Методическое пособие по разделу «Продукты биотехнологии»

Тема: реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Цель: 1. Изучить сущность РТГА.

2. Освоить технику постановки РТГА.

Содержание занятия.

Феномен гемагглютинации эритроцитов вирусами также используется в реакции торможения гемагглютинации.

РТГА - является высокоспецифической серологической реакцией.

РГА - несерологическая, т.к. в ней не участвует сыворотка, участвуют только два компонента - вирус и эритроциты. В РТГА кроме вируса и эритроцитов участвует еще и сыворотка. В РТГА подтверждается вирусная гемагглютинация с помощью специфической сыворотки.

Суть РТГА заключается в том, то гемагглютинация эритроцитов вирусами тормозится специфическими антителами, которые нейтрализуют гемагглютинирующую активность вируса.

Цель РТГА:

1.Идентификация выявленного в РГА вируса с помощью известной специфической сыворотки;

2.Идентификация антител в сыворотке крови больных и переболевших животных с помощью известного вируса;

3.Определение титра антител.

РТГА - широко используется для диагностики некоторых вирусных инфекций (грипп птиц, животных, болезнь Ньюкасла, парагрипп крупного рогатого скота, аденовирусной инфекции и др.).

Для РТГА в качестве антигена используется тот же материал, что и для РГА, но уже оттитрованный в РГА и для постановки РТГА обычно берется 4 ГАЕ. Например, если 1 ГАЕ в РГА установлена в разведении 1 на 320, то в 4 ГАЕ будет в разведении 1:80.

21

Эритроциты для РТГА так же используются в - 1% концентрации и от тех же животных, что и в РГА. Однако, необходимо учитывать то, что гемагглютинирующая активность вируса может подавляться не только специфическими антителами, но и термолабильными и термостабильными ингибиторами, которые содержатся в нормальных сыворотках человека и животных. Поэтому от этих ингибиторов освобождаются путем прогревания сывороток при температуре 56-62 °С в течении 30 мин, путем обработки трипсином, папаином, ацетоном, каолином и т.д.

При постановке РТГА обязательно ставят контроли эритроцитов на возможность спонтанной агглютинации.

РТГА ставится в панелях из плексигласа, ингридиенты берутся в дозах 0,25 мл. Результат РТГА учитывают по характеру осадка эритроцитов. В разведениях сыворотки, содержащих высокую концентрацию специфических антител, гемагглютинирующая активность полностью подавляется и эритроциты оседают на дно лунки.

Схема постановки РТГА представлена в таблице

22

Самостоятельная работа студентов

Приготовить различные разведения сыворотки. Для этого в 1 ряд панели во все лунки разлить по 0,25 мл физиологического раствора. В 1 лунку внести сыворотку в разведении 1: 10 - 0,25 мл, перемешать и перенести 0,25 во 2 лунку. Из 2-ой в 3-ю и так до 12-той лунки. Затем во все лунки добавить вирус (4 ГАЕ) по 0,25 мл в каждую лунку, встряхнуть и оставить при комнатной температуре на 30 мин. За это время, если в исследуемой сыворотке крови есть специфические антитела, то произойдет специфическое взаимодействие между антигеном и антителом. Через 30 минут во все лунки добавляют 1% взвесь эритроцитов, по 0,5 мл встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Затем читают реакцию, определяют наличие антител в сыворотке и его титр. Оценивают реакцию крестами по характеру осадка эритроцитов. За положительную реакцию принимают оседания эритроцитов ввиде пуговки (отсутствие гемагглютинации), за отрицательную реакцию –оседание эритроцитов ввиде зонтика. Учет реакции в РТГА обратный по сравнению с РГА.

Оборудование и материалы.

Панели из плексигаса, пипетки на 1 и 5 мл, вируссодержащий материал, специфическая сыворотка, 1% взвесь эритроцитов, физ.раствор, сосуд с дезинфицирующим раствором, таблицы по теме.

Контрольные вопросы

1.Значение РТГА.

2.Почему РТГА называется серологической и является специфической?

3.Чем отличается РГА от РТГА?

4.Механизм торможения гемагглютинации эритроцитов.

5.Какие ингредиенты входят в РТГА и как осуществляется подготовка их к реакции.

23

Тема: реакция диффузионной преципитации (РДП )

Цель. 1. Изучить сущность РДП.

2. Освоить технику постановки РДП.

Содержание занятия

Сущность РДП заключается в том, что одноименные специфические антиген и антитело, помешенные в агаровом геле на определенном расстоянии друг от друга дифундируют и на месте встречи друг с другом образуют преципитат в виде белых полос. При этом скорость диффузии антигена и антитела бывает различной и зависит от величин молекул, чем меньше молекулы, тем быстрее дифундируют в геле и наоборот.

РДП является быстрым методом серологической диагностики вирусных болезней.

Цель РДП:

1.Идентификация вирусного антигена с помощью известной (специфической) сыворотки.

2.Идентификация антител в сыворотке крови больных и переболевших животных с помощью известного антигена.

3.Определения титров антигена и антител.

Вируссодержащий материал может содержать несколько различных антигенов, которые ведут себя независимо друг от друга и образуется при этом несколько линий преципитации. Сколько комплексов антиген-антитело, столько и будет зон преципитации. При постановке РДП используются различные методы диффузионной преципитации. Наиболее чувствительным и более простым является метод Оухтерлони.

Для постановки РДП необходимы следующие ингредиенты-антигены, сыворотки, агаровый гель. Обычно используют 1-1,5 % раствор агара в физиологическом растворе натрия хлора с добавлением в качестве концентрата раствора мертиолята. Горячий агар разливают тонким слоем на предметные стекла (можно в чашки Петри и в капиллярах).Толщина слоя

24

должна быть 1мм, стекла должны быть чистыми, обезжиренными и лежать строго на горизонтальной поверхности, после застывания агара вырезают лунки, в которые пастеровскими пипетками наливают антигены и сыворотки. Для определения титра антител в центральную лунку - антиген, а вокруг - сыворотки в различных разведениях и наоборот. Для определения титра антигена, сыворотку наливают в центральную лунку, а антиген в разных разведениях в периферические лунки. Лунки должны быть пронумерованы. Реакцию выдерживают 12 часов и более, проводят оценку результатов. Лучше читать реакцию на темном фоне или при использовании осветителя. Для исключения неспецифической преципитации ставят контроль нормальных антигенов и нормальных сывороток. На месте встречи антигена и сыворотки образуется белая полоса преципитации. Линий преципитаций может быть несколько, что говорит о различных антигенах; может быть - слияние этих линий, что говорит о их серологической идентичности; линии могут пересекаться, что говорит о их полном антигенном различии, еще может возникнуть неподвижный перекрест, так называемая шпора, что говорит о реакции неполной идентичности, о наличии как общих, так и частных антигенов.

Достоинства РДП заключаются в простоте техники постановки, нетребовательность к чистоте компонентов, не требуется стерильности, минимальная потребность в компонентах. Недостатками же этой реакции относительно низкая чувствительность.

Самостоятельная работа студентов.

1.Градуированной пипеткой разлить горячий агар на предметные стекла.

2.После застывания агара прорезать луночки и отсосать агар.

3.Разлить в лунки антиген и сыворотки.

4.Поместить предметные стекла в чашки Петри и поставить в термостат.

25

Оборудование и материалы.

1% агаровый гель, антиген, сыворотки, градуированные (1,2 мл ) и пастеровские пипетки, пестончики, груши, предметные стекла, чашки Петри, штативы, таблицы, раздаточный материал.

Контрольные вопросы

1.Значение РДП в диагностике вирусных болезней.

2.Преимущество РДП перед другими серологическими реакциями.

3.Варианты использования РДП.

4.Компоненты РДП.

5.Макропреципитация в агаровом геле (в чашках Петри). Микропре-

ципитация (на предметных стеклах).

6.Учет результатов РДП.

7.Техника постановки РДП.

Тема: реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Цель: 1. Знакомство с люминесцентным микроскопом и правилами работы с ним.

2. Изучить методику приготовления препарата.

Содержание занятия.

Люминесценция от латинского слова lumen – свет и esentia – суффикс, обозначающий слабое действие в виде флуоресценции или фосфоресценции.

Флуоресценция - свечение возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания (длится от 10-9 до 10-7 с.).

Фосфоресценция - свечение, продолжающееся длительное время по окончании процесса возбуждения. В зависимости от вида возбуждающейся энергии различают: биолюминесценцию - это свечение, наблюдаемое у некоторых живых организмов за счет энергии биохимических реакций;

26

рентгенлюминесценцию – свечение под действием рентгеновых лучей, фотолюминесценциюсвечение, возникающие под действием света.

Вещества, обладающие первичной флуоресценцией называются флуорохомами (флуоресцирующие красители). Окраска объекта флуорохромами называется флуорохромированием. Наиболее часто применяется краска флуоресцеин изотиоционата (ФИТЦ), которое дает антителам салатнозеленое свечение. Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии используется ближняя ультрафиолетовая и синефиолетовая части спектра. Люменесцентный микроскоп устанавливают в затемненной комнате на прочном столе, не должно быть никакой вибрации. Сила тока при работе 4-5А. В настоящее время в вирусологичесеких исследованиях широко применяются люминесцентные микроскопы серии МЛ (1,2,3) и Люмам. Сущность метода флуоресцирующих антител заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромами, сохраняют способность вступать в специфические реакции с соответствующими антигенами, т.е. как при всех иммунологических методах наблюдается взаимодействие между антигеном и антителом. При этом флуорохромы не нарушают иммунологическую специфичность молекул антител, образующийся комплекс “антиген-антитело” обнаруживается под люминесцетным микроскопом, благодаря присутствию в нем флуорохромов.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) имеет значение в диагностике многих вирусных болезнейбещенство, грипп, оспа и др. В исследуемом материале с помощью РИФ выявляется антиген. В РИФе можно изучать локализацию вирусов в клетке, изучать процесс взаимодействия вирусов с клеткой. Метод иммунофлуоресценции является экспресс - методом (быстрым ) диагностики. РИФ ставится двумя способами: прямым или одноступенчатыми и непрямым или двухступенчатым.

Прямой метод флуоресцирующих антител предложен Кунсом в

1942году, технически более прост. Сущность заключается в том, что на

27

предметном стекле готовится препаратотпечаток или мазок из патологического материала от больных или павших животных, зараженные монослойные культуры клеток. Затем после фиксации мазка охлажденным до 0-2 С ацетоном 15-20 минут или этанолом 15 минут наносится 2-3 капли флуоресцирующих антител в рабочем титре, выдерживают в термостате 3040 минут и промывают дистиллированной водой. Если в мазке есть специфический антиген, то происходит взаимодействие между антигеном и антителами меченой сыворотки, и комплекс антиген - антитело при микроскопии будет светиться.

Если антигена нет в исследуемом материале или антитела не специфичны, то антителам сыворотки не с чем будет связываться, таким случаем при промывании препарата, антитела смоются водой и свечения под микроскопом не будет, т.е. результат РИФ – отрицательный. При окраске ФИТЦ –коньючатом.

Оценка реакции будет:

++++ - сияющее изумрудно зеленые свечение;

+++ - яркозеленоватые свечение;

++- умеренно зеленоватое свечение

+- слабо серовато-зеленоватое свечение;

-- свечение препарата отсутствует.

Непрямой метод флуоресцирующих антител. Флуоресцирующая сыворотка при этом методе адсорбируется не на вирусном антигене, а на посреднике - на специфических неокрашенных антителах. При непрямой методе флуоресцирующих антител участвуют следующие компоненты:

1.Вирусный антиген (выявляют в приготовленном мазке).

2.Специфическая нефлуоресцирующая сыворотка или глобулин ( 1-ая ступень ).

28

3. Флуоресцирующая антивидовая сыворотка или глобулин (получают путем гипериммунизации кролика сывороткой или глобулинами того вида животных, на которых получали специфическую нефлуоресцирующую сыворотку, 2-ая ступень).

Если в мазке есть специфический антиген, то при добавлении специфической нефлуоресцирующей сыворотки (1-ая ступень) после 30-40 минутного контакта образуется комплекс антиген-антитело, но он невидим и не обнаруживается под люминесцентным микроскопом. Для того, чтобы его увидеть препарат промывают водой и дополнительно обрабатывают флуоресцирующей антивидовой сывороткой, которая адсорбируется на комплексе антиген-антитело, образуется сложный комплекс антиген- антитело-антивидовое антитело, который и светиться под микроскопом. Если в исследуемом материале нет специфического антигена, то комплекс антиген-антитело не образуется, антитела сыворотки при промывании смоются водой и при добавлении на препарат антивидовой флуоресцирующей сыворотки светящийся комплекс антиген-антитело- антивидовое антитело не образуется и ничего не будет светиться. Чувствительность непрямого метода флуоресцирующих антител выше, чем прямого. Кроме того, непрямой метод РИФ позволяет ставить диагноз на многие вирусные инфекции.

Самостоятельная работа студентов.

Взять чистые предметные стекла, приготовить препарат-отпечаток или мазок. Высушить мазок на воздухе, фиксируют в чистом охлажденном ацетоне –15-20 минут или в и метиловом спирте в течении 5 минут. Реакцию ставить прямым методах антител. На мазок наносят 2-3 капли антивирусной флуоресцирующей сыворотки и окрашивают 30 минут во влажной камере, для быстрого окрашивания препараты ставят в термостат. Затем препарат промывают дистиллированной водой, подсушивают и микроскопируют.

29

Оборудование и материалы.

Люминесцентный микроскоп, препараты-отпечатки, антивирусные люминесцирующие сыворотки, стерильная дистиллированная вода, пастеровские пипетки, пипетки на 1,0-5,0 мл, влажная камера, предметные стекла, фильтровальная бумага, нефлуоресцирующее иммерсионное масло, таблицы по теме, раздаточный материал.

Контрольные вопросы

1.Принцип работы люминесцентного микроскопа.

2.Сущность РИФ.

3.Значение РИФ в диагностике вирусных болезней.

4.Флуоресцирующие антитела.

5.Прямой метод флуоресцирующих антител.

6.Непрямой метод флуоресцирующих антител.

7.Обнаружение антигена в исследуемом материале.

8.Получение гипериммунных антиглобулиновых сывороток.

9.Техника приготовления препаратов для РИФ.

Тема: реакция нейтрализации Цель: 1. Определить вируснейтрализующую активность

исследуемой сыворотки в РН.

2. Инденфицировать вирус в исследуемом материале в РН.

Содержание занятия

Реакция нейтрализации - это наиболее универсальная, высокоспецифическая реакция, которая широко используется в вирусологической практике и служит эталоном при оценке других реакций в вирусологии, РН используют с целью идентификации выделенного вируса или обнаружения и титрования антител в сыворотках крови больных и

30