Методологические принципы биотехнологии. Монография

2 . 5 . П е р в и ч н о е в з а и м о д е й с т в и е к а к о с н о в а к л а с с и ф и к а ц и и э к с п е р и м е н т а л ь н ы х м е т о д о в

Все материальные объекты могут быть представлены веществом

иполем. Почти все биологические объекты – вещественные образования со своей массой и размерами (хотя имеют место и биологическая люминесценция, электрические и электромагнитные поля некоторых представителей живого мира).

Даже при неглубоком анализе понятна вся сложность экспериментальной деятельности. Так, для познания объекта необходимо поместить его в самые разнообразные экспериментальные пространства. Кроме того, в ходе любого эксперимента нужно тщательно контролировать возможные искажения информации при ее преобразовании вторичными приборами. В этом случае самое важное – выбор системы «исследуемый объект – взаимодействующий с ним объект (или прибор)».

Здесь следует обратить внимание на введенное нами понятие «первичное взаимодействие». Первичное взаимодействие в структуре экспериментального метода – это взаимодействие исследуемого объекта с другим объектом, дающее исходный сигнал или исходную информацию, которая далее может многократно преобразовываться: усиливаться, визуализироваться, передаваться, храниться.

Для более ясного понимания разделим экспериментальные методы на физические, химические, биохимические и биологические. При всей условности такая система оказывается полезной. К физическим методам относятся методы, которые дают информацию об объекте в результате первичных взаимодействий физической природы, например рентгеноструктурный анализ, основанный на явлении дифракции рентгеновских лучей при прохождении их через кристаллические структуры.

Химические методы являются средством получения информации об объекте как результате первичных взаимодействий химической природы (молекулярных превращений). Приведем пример: метилирование гексоз показало неэквивалентность гидроксильных (спиртовых) групп

ипривело к установлению гетероциклической (по типу пирана) структуры гексоз [48].

Биохимические и биофизико-химические методы дают информацию об объекте в результате первичных взаимодействий, свойственных

31

только биохимическим или биофизико-химическим процессам, не имеющим аналогов в неживой природе. Например, ферментный анализ, или использование высокой специфичности ферментов в аналитических целях [33, 138]. Еще одним примером является идентификация белков иммунологическими методами: «Белок, содержащийся в исследуемом препарате (антиген), одновременно с антителом диффундируют в агаре. В том месте, где они встречаются, образуется белый осадок. Если исследуемый препарат содержит не один, а два белка, то весьма вероятно, что они будут диффундировать с разной скоростью. В этом случае образуются две раздельные полосы осадков. Таким образом, можно установить, сколько белков содержится в препарате. Эта техника позволяет решать

иважную задачу идентификации белков» [48].

Кбиологическим относятся методы, которые дают информацию об объекте в результате первичных взаимодействий, характерных только для целостных биологических образований, например изучение ДНК при ее функционировании в целостной живой клетке.

В предлагаемой классификации важно понять, что введение и разделение методов осуществляется именно по первичным взаимодействиям. Этот кажущийся простым момент нетривиален и нуждается в пояснениях. Прежде всего надо уяснить, что первичное взаимодействие можно спутать со «вторичным», «третичным» и прочими взаимодействиями, происходящими в процессе преобразования информации при реализации того или иного метода на основе использования соответствующих прибора, инструмента, установки. А разделение исследовательских методов на физические, химические, биохимические и биологические (среди последних – микробиологические, физиологические

идр.) будет правильным, если принимать во внимание природу первичного взаимодействия исследуемого объекта, а не наиболее бросающееся в глаза инструментальное устройство, например ЭПР-спектрометр. Анализ предложенной нами классификации экспериментальных методов на основании концепции «природы первичного взаимодействия» содержится в работах [64, 72, 73]. И здесь также есть свои нюансы:

1. Если первичное взаимодействие является химическим, то метод – химический, несмотря на то что используется, например, спинметка, которая отслеживается физическим методом ЭПР-спектро- скопии.

2. Если применяется ферментный электрод, то первичное взаимодействие «субстрат – фермент» является биохимическим (поскольку

32

ферментный процесс и собственно фермент имеют одновременно и химическую, и «живую» природу, будучи биохимическими, следовательно, и сам метод – биохимический). При этом в последующих (вторичных) преобразованиях результатов взаимодействия «фермент – субстрат» могут применяться электронные, оптические (т. е. физические) приборы.

К этому следует добавить, что успешное использование УФ-, ИК-, ЯМР- и ЭПР-спектроскопии, хроматографии и других инструментов для идентификации химических соединений приводит иногда к ошибочным мнениям о неограниченных возможностях данных приборов в расшифровке структуры тех или иных соединений. Здесь упускается из виду, что структура объекта расшифровывается и познается всегда только при использовании комплекса методов. Для химических соединений эти методы в основном химические (часто скрытые в тени исто- рико-логического познавательного процесса). Только на молекулах изученной структуры получают «портреты» с точки зрения «видения мира» с помощью таких, например, методов, как УФ-, ИК-, ЯМРспектроскопия, затем проводят идентификацию веществ в неизвестных пробах. Что же касается познавательных возможностей каждого из методов, то они в изолированном виде (не в системе с другими методами) весьма ограничены.

Для того чтобы лучше разобраться в поставленных вопросах, рассмотрим показательный пример использования метода спектрального анализа в различных областях естествознания (в частном случае его называют «плазменная спектрофотометрия» в приложении к решению задач элементного анализа).

Физик Г. Кирхгоф в свое время создал спектроскоп – физический инструмент. Но! Спектральный анализ как исследовательский метод идентификации элементного состава химических соединений стал исследовательским методом только после того, как Кирхгоф совместно с химиком Р. В. Бунзеном изучили эмиссионные спектры уже известных химических веществ. Экспериментальный метод (то есть инструмент плюс исходные знания об объекте и характере его первичного взаимодействия с объектом) дает достаточно ясное представление о том, каким именно (физическим, химическим или биологическим) исследовательским методом мы располагаем. Можно обоснованно утверждать, что химические структуры и химическое движение не могут быть исчерпывающе изучены с использованием одних только физических ме-

33

тодов. То же самое можно сказать и о биологических объектах – их невозможно исчерпывающе изучить, используя только физические и химические методы.

Теперь для примера рассмотрим распространенный в биохимических исследованиях радиоизотопный метод. Суть его заключается

втом, что при изучении каких-либо превращений и перемещений того или иного вещества используются меченые радиоактивные изотопы. Это позволяет с помощь приборов, контролирующих радиоактивность, следить за ходом превращений и локализацией (например, в живом организме) какого-либо вещества. Является ли в данном случае этот метод физическим? Нет! Дело в том, что первичным взаимодействием

вданном случае будут химические или биохимические превращения. Здесь радиоактивность – это только способ индикации и слежения за биохимическими превращениями и процессами жизнедеятельности, если рассматривается распределение меченых веществ по каким-либо органам. Иными словами, мы имеем способ перевода информации, определяемой химическими, биохимическими и физиологическими первичными взаимодействиями, в формах физических сигналов, легко регистрируемых и преобразуемых. То же самое можно сказать о кольцевании птиц в орнитологии: кольцо на лапке есть чисто физическое механическое устройство, но сам метод изучения перемещения птиц не суть собственно кольцо.

Возьмем более сложный пример – использование метода на основе ЭПР. Каким является этот метод в случае его применения для исследования биохимических процессов? Оказывается – физическим или химическим (в зависимости от способа его реализации). Например, если мы с помощью спектрометра ЭПР следим за меткой – стабильным радикалом (парамагнитной частицей, имеющей неспаренный электрон и доступной наблюдению ЭПР-спектрометром), пришитым к какомулибо соединению, то это будет химический метод. Далее следует принять логику рассуждений, изложенных при анализе радиоизотопного метода. С другой стороны, если методом на основе ЭПР изучаем спектры парамагнитных систем физической природы, например неорганических кристаллов, то согласно предлагаемой классификации это будет уже метод физический.

Особенностью первых вариантов использования радиоизотопного метода и метода ЭПР (индикаторные варианты) является то, что в процессе эксперимента обращается внимание только на интенсивность сигнала, а не на его форму. Во втором варианте (для ЭПР), наоборот,

34

именно форма сигнала ЭПР несет структурную информацию. На самом деле все обстоит еще сложнее. Если рассматривать взаимодействие парамагнитной частицы с СВЧ-излучением в резонаторе ЭПР-спектрометра – это, безусловно, физический процесс. В то же время при расшифровке химических ЭПР-спектров мы оказываемся уже в зоне взаимодействия химии с физикой, причем с учетом историко-логической взаимосвязи процесса расшифровки структуры соответствующего химического соединения.

Рассмотрим другой пример. На первый взгляд хроматографический метод разделения вещества в системе подвижной и неподвижной фаз тоже представляется физическим методом (или по крайней мере физико-химическим). Те же рассуждения можно отнести к методу электрофореза при исследовании биологических объектов. Чаще всего единственным путем идентификации соединений при помощи хроматографии или электрофореза будет их предварительная калибровка соединениями известной химической структуры, т. е. калибровка соединениями, которые предварительно изучены с химической или биологической точек зрения.

В следующем примере рассмотрим логические пути применения исследовательских методов в биохимических исследованиях, в частности при изучении цепей метаболизма. Понятно, что невозможно создать приборы и инструменты, которые в одной экспериментальной ситуации могли бы проследить за всеми или даже несколькими цепями биохимических превращений. Нет инструмента, который бы мгновенно выявлял функции и структуру молекулярных составляющих в системе биохимических взаимодействий. Известные сейчас биохимические процессы, происходящие в клетке, – результат многолетней работы многих ученых (химиков, биохимиков, молекулярных биологов), которые занимались исследованиями вначале отдельных выделенных продуктов и отдельных стадий биохимических превращений, выстроенных затем в целостную систему биохимических процессов в клетке.

Для познания биохимии метаболических процессов нужно выделить и изучить объекты в широком диапазоне – от неорганических солей до макромолекул типа ДНК и РНК. Хроматография позволяет, например, разделить молекулярные смеси, масс-спектрометрия дает возможность установить атомные составляющие и отдельные молекулярные фрагменты, а ЯМР-спектроскопия – изучать структурную организацию молекул.

35

Специфическими методами осуществляется работа по выявлению последовательности химических превращений, происходящих в живой клетке. В этом случае большое значение имеют исследования ауксотрофных мутантов, которые позволяют установить шаг за шагом взаимосвязанные биохимические процессы. В ауксотрофном мутанте из тысяч взаимосвязанных процессов жизнедеятельности клетки нарушены одна–две стадии и реализуется ситуация «да–нет» по тестам с добавками предполагаемого ростового фактора, биосинтез которого блокирован (подробно этот подход уже был нами описан).

Такова логическая сторона проблем экспериментальных и вообще исследовательских методов. Как уже было сказано, прибор еще не есть исследовательский метод, для которого нужна не только реализация ситуации взаимодействия объекта с прибором, но и осознанная предметная направленность постановки экспериментальной ситуации.

Для проведения эксперимента должны быть созданы такие условия, чтобы ожидаемый экспериментальный сигнал был выше уровня шумового фона от событий, не входящих в предмет экспериментального исследования. Это – первое. Второе – это выбрать для критической проверки такую экспериментальную ситуацию, которая позволит подтвердить или опровергнуть гипотезу, т. е. создать ситуацию и получить результаты для решения типа «да» или «нет».

2 . 6 . Р а з н о о б р а з и е э к с п е р и м е н т а л ь н ы х м е т о д о в и с с л е д о в а н и я б и о м о л е к у л и б и о х и м и ч е с к и х

п р о ц е с с о в *

Систематизируем возможные области применения экспериментальных методов при исследованиях биомолекул и биохимических процессов:

1) все молекулярные структуры имеют механические свойства, поэтому могут разделяться центрифугированием (ввиду различия центробежных сил и вязкого сопротивления) и идентифицироваться массспектрометром (по различию траекторий ионизированных молекул и их фрагментов, движущихся в электрических и магнитных полях);

* В написании этого параграфа принимал участие Я. В. Курашов.

36

2)в биохимических процессах может выделяться или поглощаться тепло, что позволяет проводить калориметрические измерения;

3)молекулярные составляющие обладают теплоемкостью и теплопроводностью, что позволяет исследовать их методами теплофизики;

4)в биохимических процессах может происходить газовый обмен, что позволяет использовать метод пневматической химии;

5)молекулярные составляющие имеют физико-химические свойства, позволяющие разделять и анализировать их смеси по распределению между фазами неподвижной и подвижной (элюент), проходящей через неподвижную, что является основой метода хроматографии;

6)некоторые биологические объекты, например бактериальные клетки, вирусы, биополимеры (нуклеиновые кислоты, белки), аминокислоты и витамины в жидкостях (главным образом, в воде), приобретают специфический положительный или отрицательный заряд и, соответственно, способность перемешаться в электрическом поле с различными скоростями, что обусловливает применение метода электрофореза для их анализа, разделения и очистки (можно сказать, что методы хроматографии и электрофореза – близкие родственники);

7)молекулярные составляющие могут взаимодействовать с электромагнитными волнами различных диапазонов – отсюда возможно использование методов на основе: ЯМР-спектроскопии (квантовые ядерные спиновые переходы); СВЧ-спектроскопии (измерение дипольных моментов, нагрев); ЭПР-спектроскопии (квантовые электронные спиновые переходы); ИК-спектроскопии (межатомные колебания); видимой и УФ-спектроскопии (спектральные исследования электронных орбитальных переходов; определения концентрации частиц по светорассеянию); рентгеноструктурного анализа (дифракция рентгеновских лучей при прохождении через атомно-молекулярные структуры); электронной микроскопии (взаимодействие электронных пучков с микроструктурами в магнитных полях);

8)может происходить изменение веса (массы) – взвешивание,

втом числе микровзвешивание;

9)биомолекулы или компоненты живой клетки могут иметь электрический заряд и способность вступать в окислительно-восстанови-

тельные реакции, что позволяет проводить потенциометрические

ивольт-амперометрические измерения;

10)в биохимических процессах может иметь место люминесценция, и, соответственно, они могут исследоваться оптическими спектральными методами;

37

11)биохимические процессы протекают во времени – отсюда применение методов химической кинетики;

12)молекулярные составляющие могут образовывать связи в растворах (сольватация), а также на поверхностях твердых тел (сорбция) – отсюда применение методов разделения экстракцией и сорбционных методов разделения;

13)молекулярные составляющие имеют специфическое давление насыщенных паров – отсюда применение методов дистилляции;

14)молекулярные составляющие могут образовывать кристаллические формы, что позволяет применять метод рентгеноструктурного анализа (ставшего решающим при открытии двойной спирали ДНК).

Нетрудно заметить, что все перечисленные методы относятся

кнаправлениям аналитических исследований биообъектов. Здесь надо сказать и о встречном движении – применении самих биообъектов в аналитических устройствах. В первую очередь это – различные биосенсоры, например ферментный и иммуноферментный анализ.

Биосенсор – устройство, которое использует специфические биохимические реакции с участием изолированных ферментов, иммунных систем, тканей, органелл и цельных клеток для детектирования химических соединений, обычно с помощью электрического, термического или оптического сигнала (согласно терминологии IUPAC, 1992 г.).

Электрохимический биосенсор – это независимое интегрирован-

ное устройство, способное дать специфическую количественную или полуколичественную аналитическую информацию при помощи биологического элемента распознавания (биохимического рецептора), который находится в непосредственном физическом контакте с электрохимическим преобразователем сигнала (согласно терминологии

IUPAC, 1999 г.).

Приведем основные характеристики биосенсоров, ориентируясь на их современный обзор [87]. Отмечается, что более половины из всех известных биосенсоров – это электрохимические. В свою очередь, электрохимические биосенсоры представлены главным образом аффинными и биокаталитическими. Биологическим чувствительным элементом электрохимических биосенсоров могут быть нуклеиновые кислоты, ферменты, белки, клетки, ткани или антитела.

Биокаталитические биосенсоры регистрируют электрический сигнал, который возникает в результате реакции биокомпонента с анализируемым объектом (аналитом). Ферментные биосенсоры, например,

38

можно использовать для обнаружения ксантина, мочевины, лактозы и глюкозы. Высокая селективность и биокаталитическая активность являются основными преимуществами ферментативных биосенсоров.

Аффинные биосенсоры воспринимают селективное аффинное взаимодействие между аналитом и биологическим чувствительным элементом (нуклеиновыми кислотами, антителами, мембранными рецепторами и др.). Активно разрабатываемые ДНК-сенсоры и иммунные биосенсоры – примеры аффинных биосенсоров.

Биомолекулярные взаимодействия можно анализировать с помощью оптических биосенсоров, основанных на резонансных зеркалах, волноводах и поверхностном плазмонном резонансе (плазмон – квазичастица, определяющая ряд оптических свойств металлов и полупроводников). Оптические биосенсоры находят применение в фармакологии, вирусологии, бактериологии, клеточной биологии и молекулярной инженерии.

Ферментативные биосенсоры можно разделить на три поколения. Ферментные сенсоры первого поколения были основаны на кислородном электроде. Органические проводящие соли, производные феррицианида, ферроцен, красители, хиноны и комплексы рутения применялись в качестве лечебных ферментных электродов при создании ферментативных биосенсоров второго поколения. Проводящие полимеры могут быть использованы для соединения электрода с ферментом в ферментативных биосенсорах третьего поколения. Ферментные электроды на основе интерференции также привлекают все больше внимания при разра-

ботке электрохимических ферментативных биосенсоров.

В последние годы наноструктурированные оксиды металлов (НОМ) стали важными наноматериалами для разработки биосенсоров из-за их уникальных особенностей, таких как способность обеспечивать большую площадь поверхности для иммобилизации биомолекул с желаемой ориентацией, превосходная биологическая активность и выдающиеся электрические, оптические и молекулярные свойства. Воспринимающая способность биосенсоров на основе НOМ может быть улучшена путем адаптации характеристик поверхности «биомолекула – оксид металла». Ожидается, что в ближайшие годы биосенсоры на основе НOМ будут играть жизненно важную роль в области здравоохранения и биомедицинских приложений – подробнее о типах и классификации биосенсоров рассказывается в [87].

39

Приведем показательный пример полифункциональности класса веществ, которые находят применение в различных областях биомедицинских исследований и создании биосенсоров (пример один, но разнообразие полифункциональных веществ в данных направлениях множество). Здесь имеются в виду производные феназина и фенотиазина, которые нашли широкое применение в различных областях человеческой деятельности: производство лекарственных препаратов, электрических устройств и оптических элементов. Количественное и качественное определение таких веществ является актуальной задачей современной аналитической химии.

Особое место фенотиазины занимают в области конструирования биосенсоров. Они применяются в качестве медиаторов электронного переноса, полимеризуются в электроактивные пленки, способны к фотосенсибилизации. Установлено, что фенотиазин и его производные показывают антимикотическую активность [110], а также антимикробное [93], антиопухолевое [88], противовоспалительное и анальгезирующее [1] действия.

Электроды с модифицированной поверхностью на основе электрополимеризации фенотиазина тоже являются предметом изучения ученых. Из литературы известно, что электрополимеризованные формы производных фенотиазина часто применяются при конструировании ДНК- и аптасенсоров. Зачастую иммобилизация биокомпонента происходит без образования новых химических связей, а за счет электростатических взаимодействий между отрицательно заряженным сахарофосфатным остовом ДНК и положительными центрами полимера. Такая иммобилизация позволяет сохранить нативную структуру биомолекулы и обеспечивает возможность протекания биоспецифических взаимодействий [75, 140].

2 . 7 . Т р и а д а в з а и м о с в я з а н н ы х з а д а ч б и о т е х н о л о г и и

Два фактора определяют актуализацию биотехнологических исследований:

1) социально-экономическая потребность на получение или переработку какого-либо продукта (социальный заказ);

40