Методическое пособие по разделу «Продукты биотехнологии»

переболевших животных. Принцип ее состоит в том, что при смешивании вируса с сывороткой, содержащей специфические антитела, вирус теряет инфекционные свойства, то есть возможность репродукции в чувствительных клетках. Смесь вируса и сыворотки испытывают на чувствительной к данному вирусу биологической системе (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток). Биологическую систему и методы ее заражения подбирают с учетом наилучшего культивирования, используемого в реакции вируса и его количественного учета.

Результаты РН вируса устанавливают по отсутствию:

1.Гибели или патологоанатомических изменений.

2.Гемагглютининов в экстраэмбрионной жидкости куриных эмбринов.

3.Цитопатического действия, бляшкообразования.

Таким образом, в РН устанавливается способность иммунной сыворотки (антител) подавлять инфекционные свойства вируса. РН проводится в двух вариантах:

1. С постоянной дозой сыворотки и разными дозами вируса. При этом определяется титр вируснейтрализующих антител сыворотки. В реакции участвуют три компонента:

-вирус,

-сыворотка, содержащая антитела,

-биологический объект.

Сложность постановки реакции заключается в подготовке компонентов.

Вирус. Перед постановкой реакции из выделенного возбудителя готовят вируссодержащую суспензию, которая должна обладать инфекционной активностью. Кроме того, перед постановкой реакции вирус титруют. Титр вируса выражается в 50 % дозе. ЛД50 - эта доза вируса, которая вызывает гибель у 50% зараженных лабораторных животных и обозначается 1 ЛД50

31

ИД50 - эта доза вируса, которая вызывает инфекцию у 50% зараженных лабораторных животных и куриных эмбрионов и обозначаетс 1 ИД50

ТКИД 50 - доза вируса, которая вызывает инфекцию у 50% тканевой культуры и обозначается 1 ТКИД 50. ТПД 50- доза вируса, которая вызывает гибель 50 % зараженной культуры клеток и обозначается 1 ТПД50

Титр вируса рассчитывает по методам РИДА и МЕНЧА.

Дозу вируса для РН берут в 100 или 1000 раз больше, то есть берут не 1 ЛД 50, а 100 ЛД50 или 1000 ТПД50, т.е. вирус в опыт берут в оптимальном количестве. С этой целью вирус предварительно титруют в той же тестсистеме.

Сыворотка. В РН используются сыворотки специально иммунизированных лабораторных животных или сыворотки переболевших животных (реконвалесцентов).

Самостоятельная работа студентов

1.Приготовить ряд 10-кратно возрастающих разведений вируса по 1,0 до разведения вируса 10-5

2.Приготовить ряд 2- кратно возрастающих разведений специфической сыворотки по 1,0 до разведения 1: 128.

3.По схеме разделить компоненты в ряды пробирок.

4.Вычислить индекс нейтрализации по формуле.

Для определения титра нейтрализующих антител в исследуемой сыворотке готовят ряд 2- кратно возрастающих разведений, начиная от 1:4 и кончая 1:128.

Схема приготовления 2-кратных разведений сыворотки

Сыворотка 0,2

Физ.раствор 0,6

32

С этой целью берут ряд из 6 пробирок: физиологический раствор наливают в 1-ую пробирку- 0,6 мл, в остальные пробирки по 0,3. Затем берут сыворотку и наливают в первую пробирку 0,2 мл тщательно смешивают, затем из первой пробирки переносят во вторую 0,3 мл из второй в третью 0,3 мл и так до последней пробирки.

Титрование вируснейтрализующих антител с постоянной дозой

вируса

От каждого разведения сыворотки в следующий ряд пронумерованных пробирок наливают по 0,2 мл сыворотки, затем в каждую пробирку добавляют по 0,2 вируса. Одновременно ставят контроли. Затем, штатив встряхнув, оставить при комнатной температуре на 30 минут для инкубирования смеси вируса с различными разведениями сыворотки. После инкубирования смеси вируса вводят белым мышам. На каждое разведение берут по 4 животных.

Титр сыворотки это то разведение, которое предотвращает развитие вируса у 50% зараженных животных.

33

Схема приготовления 10-кратных разведений вируса

Вирус разводят в 10-ти кратно возрастающей дозе, начиная от 1:10 и до разведения 1:100000 (10-5). Для этого в ряд пробирок из 5-ти пробирок наливают физиологический раствор по 0,9. Затем вирус в объеме 0,1 мл вносят в 1-ю пробирку, тщательно смешивают и из 1-й пробирки переносят в 2-ю 0,1 мл, из 2-й в 3-ю, из 3-й вирус в объеме 0,1 мл в 4-ю, из 4-й в 5-ю, из 5- й в 6-ю пробирку по 0,1 мл разведенного вируса.

Титрование вируса с постоянной дозой сыворотки

Втри ряда по 5 пробирок в каждому ряду разливается вирус по 0,2 мл

вразных разведениях. Затем в 1-й ряд пробирок наливается иммунная сыворотка по 0,2 мл; во 2-й ряд нормальная сыворотка так же по 0,2 мл и в 3 ряд физиологический раствор по 0,2 мл.

34

Штатив встряхнуть, оставить при комнатной температуре на 30 минут для инкубирования смеси вируса и сыворотки. После инкубирования смесь вводят восприимчивым лабораторным животным (белым мышам) учитывая тропизм вируса. На каждое разведение вируса в смеси с сывороткой берется по 4 животных.

При оценке результатов специфической нейтрализации вируса необходимо тщательно анализировать причины гибели.

Результаты опыта нейтрализации вируса определяют индексом нейтрализации (ИН). Индекс нейтрализации это отношение дозы вируса в смеси с нормальной сыворотки вызывающей смерть 50% животных к дозе вируса с иммунной сывороткой, т.е. во сколько раз специфическая сыворотка снижает титр вируса по сравнению с нормальной сывороткой

ИН = Тн

Тс

где: ИН – индекс нейтрализации

Тн – титр вируса в присутствии нормальной сыворотки.

Тс–титр вируса в присутствии специфической (иммунной) сыворотки

Если ИН составляет 2, то сыворотка в РН считается положительной. Если ИН меньше 1-2, то сыворотка в РН считается сомнительной и ее повторяют. Если ИН меньше 1, то сыворотка в РН считается отрицательной.

Оборудование и материалы

Белые мыши, стерильный физиологический раствор в пробирках, иммунная сыворотка, нормальная сыворотка, вирус 1000 ТПД, чистые стерильные пробирки, градуированные пипетки 1,0 штативы, фильтровальная бумага, карандаши по стеклу, шприцы, физиологический раствор.

35

Контрольные вопросы

1.Значение РН в диагностике вирусных болезней.

2.Какие компоненты участвуют в РН и как их получают?

3.Как ставится РН с постоянной дозой вируса и разными разведениями сыворотки?

4.Как ставится РН с постоянным разведением сыворотки и разными дозами вируса?

5.Как готовятся двукратные разведения сыворотки?

6.Как готовятся десятикратные разведения сыворотки?

7.Что означает ЛД50, ИД50, ТКИД50, ТПД50?

8.Учет результатов РН.

Тема: полимеразная цепная реакция Цель: 1. Изучить суть полимеразной цепной реакции

2. Ознакомиться с техникой постановки реакций

Содержание занятия

Полимеразная цепная реакция (PCR) – это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную нуклеотидную последовательность в количестве, превышающем исходное в 108 раз. Такая высокая степень обогощения значительно упрощает использование имеющейся нуклеотидной последовательности, в роли которой может выступать как ДНК, так и РНК.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) является уникальным носителем генетической информации у всех существующих на Земле организмов (исключение РНК-содержащие микроорганизмы). ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из соединенных последовательно нуклеотидов. Нити ДНК имеют

36

противоположную направленность: 5′ концу одной нити соответствует 3′- конец второй нити. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. В живой клетке этот процесс происходит следующим образом: с помощью специальных ферментов – гираз происходит расплетение спирали в том ее участке, где должна происходит репликация. Далее водородные связи, связывающие нити, разрываются и нити расходятся. Одна из цепей (“+” или смысловая) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении – от 5’ – конца к 3’ – концу. Этот процесс осуществляется по принципу комплиментарности ферментом ДНК-полимеразой. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока – небольшого начального двух цепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии небольшого одно-цепочечного фрагмента ДНК, называемого праймером, с комлиментарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. Репликация одновременно идет и на второй нити ДНК (“-” или антисмысловой), только наращивание цепи происходит в обратном направлении. В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная.

Таким образом, цикл репликации ДНК включает в себя три основные стадии:

1.расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация);

2.присоединение праймеров;

3.достраивание цепи дочерной нити.

В ПЦР эти процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании раствора до 93-96ºС происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу – присоединение или “отжигу” праймеров – инкубационную смесь охлаждают до 50-65ºС. Далее смесь нагревают до 70-72ºС – оптимум работы

37

tag-ДНК-полимеразы – на этой стадии происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова.

Поскольку наращивание дочерних нитей ДНК должно идти одновременно на обеих цепях материнских ДНК, то для репликации второй цепи также требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера: один для “+” цепи, второй “-” - цепи. Присоединившись к противоположенном цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем

многократно удвоен или амлифицирован. Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов.

Процесс амплификации, в данном случае, заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации двунитевой молекулы, отжига праймеров с комплиментарными последовательностями и последующей достройки полинуклотидных цепей с этих праймеров ДНК – полимеразой.

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦРанализ обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦРанализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов –10 –10 клеток).

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходства химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические

38

выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР – диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Контрольные вопросы

1.Значение полимеразной цепной реакции в практике

2.Сущность полимеразной цепной реакции

3.Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний

39

ЛИ Т Е Р А Т У Р А

1.Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. М; Агропромиздат, 1987, 347 с.

2.Егоров Н.С. Промышленная микробиология. М. Высш.шк., 1989, 688 с.

3.Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М., Агропромиздат, 1987.

4.Мукашева Г.Д. Практическое занятие по микробиологии. Алматы, «²азаº университетi», 1991.

5.Канетере В.М. Теортеические основы технологии микробиологических производст. М.: Агропромиздат, 1990, 271 с.

6.Толысбаев Б.Т., Иванова Г.М., Музапбаров Б., Тулемисова Ж.К. Практикум по микробиологии и ветеринарной санитарии. Алматы, РИМЦ Минсельхоз РК 1996.

7.Загребельный С.Н. Биотехнология. Учебное пособие. Новосибирск, 2001.

8.Тулемисова Ж.К. Учебное пособия по сельскохозяйственной микробиологии. Алматы., Издательский Центр АГУ им.Абая 2001.

9.Сюрин В.Н. и др. Ветеринарная вирусология, изд. Колос,1984 с.107-110.

10.Справочник. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. М.Агропромиздат,1986, с.66-78.

11.Горский Б.В., Нуриев Г.Г., Гумеров Н.К. Основы общей ветеринарной вирусологии. М., Колос, 1978 с.172-173.

12.Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии М.ВО «Агропромиздат», 1989 с. 59-79.

13.Ш.Б.Мырзабекова. Общая вирусология. Алматы, 1993. С.65-66.

Тулемисова Ж.К., Касенова Г.Т., Музапбаров Б.

МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ по разделу «Продукты биотехнологии»

дисциплины «Биотехнология микроорганизмов» для студентов специальности «Биотехнология»

Баспаға қол қойылды 2014ж. Пішімі 60х84 1/16. Қағазы офсеттік.

Таралымы 100 дана. Тапсырыс №.14.

«Нур-Принт» баспаханасы.

Тел.: 8(727) 308-25-46, +7 777 3037290 E-mail: nur-print@mail.ru www.nur-print.kz

40