке) или бактериофаги (вирусы). Затем необходимо предусмотреть работу регуляторных механизмов, дающих команду начала и окончания биосинтеза. Для получения регуляторных сигналов используют аппарат клетки «хозяина» или фага. Встроенная ДНК может быть замаскирована концевыми группами и пользоваться при этом регуляторными сигналами клетки: «Чужеродную ДНК можно встраивать непосредственно за бактериальным геном или внутри его после расщепления ДНК рестрикционной эндонуклеазой: это делают, чтобы избежать затруднений, связанных с инициацией транскрипции и трансляции чужеродной ДНК. В результате образуется гибридный белок, в котором последовательность аминокислот чужеродного белка окружена последовательностями бактериального белка» [111].

Таким образом, на заключительном этапе технологического процесса генной инженерии, как и на всех промежуточных, используется комплекс методов различных областей научного знания.

Генную инженерию можно назвать технологией внутри фундаментального естествознания, то есть технологией получения специфических новых объектов живой природы. В целом генная инженерия представляет собой интегративную область естествознания и технологий, основывающуюся на современных достижениях биоорганической и биохимии, молекулярной биологии, химии, генетики, микробиологии, физико-химиче- ской биологии, математики и информационных технологий.

2 . 9 . С и с т е м а п р и н ц и п о в о б е с п е ч е н и я п р о д у к т и в н о г о р е ж и м а и и н т е н с и ф и к а ц и и п р о ц е с с а

ф е р м е н т а ц и и

После того как на стадии функционирования научно-прикладной биотехнологии решены вопросы с конкретным штаммом-продуцентом, можно приступить к исследовательскому этапу, направленному на еще

47

больший выход целевого продукта, т. е. на интенсификацию процесса реализации биотехнологической цели. Этот этап связан с оптимизацией состава питательной среды и применением различного рода добавок и физических воздействий, интенсифицирующих соответствующие стадии биотехнологического процесса. В первую очередь это касается воздействия на биологически активного агента (БАА).

2 . 9 . 1 . П и т а т е л ь н а я с р е д а и р е ж и м ы к у л ь т и в и р о в а н и я

Обеспечение необходимых условий окружающей среды – важный этап на пути к осуществлению промышленной ферментации сообразно

сцелевым результатом, или биотехнологической целью, и биотехнологической триадой.

Стоит отметить, что при рассмотрении задачи в общем виде необходимо учитывать ситуацию, когда БАА – не клеточная культура, а отдельные ферменты или их комплексы. В этом случае первоочередным вопросом будет выбор соответствующих ферментов, способов их получения и обработки для обеспечения максимальной ферментативной активности. Если предполагается использование в качестве БАА ферментов вне клетки (без ее присутствия в «рабочей среде»), вначале должна решаться отдельная биотехнологическая задача, в которой фермент с заданными свойствами будет выступать как целевой продукт, а не как БАА.

Вряде случаев максимальная эффективность процесса будет достигаться в результате одновременного включения в процесс не одного, а нескольких БАА. Например, при использовании субстрата целлюлозы или субстрата, содержащего много гемицеллюлоз, наряду

сосновным БАА могут применяться дополнительно целлюлазы или их продуценты.

С методологической точки зрения всегда надо иметь в виду, что влияние каждого фактора следует рассматривать системно – в его связи со всеми агентами технологического процесса. Элементаристский (механистический) подход полезен только на начальном этапе решения технологической задачи.

При исследовании БАА, конечно, проводятся тестовые сравнения различных штаммов по их удельной производительности на средах

48

и в режиме, обеспечивающем удовлетворительный уровень их жизнедеятельности или активности, если БАА – отдельные ферменты.

Дальнейший шаг – подбор состава питательной среды и режимов биотехнологического процесса. При выборе состава питательной среды ставятся две задачи: качественная и количественная. Как минимум любая питательная среда должна содержать вещества с химическими элементами в соответствии с элементным составом микроорганизмов (это, конечно, относится к азам биотехнологии). Также нужно учитывать не только конструктивные, но и энергетические нужды микроорганизмов, потребность в микроэлементах (например, биохимических кофакторов), что вносит дополнительные коррективы в количественные соотношения питательной среды.

Остановимся на других аспектах этой проблемы.

Так, важно учитывать, что питательные компоненты должны быть преимущественно водорастворимы, даже если приходится осуществлять ферментацию на твердых средах, а также представлять такую структуру, которая нетоксична для микроорганизмов и не ингибирует их активность. Последнее часто зависит от концентрации вещества – такие типичные субстраты, как сахара, спирты при некоторых концентрациях могут выступать в качестве ингибиторов.

Применение каждого ростового компонента представляет комплексную проблему. Например, при использовании в качестве источника углерода и энергии целлюлозы возникает задача предобработки (химического или ферментативного гидролиза). В свою очередь, при использовании углеводородов нефти как источника углерода и энергии встают вопросы структурного состава фракций и степени их очистки, поскольку микроорганизмы усваивают только определенные структурные компоненты [28]. В обоих случаях имеются технологические осложнения, связанные с тем, что целлюлоза и углеводороды нерастворимы в воде.

Когда точно не известны все необходимые для культивирования компоненты микроорганизмов или клеток тканей животных, используется продукты растительного или животного происхождения, то есть питательный раствор автоматически будет содержать все необходимые компоненты роста.

Другая сторона задачи обеспечения максимальной продуктивности микроорганизмов (а также других БАА, например ферментов) заключается в создании оптимальных физико-химических условий протекания процесса ферментации: рН, температуры, концентрации каких-

49

либо ингредиентов и других факторов. При этом обязательно следует учитывать живую природу основного процесса, что обусловливает отклонения реальных процессов от процессов химической технологии других областей научных и инженерно-технологических исследований.

2 . 9 . 2 . И м м о б и л и з а ц и я и м и к р о к а п с у л и р о в а н и е ф е р м е н т о в

Методы иммобилизации (от лат. immobillis – неподвижный) ферментов и клеток находят широкое распространение в биотехнологии и способствуют повышению эффективности реализуемых на практике биологически активных процессов. Все методы иммобилизации реализуют одну идею – связывание фермента с каким-либо носителем. Это повышает стабильность фермента, упрощает технологические процессы удержания его в активной зоне, а также его выделение, регенерацию и возвращение в активную зону.

Как правило, связывание фермента на носителе повышает его стабильность, например термостабильность, но понижает ферментативную активность. Последнее объясняется дополнительными пространственными затруднениями взаимодействия иммобилизованного фермента с субстратом и потерей активности у части иммобилизованных ферментов ввиду наличия «неудачных» мест сшивки фермента

сносителем.

Всилу того, что ферменты – весьма нестабильные продукты даже в иммобилизованной форме, а ферментативные процессы необходимо проводить с участием комплекса различных ферментов, все большее распространение получают методы иммобилизации клеток как источника комплекса различных ферментов, соответствующих технологической цели [41].

Особый интерес представляет область биотехнологии, в которой разрабатываются способы микрокапсулирования ферментов. Можно сказать, что микрокапсула с полупроницаемой искусственной мембраной и комплексом ферментов в ней представляет собой простейшую модель живой клетки. С методологической точки зрения микрокапсулирование ферментов (заключение в искусственную клетку) представляет собой моделирование в биотехнологических условиях функций

50