Микрофлора полости рта у детей. Рекомендации для врачей стоматологов, педиатров, гастроэнтерологов и микробиологов

ев Х. И. с соавт., 2008; Smith A. J. et al., 2001; Bimstein E. et al., 2002). Хотя мутантные стрептококки являются этиологическими агентами в разви( тии кариеса, их ассоциация не уникальна. Кариес может возникнуть и при отсутствии этих штаммов. Также было выявлено сообщество му( тантных стрептококков без признаков деминерализации зубной эма( ли (Marsh P. D. et al., 1989; Bowden et al., 1976). При периодонтите на( блюдается увеличение уровня облигатных анаэробных бактерий, вклю( чающих грамотрицательные протеолитические штаммы (особенно бактерии, принадлежащие к родам Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium и Treponema) (Ashimoto et al., 1996; Socransky et al., 1998). Развитие периодонтита связано либо напрямую с этими бактериями, либо косвенно через их способность активировать воспалительный и иммунный процесс (Darveau et al., 1997, Birkedal(Hansen, 1998; Curtis et al., 2001; Lamont R.J. et al., 2002). Все обнаруженные условно(патоген( ные бактерии входят в состав резидентной микрофлоры и находятся там в составе сложных микробных сообществ (Леонтьев В. К., Пахо( мов Г. Н., 2006; Тец В.В. 1998; 2007; O’Toolе G. A. et al., 2000; Costerton W. et al., 2003). Таким образом, среди практически здоровых людей имеются носители бактерий, способных вызвать не только поражение твердых тканей зубов и пародонта, но и способствующих формирова( нию соматической патологии различной локализации (Iacopino A. M., 2001; Mattheus D. C., 2002; Amar S. et al., 2003; Halmstrup P. et al., 2003).

Влияние микрофлоры ПР на общее состояние здоровья человека осуществляется за счёт бактериемии, системной диссимиляции мест( ных медиаторов воспалительного процесса, стимуляции аутоиммун( ных процессов, аспирации или заглатывания продуктов воспаления и других факторов (Abdul Gaffar et al., 2005; Grossi S. G. et al., 1997; Loesche W. J. et al., 2000). Любой, даже непатогенный микроорганизм, при сниженном иммунитете может приобретать патогенные свойства (Heimdahe A. et al., 1985).

Изменения состава микрофлоры полости рта при патологических состояниях условно делят на 4 категории: дисбиотический сдвиг, дис( бактериоз I–II степени, дисбактериоз III степени и дисбактериоз IV степени.

Для дисбиотического сдвига обычно характерно незначительное количественное превышение одного вида УПМ при сохранении нор( мального видового состава микрофлоры ПР. Эту форму сдвига мож( но назвать латентной или компенсированной, при ней могут отсут( ствовать выраженные клинические признаки заболевания.

11

Дисбактериоз I–II степени (субкомпенсированная форма) отли( чается более выраженными изменениями состава микрофлоры: выяв( ляются 2–3 патогенных вида на фоне некоторого снижения титра лак( тобактерий. У больных с I–II степенью дисбактериоза, как правило, имеются и клинические симптомы заболевания.

Дисбактериоз III степени характеризуется выявлением патоген( ной монокультуры при резком снижении количества или полном от( сутствии представителей нормальной (физиологической) микрофло( ры (негемолитический стрептококк, лактобактерии).

Диагноз дисбактериоза IV степени ставят при наличии ассоци( аций патогенных видов бактерий с дрожжеподобными грибами.

Изменения СОПР не всегда соответствуют степени тяжести выяв( ленных дисбиотических сдвигов. Для них характерен полиморфизм проявлений — от признаков катарального воспаления с элементами атрофии до выраженных гиперпластических налетов, типичных для псевдомембранозной формы кандидоза. Нарушение дисбиоза ПР не( посредственно связано с состоянием макроорганизма: наличием ост( рых и хронических заболеваний, дефицитом витаминов, состоянием ЖКТ, снижением общей реактивности организма (Ефимова О. И., 2002). В условиях антимикробного прессинга со стороны макроорга( низма при дисбиозе развиваются адаптационные механизмы, способ( ствующие сохранению и индигенной, и транзиторной (УПМ) флоры.

Чаще всего (87,2 %), развитие дисбактериоза ПР наблюдается у лиц с заболеваниями пищеварительной системы, а именно: с дисбак( териозом кишечника (36 %), хроническим колитом (20,8 %), хрони( ческим гастритом (16,8 %) и др. Хронические заболевания органов пи( щеварения, приводя к развитию «вторичного» иммунодефицита, спо( собствуют вегетированию грибов рода Candida и других УПМ на СОПР, облегчают их инвазию в ткани (Nair R. G. et al., 2001).

Назначение целенаправленного терапевтического лечения заболе( ваний полости рта невозможно без точного знания структуры ее мик( робиоценоза. В последнее десятилетие в клиническую диагностику микрофлоры ПР внедрен ряд высокоспецифичных и высокочувстви( тельных методов, среди которых наиболее широкое распространение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Кузнецов Е. А. с со( авт., 1996; Алексеева Ю. В., 2005). Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персис( тирующих форм микроорганизмов при латентных инфекциях (Соловь( ев А. М. с соавт., 2005; Yuan K. et al., 2001; Becker M. R. et al., 2002).

12

Современные подходы к лечению хронических заболеваний ПР учитывают комплексное применение этиотропной, патогенетической

исимптоматической терапии. Неудачи в лечении дисбиотических из( менений часто связаны с односторонним подходом к терапии, которая заключается в назначении какого(либо противогрибкового или про( тивомикробного средства без учета чувствительности, наличия мик( робных ассоциаций и без учета оценки местной иммунологической резистентности (Бондаренко В. М., 1998, 2008; Данилевский Н. Ф. с со( авт., 2001, Косырева Т. Ф. с соавт., 2009).

Ряд свойств биопленок важен для клиники, поскольку обеспечива( ет входящим в них бактериям значительное увеличение выживаемо( сти в присутствии агрессивных веществ, факторов иммунной защиты

иантимикробных препаратов (Тец В. В., 2003). Бактерии и грибы в составе биопленок выживают в присутствии антибиотиков в количе( ствах в 500–1000 раз больших, чем их минимальная подавляющая концентрация (Тец В. В., 2008; Costerton W. еt al., 2003). Медицинская микробиология и клиническая фармакология только начинают при( ближаться к разработке современных схем использования антимик( робных препаратов с учетом их действия на биопленки. Именно с осо( бенностями выживания бактерий в биопленках в значительной степе( ни связана неэффективность антимикробной терапии и хронизация инфекции, в том числе — и в стоматологической практике (Тец В. В., 2008). Возможно, антибиотики вообще не могут полностью уничто( жить бактерии биопленок, поскольку в последних обнаружены клет( ки (персистеры), находящиеся в силу дифференцировки в состоянии полной устойчивости практически ко всем препаратам (Costerton W. еt al., 2003). Особенности действия антибиотиков на бактерии в биоплен( ках в значительной степени определяются их способностью преодоле( вать поверхностную оболочку и внеклеточный матрикс (Тец В. В., 2007; Davies D., 2003). Часть антибиотиков проникает в биопленки и угнетает или убивает образующие их микроорганизмы: другие же дей( ствуют только на клетки, покидающие сообщества для образования новых биопленок. Таким образом, некоторые препараты не уничтожа( ют биопленки, а только препятствуют увеличению их числа и распро( странению в организме человека.

Состоянию микробного ландшафта полости рта у детей различных возрастных групп, как в норме, так и при появлении основных стома( тологических заболеваний, практически не уделяется внимания. Мик( робиоценозы различных отделов ПР у детей и подростков, как в каче(

13

ственном, так и в количественном отношении, практически не изуче( ны. Отсутствуют данные о признаках, ассоциируемых с вирулентнос( тью условно(патогенных бактерий, вегетирующих в полости рта.

Практическим результатом подобных исследований представляет( ся разработка комплексных лечебно(профилактических программ, учитывающих особенности местного (стоматологического) статуса, иммуномикробиологические особенности и качество соматического здоровья каждого пациента, и имеющих целью улучшение показате( лей здоровья как на органном и системном уровнях, так и на уровне всего организма в целом.

2.Основные методы изучения микробиоценоза полости рта

Определение структуры микробного пейзажа основных отделов ПР у детей различного возраста и уровня соматического здоровья яв( ляется отправной точкой установления особенностей микробиоценоза при воздействии внутренних и внешних факторов. Основными био( топами, микробный пейзаж которых оказывает выраженное влияние на состояние тканей и органов полости рта, являются:

1)ротовая жидкость (смешанная слюна),

2)слизистая оболочка щеки,

3)слизистая оболочка спинки языка,

4)зубной налет,

5)зубо(десневой желобок.

Для получения точного результата имеют большое значение и ус( ловия сбора образцов материала для исследования. Так, смешанную слюну собирают в стерильную пробирку (или флакон) в количестве 1–2 мл. Материал со слизистой оболочки щеки получают стерильным ватным тампоном с площади 1 см2, для чего заранее готовят из прово( локи матрицу указанной площади. Соскоб со слизистой щеки берут, прикладывая металлическую матрицу по линии смыкания зубов в об( ласти моляров. Зубной налет собирают ватным тампоном с вестибу( лярной поверхности нижних моляров. Материал для исследования из зубо(десневого желобка получают с помощью стерильной полоски фильтровальной бумаги стандартного размера. Ватные тампоны и полоску фильтровальной бумаги помещают в специальную транспор( тную среду и доставляют в бактериологическую лабораторию в тече( ние 1 часа.

14

Лабораторный этап изучения микробного ландшафта заключается в раститровке исследуемого материала в изотоническом растворе хлори( да натрия (10–2, 10–4, 10–6) и посеве на плотные питательные среды. По( севы культивируют соответственно в аэробных, анаэробных и микроаэ( рофильных условиях с использованием микроанаэростатов (BBLТ) и газогенераторных пакетов Gas Pack Plus (BBLТ) и Campy Pak Plus (BBLТ) в течение 24–72 часов при температуре 37 оС. Идентификацию энтеробактерий осуществляют с помощью идентификационных систем Enterotube II, Oxi/Ferm Tube, грибов — Mycotube (BBLТ). Идентифика( цию анаэробов проводят на API системах французской фирмы Bio M rieux (API 20 A), стрептококков — (API 20 Strept), стафилококков — (API 20 Staph), H.pylori — (API 20 Campy) (рис. 1–4).

Количество бактерий определяют путем подсчета колониеобразу( ющих единиц на единицу объема исследуемого материала (lg КОЕ/г, lg КОЕ/мл, lg КОЕ/см2) с учетом его массы и разведения. Микроорга( низмы окрашивают по Граму, микроскопируют с увеличением в 630

15

раз с использованием бинокулярного микроскопа «Биолам». Выде( ленные культуры микроорганизмов идентифицируют также по биохи( мическим свойствам.

Для выявления лецитиназы исследуемые культуры засевают на жел( точную среду. Через 18–24 часа инкубации при 37 °С вокруг продуциру( ющих лецитиназу колоний наблюдают зоны опалесценции. Гемолити* ческую активность определяют по наличию вокруг колоний зоны гемо( лиза после суточной инкубации посевов исследуемых культур бактерий на 5 % кровяном ПА при 37 °С (кровь человеческая). В пособии пред( ставлены результаты микробиологического исследования 435 образцов материала, полученного с вышеперечисленных биотопов.

Возрастные особенности микробиоценозов основных биотопов поло( сти рта у детей и подростков были изучены у 7 дошкольников — 4–6 лет, 22 младших школьников — 7–10 лет и 28 подростков — 12–15 лет.

Возрастно(половой состав групп школьников представлен в табл. 1.

Таблица 1

Возрастно&половой состав групп школьников (n)

Статистическую обработку результатов, полученных при изучении микробиоценозов, проводят с использованием методов параметричес( кой и непараметрической статистики. Проводится частотный анализ распределения родов микроорганизмов по зонам обитания и факторам патогенности, что позволяет выявить распространенность штаммов микроорганизмов среди детей различного возраста. Статистическая обpаботка матеpиала выполняется с использованием стандаpтного па( кета пpогpамм пpикладного статистического анализа (Microsoft Excel, Statistica for Windows v. 6.0 или др.). Кpитический уpовень достовеpно( сти нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых pазличий или фактоpных влияний) пpинимается pавным 0,05.

3.Микробиоценозы основных биотопов полости рта практически здоровых дошкольников 4–6 лет

Общеизвестна роль нормальной микробной флоры (НМФ) в под( держании физиологического состояния организма человека. В процес(

16

се эволюции при взаимодействии организма хозяина и микроорганиз( мов происходил отбор определенных их видов, способных к прикреп( лению и колонизации поверхностных образований (СО, эмаль и др.) соответствующих экологических ниш. В результате эти микробиоце( нозы стали использовать организм хозяина как новую среду обитания. Так сформировались симбиотические ассоциации, составляющие НМФ человека и животных.

Полость рта и населяющая его микрофлора являются сбалансиро( ванной экологической системой, в которой существуют корреляцион( ные связи между отдельными семействами, родами и видами анаэроб( ных и аэробных бактерий.

Следует отметить, что микрофлора различных отделов ПР практи( чески здоровых детей дошкольного и школьного возраста остается малоизученной как в качественном, так и количественном отношении, что и определило интерес к созданию настоящего пособия.

У практически здоровых детей 4–6 лет в ротовой жидкости ре( гистрируется 10 родов микроорганизмов и 1 семейство энтеробакте( рий. В 100 % случаев выделяются бактерии рода Streptococcus, в 50 % и более процентах образцов: стафилококки, микрококки, стоматокок( ки, энтеробактерии, лактобациллы и пептострептококки, вейллонел( лы, бифидобактерии и дрожжеподобные грибы рода Candida, чуть менее чем в 50 % образцов РЖ встречаются нейссерии (табл. 2).

Микроорганизмы родов Staphylococcus, Micrococcus, Stomato(coccus, семейства Enterobacteriaceae, дрожжеподобные грибы рода Candida обна( руживаются в небольшом количестве (2,6–3,8 lg КОЕ/мл) (рис. 5). В ко( личестве более 4 lg КОЕ/мл (5,9–7,8 lg КОЕ/мл) высеваются стрептокок( ки, нейссерии, лактобациллы, анаэробные пептококки, пептострептокок( ки, вейллонеллы, бифидобактерии. Гемолитические пептострептококки выделяются в количестве 7,8 lg КОЕ/мл.

Микроорганизмы встречаются в ассоциациях от 6 до 8 видов с пре( обладанием стрептококков, стафилококков, микрококков, лактоба( цилл, анаэробных пептококков, пептострептококков, вейллонелл и бифидобактерий.

На СО щек детей этого возраста также в 100 % случаев обнаружи( вают стрептококки, в 66 % — стафилококки, в 33 % — стоматококки, нейссерии, лактобациллы, энтеробактерии, анаэробные пептококки, пептострептококки, вейллонеллы и порфиромонады (табл. 3).

17

19

Рис. 5. Количество микроорганизмов смешанной слюны практически здоровых детей 4–6 лет и 7–10 лет

Количество выделенных микроорганизмов небольшое и составля( ет от 0,3 до 2,84 lg КОЕ/см2 (рис. 6). Признаки патогенности у бакте( рий не выявляются. Микроорганизмы обнаруживаются в ассоциаци( ях от 2 до 6 на 1 см2 поверхности слизистой оболочки.

На СО спинки языка практически здоровых дошкольников в 66 % случаев выявляются стрептококки, микрококки, стоматококки и анаэробные пептострептококки, в 33 % — нейссерии, лактобациллы, энтеробактерии и вейллонеллы (табл. 4).

Количество микроорганизмов, населяющих данный биотоп, не( большое — от 2,3 до 4,34 lg КОЕ/см2 (рис. 7). Патогенных вариантов не обнаруживаетя. Бактерии выделяются в ассоциациях от 2 до 5 видов.

20