Возбудители пищевых токсикоинфекций и бактериотоксикозов. Учебно-методическое пособие

адаптационными возможностями. Их выживание в неблагоприятных условиях обеспечивает клеточная стенка, прочность которой сообщает ее основной компонент – пептидогликан. Они хорошо переносят высушивание, сохраняя вирулентность; погибают при прямом воздействии солнечного света в течение 10-12 ч. Довольно устойчивы к нагреванию — при 70-80°С погибают за 20-30 мин; сухой жар убивает их за 2 ч. Длительно сохраняются в замороженных продуктах (- 20°С), обладают выраженной солеустойчивостью, размножаются в продуктах с содержанием поваренной соли до 15-17%. Устойчивы к воздействию кислой среды, поэтому выживают при мариновании (не погибают даже при рН = 3,0).

Необходимо отметить, что энтеротоксин, выделяемый стафилококками и вызывающий пищевое отравление, еще более устойчив к воздействию факторов окружающей среды, чем сами микроорганизмы. Это термостабильный (разрушается только при автоклавировании при 120°С в течение 30 минут), устойчивый к действию кислот, низких температур токсин.

Факторы патогенности. Пищевые отравления вызывают только энтеротоксигенные штаммы St. aureus, иными словами-те,которыеспособнывырабатыватьэнтеротоксины. Токсинообразование наблюдается в диапазоне температур 1939 °С, но оптимальное токсинообразование отмечается при 28-37°С. При температурах 7-18°С и 39-50°С стафилококк может размножаться, но токсинообразования нет.

По своим антигенным свойствам энтеротоксины подразделяется на различные серологические типы: А, В, С (несколько подтипов), D, Е, G, H, I, J, K, L и др. К настоящему времени их идентифицировано около 23. Все типы энтеротоксина обладают общими характеристиками: вызывают сходные клинические проявления, устойчивы к действию высоких температур и протеолитических ферментов. Последнее обу-

словливает сохранение активности токсинов в продуктах

61

питания после их термообработки, а также в желудочнокишечном тракте.

Действие стафилококковых энтеротоксинов аналогично действию энтеротоксинов, образуемых микроорганизмами иных таксономических групп.

Минимальная доза энтеротоксина, содержащегося в пищевом продукте, необходимая для развития стафилотоксикоза у человека, составляет 20 нг.

Стафилококк хорошо размножается, продуцируя энтеротоксин, на самых различных пищевых продуктах. Очень благоприятной средой для развития стафилококков является молоко. При температуре 35-37°С энтеротоксин образуется в молоке через 5-8 часов, а при комнатной температуре (1820°С) – через 8-18 часов. Причиной интоксикации могут являться творог и творожные изделия, изготовленные из не пастеризованного молока, сычужные сыры, сметана, брынза. Образование энтеротоксина возможно также в кипяченом и пастеризованном молоке, в молочных продуктах при попадании в них золотистого стафилококка уже после тепловой обработки.

Также благоприятной средой для размножения стафилококков и образования энтеротоксина являются кондитерские изделия с заварным кремом, которые содержат много влаги, крахмала и в относительно большой концентрации сахар.

Хорошей средой для развития стафилококков является имясо.Энтеротоксинвмясномфаршенакапливаетсяпритемпературе 35-37°С через 14-16 часов, в паштете – через 10-12 часов, в готовых котлетах при комнатной температуре – через 3 часов (усиливает выработку энтеротоксина добавление в фарш белого хлеба).

Возможно продуцирование энтеротоксина и в продуктах растительного происхождения. Так, в картофельном пюре

62

энтеротоксин при комнатной температуре хранения накапливается через 5-8 часов.

Помимо энтеротоксинов стафилококки продуцируют и другие экзотоксины: гемолизины, лейкоцидин, эксфолиатины, а также токсин, вызывающий синдром токсического шока (TSST). Эти экзотоксины являются мембраноповрежда- ющимиииграютрольвпатологиигнойно-воспалительныхза- болеваний.

Необходимо отметить, что некоторые экзотоксины золотистого стафилококка, включая энтеротоксин, являются бактериальными суперантигенами в противоположность обычным антигенам. Суперантигены - это антигены, вызыва-

ющиенеспецифическуюполиклональнуюактивациюипро-

лиферациюТ-лимфоцитов. Если обычный антиген вызывает активацию и полиферацию лишь «своего» и близких к нему клоновТ-лимфоцитов(примерно0,01%общегопулаэтихкле- ток), то суперантигены активируют до 20% Т-лимфоцитов макроорганизма, причем – без процессинга в антигенпрезентирующих клетках. Таким, образом они обладают уникальной способностью обходить обычные механизмы иммунного распознавания. В результате активированные многочисленные клоны Т-лимфоцитов продуцируют огромное количество активационных цитокинов, что может привести к развитию синдрома общей интоксикации. С другой стороны, активи-

рованные Т-лимфоцитов имеют ограниченный срок жизни и быстро погибают, что может привести к развитию иммунодефицита вследствие физического недостатка этих клеток.

Также факторами патогенности стафилококков явля-

ются: микрокапсула, компоненты клеточной стенки, ферменты.

Клиническиепроявленияу людей обычно возникают сравнительно быстро после приема пищи (через 2-6 ч.) и сопровождаются следующими симптомами: головной болью,

63

головокружением, общей слабостью, тошнотой, рвотой с судорожными позывами, поносом, болями в подложечной области; в тяжелых случаях упадком сердечной деятельности, судорогами, ослаблением зрения и потерей сознания с падением кровяного давления, иногда повышением температуры до 38,5°С. Выздоровление обычно наступает через 1-3 суток. Смертельных случаев почти не наблюдают. Возможно и иное проявление болезни: внезапное начало, боли в животе, жидкийстулнесколькоразвсутки,нередкоскровью,иногдатошнота и рвота, головная боль, слабость.

Микробиологическая диагностика. Основной метод

– бактериологический. Исследуемый материал засевают на желточно-солевой, молочно-солевой или кровяной агар. Изучают морфологические, культуральные, ферментативные и биологические свойства выделенной чистой культуры.

Для эффективной оценки роли стафилококков в возникновении пищевых отравлений самого факта выделения культуры стафилококков, даже коагулозопозитивных, недостаточно, необходимо обнаружение энтеротоксина. Тем более, что живые микробные клетки в исследуемом материале могут отсутствовать при наличии значительных количеств энтеротоксина.

Чаще всего энтеротоксины стафилококков обнаруживают в продуктах питания с помощью иммуноферментного анализа.Этотметоддостаточночувствителенипозволяетвыявлять токсины в концентрации 0,2 мкг/кг. Помимо ИФА для обнаружения энтеротоксинов используют и радиоиммунные методы.

Органолептические изменения пищевых продук-

тов. Размножение стафилококков в пищевых продуктах и накопление в них энтеротоксина не вызывает заметного изменения органолептических свойств этих продуктов.

64

БОТУЛИЗМ

Общие сведения

Clostridium botulinum – возбудитель ботулизма относится к роду Clostridium, семейству Bacillaceae. Ботулизм – это тяжелое заболевание, нередко смертельное, возникает при употреблении в пищу продуктов, содержащих ботулинический токсин, продуцируемый Cl. botulinum. Поскольку основнаярольвпатогенезезаболеванияотводитсяэкзотоксину,ане самим бактериям, ботулизм принято считать пищевым ток-

сикозом.

Основным резервуаром и источником инфекции в природе теплокровные травоядные животные, в кишечнике которых клостридии размножаются и с фекалиями в большом количестве попадают в почву и воду.

Поскольку для Cl. botulinumхарактерна триадатаких

специфических свойств, как строго анаэробный тип дыхания, образованиетермоустойчивыхспоривыделениеботу-

лотоксина, то чаще всего причиной заболевания являются пищевые продукты, консервированные в домашних усло-

виях. В консервах прорастают оставшиеся после недостаточной термической обработки споры (попавшие с частичками почвы), бактерии размножаются, накапливается экзотоксин (ботулотоксин). Последний является чрезвычайно сильным биологическим ядом, вызывающим специфическое поражение ЦНС и приводящим к дыхательному и мышечному параличу. Летальные исходы достигают 60%. Помимо консервов, являющихся наиболее частой причиной отравлений, источником заболевания могут служить колбасы, ветчины, соленая и копченая рыба.

Морфология и культуральные свойства. Грамполо-

жительные палочки с закругленными концами, длиной 4-10

65

мкм, слабоподвижны (перитрихи), капсул не имеют. Возбудитель имеет очень характерный вид - палочки похожи на теннисные ракетки из-за субтерминально расположенной споры. По методу Ожешко споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы - в синий.

Строгие анаэробы. Оптимум pH – 7,2 – 7,4; темпера- туракультивирования25-40°C.Растутнаказеиновыхилимяс- ных питательных средах, сахарном и кровяном агаре. Жидкие среды мутнеют, наблюдается газообразование, иногда имеется запах прогорклого масла, но этот признак непостоянен. На кровяном агаре с глюкозой образуют крупные круглые колонии, окруженные зоной гемолиза. В столбике сахарного агара могут быть в виде либо пушинок, либо чечевичных зерен.

Ферментативные свойства. Все типы Cl. botulinum

образуют лецитиназу и Н2S, расщепляют пектиновые вещества, обладают сахаролитической и протеолитической активностью. Типы Cl. botulinum А и В разлагают глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, декстрин, крахмал, салицин с образованием кислоты и газа; тип С разлагает глюкозу, мальтозу, глицерин,инозит,левулезу,нонеферментируетсахарозу,лактозу, маннит и салицин.

Антигенная структура. Имеют О- и Н- антигены. Од-

нако, идентификация возбудителя проводится не по ним, а основывается на выявлении экзотоксина. В зависимости от антигенных свойств экзотоксина различают 8 сероваров: А, В, С1, С2, D, Е, F, G. Тип токсина определяется в реакции нейтрализации с соответствующими антитоксическими сыворотками.

Заболевания человека вызывают серотипы А, В, Е и F; Clostridium botulinum типов С и D вызывают заболевания животных и птиц (в редких случаях от больных животных выделяют бактерии типов А и В).

66

Устойчивость. Вегетативные формы Cl. botulinum малоустойчивы (погибают при 80 °C в течение 30 мин.), однако споры очень устойчивы и выдерживают кипячение в течение 1-6 часов, при 120 °C погибают через 10-20 мин. Встречаются штаммы, споры которых переносят температуру 120 °С в течение нескольких часов. Наименее устойчива к высоким температурам споровая форма Cl. botulinum типа Е.

Необходимо отметить, что устойчивость спор в продукте зависит также от количества жира, который повышает устойчивость спор к высокой температуре.

При использовании маринадов в консервировании пищевых продуктов за счет кислой среды рост Cl. botulinum прекращается. Однако данный процесс зависит и от состава пищи в консервах. Также на рост и токсинообразование у Cl. botulinumвлияетповареннаясоль,токсинообразованиеподавляется при содержании в продукте 6% соли. Однако важно помнить, что именно рост и токсинообразование бактерий Cl. botulinumподавляются в кислой среде и приотносительно высокой концентрации соли, выделяемый же ими ботулоток-

син очень устойчив и к высоким концентрациям поваренной соли и к кислой среде (рН 3,5-6). Также ботулотоксин устойчив к действию протеолитических ферментов ЖКТ, относительно термоустойчив – при кипячении разрушается в течение 15 мин. Как и в случае со спорами Cl. botulinum, устойчивость токсинов к высокой температуре зависит от видапро-

дукта, его рН и ряда других условий. Так, при высокой жир-

ности продукта, высокойконцентрации сахараустойчивость токсинов к высокой температуре возрастает.

Факторы патогенности. Основной фактор патогенности Cl. botulinum – ботулотоксин (экзотоксин). Это один из самых сильных ядов в мире, является нейротоксином. Как и многие другие экзотоксины состоит из двух субъединиц, одна изкоторыхотвечаетзаадсорбциюнарецепторахчувствительных клеток - нейронов, другая - за проникновение в них путем

67

эндоцитоза и собственно токсический эффект. Последний заключается в ингибиции Са2+-зависимого освобождения ацетилхолина, вследствие чего блокируется передача нервного импульса через синапсы. Необходимо отметить, что ботулотоксин продуцируется бактерией в виде протоксина и нуждается в дальнейшей активации, чтобы стать полноценным ток-

сином. Те штаммы Cl. botulinum, которые способны продуцировать протеолитические ферменты, обеспечивают ак-

тивацию прототоксинов своими эндогенными протеазами (активация происходит в бактериальной клетке). Если же нейротоксины продуцируются непротеолитическими вариантами Cl. botulinum, то активация осуществляется экзоген-

ным путем, т. е. с помощью протеаз желудочно-кишечного тракта человека или животных.

Помимо нейротоксической активности, различные типы Cl. botulinum обладают лейкотоксической, гемолитической и лецитиназной активностью. Особенность лейкотоксина заключается в том, что он подавляет фагоцитоз без разрушения лейкоцитов.

Клинические проявления. Люди чрезвычайно чув-

ствительны к ботулиническим токсинам типов А, В, С, Е и F. Смертельная доза токсина для человека составляет 1 нг/кг массы тела. Ботулинический токсин быстро всасывается в желудке и кишечнике, проникает в кровь и, воздействуя на нервную систему, вызывает нарушения в работе черепных нервов, скелетной мускулатуры, нервных центров сердца. Это приводит к нарушению походки, зрения, речи, глотания и другим явлениям. Смерть наступает от паралича дыхательной мускулатуры и сердечной мышцы. Инкубационный период у людей составляет от нескольких часов до 10 дней (чаще всего 18-24 часа). Чем больше инфицирующая доза, тем короче инкубационный период и тем тяжелее протекает заболевание.

Микробиологическая диагностика. Целью лабора-

торной диагностики является выявление ботулинического

68

токсина или самого возбудителя. Исследуют материал, взятый у больного (рвотные массы, промывные воды желудка, кровь, испражнения) и пищевые продукты.

Исследуемый материал засевают в среду Китта-Та- роцци. При наличии в ней роста производят микроскопию культуры с окраской по Граму. Бактерии Cl. botulinum выглядят как грамположительные палочки в виде теннисных ракеток. Выросшую культуру сеют на кровяной агар или в пробирки с сахарным агаром (трубки Вейона). Среды выдерживают в термостате 3-4 дня. Выросшие колонии высевают на среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры. У полученной культуры определяют ферментативные (редко), серо-

логическиеитоксигенныесвойства.

С полученными чистыми культурами ставят реакцию агглютинации. В маленьких пробирках делают разведения сыворотки до 1:6400, в них добавляют по 4-6 капель однодвухдневной бульонной культуры Cl. botulinum. Положительной реакцией считается образование в пробирках хлопьев или осадка; при отрицательном результате жидкость в пробирках сохраняет равномерное помутнение.

Присутствие токсина в исследуемом материале определяют в биологической пробе (реакция нейтрализации). Для этогоиспользуюттригруппылабораторныхживотных(мыши или морские свинки). Вначале материал растирают с двойным объемом физиологического раствора, оставляют на 2 ч при комнатной температуре, затем центрифугируют и надосадочную жидкость вводят внутрибрюшинно первой группе животных. Второй группе вводят фильтрат, предварительно гретый до 100 0С в течение 30 мин (если есть ботулотоксин, он должен инактивироваться). Третьей группе животных вводят смесь, состоящую из фильтрата и диагностических антитоксических сывороток типов А, В, С, Е, которую предварительно выдерживают при комнатной температуре в течение 30мин.Есливматериалесодержитсяботулиническийтоксин,

69

то погибнут животные, не получившие антитоксическую сыворотку (т.е. животные первой группы). Гибель живот-

ных происходит вследствие паралича. Далее для установления типа токсина ставят аналогичную реакцию нейтрализации токсина уже с моновалентными сыворотками.

Кроме того, при диагностике ботулизма используются

иммуноферментный анализ и метод дот-иммуноанализа.

В первом случае метод основывается на обнаружении в крови больных ботулотоксина с помощью меченных ферментами антител. Во втором случае анализ на наличие ботулотоксина проводится путем нанесения исследуемого материала на нитроцеллюлозный мембранный фильтр, содержащий меченные противоботулинические антитела. Затем фильтр обрабатывают проявителем. Если в биологических жидкостях больного находился токсин, то участки, на которые наносили пробу, потемнеют. Уровень интоксикации определяют, сравнивая результат с контрольной шкалой.

Органолептическиеизмененияпродуктов. Внешний вид продуктов, в которых накопился ботулотоксин, может оставаться неизмененным, но может и меняться. Пищевой продукт размягчается, появляется неприятный запах, напоминающий запах прогорклого масла. Консервные банки могут быть как бомбажными, так и неизмененными.

70