Методическое пособие по разделу «Продукты биотехнологии»

При этом бройлеры опытной группы в расчете на 1 голову съедали на 120 г, или 3,25% больше корма, а их масса тела превосходила таковую в контроле на 7,8%.

В последние годы особый интерес вызывает проблема создания новых пробиотиков, содержащих бифидо- и лактобактерии. Механизм действия их на организм человека и животных должен быть направлен на конкуретное - вытеснение условно-патогенных бактерий из состава кишечного биоценоза и на сдерживание развития у них фактора патогенности.

Лактобациллы или представители резидентной микрофлоры применяются в качестве пробиотиков в здравоохранении и ветеринарии. Это связано с указанными ранее биологическими свойствами молочнокислых бактерий таких как: антагонизм, адгезивность, колонизирующая активность, кислотообразование, иммуностимуляция, противоопухолевые и холестеринутилизирующие свойства.

Мнение о полезном эффекте пробиотиков базируется на следующих фактах:

-безмикробные животные более чувствительны к заболеваниям, чем их близнецы с полной кишечной флорой. Например, безмикробные морские свинки могут быть убиты 10 клетками Salmonella enteretidis, тогда как для свинки с нормальной микрофлорой необходимо 109 клеток;

-введение антибиотиков животным снижает их резистентность к болезням (выявили у мышей при сальмонеллезной, шигелловой и вибриозной инфекциях, у птицы повышенная выживаемость сальмонелл в кишечнике часто связана с включением в рационы антибактериальных ростовых стимуляторов).

Механизм действия пробиотиков пока неизвестен, хотя существует несколько гипотез. Имеются многочисленные доказательства, подтверждающие, что действие пробиотиков связано со стимуляцией иммунной системы человека.

11

Пробиотики оказывают регенирующее действие на различные структуры слизистой кишечника. Было изучено их влияние на морфофункциональные характеристики тонкого отдела кишечника новорожденных поросят при гастроэнтерите. Патогистоморфологические исследования показали, что после их применения в двенадцатиперстной кишке восстанавливались бокаловидные клетки, отвечающие за выработку слизи и бактерицидного фермента лизоцима, в тощей кишке – морфология и функции слизистой оболочки, кровоснабжение, ферментативная и секреторная активность, в повздошной кишке – морфология ворсинок и крипт. Таким образом, под действием пробиотических препаратов нормализовалась структура слизистой не только в конкретном отделе кишечника, но и на всем его протяжении.

Применение пробиотиков ослабленным животным предупреждает развитие феномена транслокации условно-патогенных микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта в органы и ткани. Согласно результатам бактериологических исследований у животных, получавших пробиотический препарат, снижалась частота выделения из внутренних органов патогенных эшреихий, стафилококков и сальмонелл.

Эти данные свидетельствуют о том, что пробиотики не только нормализуют кишечный биоценоз и профилактируют желудочно-кишечные болезни молодняка, но также влияют на многие системы, связанные с повышением колонизационной резистентности кишечника.

Анализ имеющихся литературных данных свидетельствует о многогранном воздействии пробиотиков на микроэкологию пищеварительного тракта. Наиболее важными аспектами взаимодействия пробиотических штаммов с микрофлорой кишечника и организмом животного являются образование антибактериальных веществ, конкуренция за питательные вещества и места адгезии, изменение микробного метаболизма (увеличение или уменьшение ферментативной активности),

12

стимуляция иммунной системы, противораковое и антихолестеринемическое действия.

Представленные выше данные однозначно свидетельствуют, что пробиотики оказывают многообразное действие как на микрофлору желудочно-кишечного тракта, так и на обменные функции организма животных, а пробиотический эффект различных бактерий определяется суммой специфических активностей, которыми эти организмы обладают. Молочнокислые бактерии, например, оказывают полезное действие посредством образуемых антибиотиков, продукции органических кислот и путем изменения величины рН, образования перекиси водорода, снижения окислительно-восстановительного потенциала среды, конкуренции за места адгезии и питательные вещества. Бактерии других систематических групп, и

вчастности рубцовые виды, могут продуцировать биологически активные вещества, необходимые для роста других бактерий, утилизировать вредные продукты обмена веществ.

Таким образом, молочнокислые бактерии играют важную роль в составе пробиотиков. Изучение биологических свойств этих бактерий, разработка и усовершенствование технологии получения биопрепаратов на их основе способствует развитию перспективного направления исследований

вобласти сельскохозяйственной биотехнологии. Об этом свидетельствует неослабевающий интерес исследователей всего мира к вопросам выделения и изучения новых культур молочнокислых бактерий, создания новых микробных консорциумов, ассоциаций, микробиотиков, пробиотиков, синбиотиков и других биопрепаратов с использованием различных видов молочнокислых бактерий или их сочетаний с другими видами микроорганизмов.

13

Тема: ферменты микроорганизмов Цель занятия: освоить методику получения безклеточной

культуральной жидкости в качестве источника ферментов

Содержание занятия

Ферменты – это белки с высоким молекулярным весом образующие в воде коллоидные растворы. Все биохимические процессы, протекающие в живом организме в связи с его обменом веществ, ростом и развитием, совершаются при участии ферментов, или энзимов, - биологических катализаторов, вырабатываемых клетками организма.

Ферменты были открыты русским химиком в 1814 году К.С.Кирхгофом. В живой клетке действие ферментов происходит упорядочено строго согласовано. Ферменты локализованы в различных клеточных структурах (в мезосомах, митохондриях, цитоплазматической мембране и др.). Некоторые ферменты выделяются микроорганизмами наружу (в среду), их принято называть экзоферментами. Они играют большую роль в подготовке пищи к ее поступлению в клетку. Происходит внеклеточное «переваривание» пищи – расщепление сложных веществ субстрата (крахмала, белков) на более простые вещества, способные проникать в клетку. Другие ферменты, не выделяющиеся при жизни клетки в окружающую среду, называют эндоферментами (внутриклеточными). Эти ферменты участвуют во

внутриклеточных процессах обмена веществ.

Для извлечения ферментов из микробной массы необходимо увеличить проницаемость клеточных оболочек, нарушить целостность клеток. Для этого существуют несколько способов:

1.Механическое разрушение живых или высушенных клеток

2.Обезвоживание тепловое или водоотнимающими реактивами

3.Многократное попеременное замораживание и оттаивание;

4.Автолиз (самопереваривание).

14

Наиболее простой способ – механическое разрушение клеток растиранием со стеклянным порошком свежей или высушенной микробной массы. Для этого 3 г микробной массы смешивают с 25 г стеклянного порошка и 7 мл 1/15 М фосфатного буферного раствора с рН – 7,0. Полученную густую кашицу растирают в ступки в течение 5 минут. Затем в полученную массу добавляют 6 мл того же буферного раствора и центрифугируют. Центрифугат отсасывают пипеткой, который применяют в качестве источника ферментов.

Материалы и оборудование

Центрифуга, культуры бактерий, пипетки, стеклянный порошок, ступки с пестиками, 1/15 М фосфатный буферный раствор, спиртовки.

Контрольные вопросы

1.Что такое ферменты?

2.Экзо- и эндоферменты?

3.Способы извлечения ферментов из микробной массы?

4.Способ механического разрушения клеток?

Тема: основы иммунологии Цель занятия: 1. Ознокомится с основами иммунологии,

специфической профиактики

2.Изучить характеристику различных вакцин, применяемых в ветеринарии

Содержание занятия

Иммунитет – это совокупность защитных механизмов, обеспечивающих сохранение постоянства внутренней среды и функции организма при вторжении и распространении болезнетворных микробов, их токсинов или других чужеродных тел белковой природы.

Иммунитет создается за счет накоплении антител против возбудителей инфекционных заболеваний в переболевшем организме и при искусственном

15

введении в организм ослабленных и убитых возбудителей или продуктов ихз жизнедеятельности.

Антигены, те вещества которые несут признаки генетической чужеродности и при введении в организм вызывают развитие специфических иммунологических реакций. Антигенными свойствами обладают вирусы, бактерии, м икроскопические грибы, простейшие, экзо- и эндотоксины микроорганизмов.

Антигенность – способность антигена вызывать иммунный ответ. Иммуногеннность – спосбность создавать иммунитет. Специфичность – особенность строения веществ по которой антигены

отличаются друг от друга.

Антитела это специфические белки – иммуноглобулины, образующиеся в организме определенными клетками под воздействием антигена и обладющие свойством специфически с ним связываться.

Вакцина - биологический препарат, приготовленный из живых или инактивированных микробов. Изготавливают живые ослабленные (аттениуированные), убитые (инактивированные), корпускулярные (из цельных микробных клеток), химические (из антигенных фракций), генноинженерные (полученные методами генной инженерии).

Вакцину применяют с предохранительной целью, здоровым животным. Вакцину вводят здоровым животным, после чего у них через 10-14-20 дней вырабатывается иммунитет, в зависимости от вида инфекций.

Аттенуация – ослабление микробов различными мутагенами, путем селекции, путем использования многочисленных пассажей и т.д. При этом микроб утрачивает патогенные и вирулентные свойства возбудителя, но сохраняет иммуногенные.

Инактивация – потеря способности микробов продуцироваться в организме, т.е. теряются их инфекционные свойства, но сохраняются антигеннные.

16

Иммунные сыворотки получают путем гипреиммунизации лабораторных животных – введения в увеличивающихся в дозах возбудителя, против которого хотят выработать сыворотку. В результате гипреиммунизации животных (до 3-х месяцев) у них вырабатываются антитела.

Полученная сыворотка с высоким содержанием антител способна предохранить животное от заболеваний или предотвратить дальнейшее развитие болезни.

Оборудование и материалы

Окрашенные мазкм микробов возбудителей, микроскопы, кедровое масло, вакцинные штаммы

Контрольные вопросы

1.Что такое иммунология?

2.Что такое иммунитет?

3.Дайте определения антител, антигена.

4.Что такое вакцина?

5.Виды вакцин.

6.Дайте определения аттенуация и инактивация.

Тема: реакция гемагглютинации

Цель: 1. Изучить сущность реакции гемагглютинации 2. Освоить технику постановки РГА

Содержание занятия

В основе реакции гемагглютинации - лежит адсорбция вируса на поверхности эритроцитов и сопровождается склеиванием их.

РГАявляется не специфической реакцией, специфичность устанавливается с помощью специфических сывороток в реакции

17

Гемагглютинирующими свойствами обладают многие вирусы. Эти свойства связаны с вирусными гемаглютининами. Гемаглютинины это сложные белковые тела, расположены на поверхности вириона и связаны у простых вирусов с капсидом, а у сложных вирусов с наружной липопротеидной оболочкой. Гемагглютинины обладают антигенными свойствами. В результате физико-химических процессов между эритроцитами и вирусами происходит склеивание эритроцитов, и выпадение их в осадок.

При постановке РГА требуются следующие компоненты:

1.Исследуемый вирусосодержащий материал (носоглоточные смывы, аллантоисная и амниотические жидкости, оболочки куриного эмбриона жидкости и клеточные фракции культуры клеток и т.д.).

2.1 % взвесь эритроцитов.

3.0,85 % физиологический раствор.

РГА ставится в панелях из плексигласа. Готовят ряд двукратных разведений вируса (начиняя от 1:20 и до 1:40960) в объеме 0,25 мл. С этой целью физиологический раствор в объеме 0,25 мл разливают во все 12 лунок одного ряда панели, вируссодержащий материал (предварительно разведенный 1:10) наливают только в первую лунку и смешивают с физраствором. Затем из 1-й лунки отсасывают пипеткой 0,25 мл и переносят его во вторую лунку, смешивают и из второй 0,25 мл переносят в третью и так до последней лунки. Затем в каждую лунку добавляют 1 % взвесь эритроцитов по 0,25 мл встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30-40 минут. При постановке реакции обязательно ставят контроль реакции – к физраствору добавляют взвесь эритроцитов.

18

Гемагглютинирующая активность зависит от вида, титра, пасажа вируса, от видовой принадлежности эритроцитов, от возраста, пола донора, от температуры, рН среды и т.д.

В РГА не определяется вид вируса, а выявляется его наличие и его титр. После РГА вирус можно отделить от эритроцитов путем центрифугирования и получить его чистую суспензию.

Самостоятельная работа студентов

1 мл пипеткой в каждую лунку одного ряда панели внести по 0,25 физиологического раствора. Затем в первую лунку добавить вирус в разведении 1:10 0,25 тщательно перемешать и взять 0,25 смеси и из первой лунки перенести во вторую, из второй в третью и так до последней лунки, и из последней 0,25 вылить сливную чашку. Таким образом получают разведение вируса от 1:20 до 1: 40960. Затем в эти же лунки добавляют 1 % взвесь эритроцитов по 0,25. Осторожно встряхивают и оставляют для контакта при комнатной температуре на 30 минут. Через 30 минут читают и определяют титр вируса, результаты оценивают крестами. Титром вируса считают наибольшее его разведение, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов не менее чем на два креста.

Оборудование и материалы

Вируссодержащий материал, 1 %-ная взвесь эритроцитов кур, физиологический раствор, панели, пипетки на 1 и 5 мл, сосуд с дезинфицирующим раствором, таблицы по теме, раздаточный материал.

Контрольные вопросы

1.Вирусные гемагглютинины.

2.Механизм гемагглютинации.

3.Факторы, влияющие на гемагглютинирующую активность вируса.

4.Компоненты РГА. Подготовка вируссодержащего материала и эрит -

роцитов к реакции. 5.Техника постановки РГА.

6.Диагностическое значение РГА.

20