2 Общая характеристика методов этапы проведения
Современные определения чувствительности АБП подразделяют на разведений и . серийных разведений основаны определении основного , характеризующего микробиологическую активность величины его концентрации (МПК – минимальная , видимый рост исследуемого бульонной культуре плотной питательной среде определения МПК АБП вносят в , которую затем исследуемого микроорганизма, инкубации оценивают отсутствие видимого роста
В характера используемой питательной методы серийных агаре или в . зависимости от жидкой питательной среды серийных макро микроразведений.
серийных разведений метод, основанный только двух , соответствующих пограничным значениям см. ). принцип исследования широко автоматизированных системах чувствительности микроорганизмов.
Диффузионные чувствительности основаны на из носителя питательную среду и исследуемой культуры зоне, где превосходит МПК
В настоящее две основные метода: диско и Е.
В диско методе в АБП используют бумажный . зоны подавления в результате диффузии носителя в . В определенных пределах зоны подавления пропорциональна МПК. -диффузионный метод косвенно судить о , а результатом отнесение микроорганизма к категорий чувствительности , промежуточный или резистентный 7, ].
Е- собой узкую (0, 6, ), на которую нанесен АБП ( до максимальных). микроорганизма вокруг -теста происходит только зоне, АБП, диффундирующего , выше МПК этом образуется каплевидная . Значения концентрации каждом участке носителя нанесены на обращенной к исследователю Е-. МПК учитывают в , где граница роста вплотную подходит . Детальные инструкции чувствительности с использованием - прилагаются изготовителем реактивов.
, независимо от , предполагает последовательное выполнение :
- сред;
суспензии исследуемых инокулюма);
;
- ;
- учет результатов, по лечению.
Диффузионные также этап наложения полосок Е на плотную питательную .
Для используют специально предназначенные цели среды к применению в в установленном по своим характеристикам , приведенные в дипломной работы. качества среды использовании всех сред к применению Федерации в установленном .
Вид для оценки чувствительности методом проведения агар или бульон также видом [5, ].
Выбранную для определения чувствительности сухой среды в соответствии с . После автоклавирования сразу же разливают пробирки или Петри или ( ) колбы со на водяную баню -50 град , где выдерживают до температуры, в них асептически питательные добавки / рабочие растворы антибиотиков затем разливают или в чашки .
Агар чашкам слоем толщиной (на 100 мм требуется агара, диаметром 90 мм мл). при комнатной температуре . Приготовленные указанным Петри предпочтительнее использовать . хранение в пакетах в холодильнике -8 град в течение 5 .
Общим важным для всех является стандартизация микроорганизма, ее составлять 1 x 108 КОЕ. Практически наиболее оценки концентрации бактериальной измерение ее . Оптическая плотность бактериальной концентрацией 1 x 108 КОЕ при визуальном стандарту мутности 0 по Мак. Контроль оптической плотности также осуществлять денситометрически). Существуют стандарты мутности .
Бактериальную суспензию либо из , из агаровой культуры
Для используют чистую суточную , выросших на средах. Отбирают , четко изолированных , на неселективных плотных . Петлей переносят материала с верхушек пробирку со раствором или питательным , плотность инокулюма 0,5 Мак-. следует использовать в мин. [9, ].
При быстро растущих бактерий питательными потребностями инокулюма также можно -6- культуру микроорганизма. отбирают несколько колоний, петлей количество материала с 4,-,0 мл питательной средин, 35 град . Через 5- инкубации плотность приблизительно соответствует необходимой ее точно 0,5 -Фарланду путем бульона или физиологического .
Стандарт - может быть либо , приготовлен в .
Приготовление стандарта , по Мак
К 0 мл раствора концентрации 0, /л (,% раствор ВаСl2 x ) медленно при добавить 99, раствора H2SO4 0,18 / (1 получения гомогенной суспензии
Правильность необходимо проверить на . при использовании см должно составить ,-0, длине волны 625 .
Полученную разлить по 4 мл в герметично закрывающимися крышками должны быть диаметра, как для приготовления .
Хранить пробирки необходимо в комнатной температуре.
Перед необходимо тщательно встряхивать однородность суспензии появлении видимых частиц из употребления
Стандарт мутности или проверять плотность ежемесячно.
. Анализ методов определения к АБП
..1 Методы серийных
) растворов АБП для разведений
крайне важным этапом методов серийных приготовление растворов АБП "основные АБП (пригодные ) и "" те, которые "ex " приготовления питательных сред , 29].
основных растворов АБП субстанции АБП активностью, лекарственные пригодны. субстанций необходимо использовать весы с 4 знака, объемов - и пипетки.
Основные готовят в концентрации , мкг/ выше. Навески приготовления базовых с учетом их . навески АБП базового раствора проводят [4 ]:
С /мл) . (мл)
. (мг) (1
А АБП в /)
где
m . расчетная (теоретическая АБП;
необходимая концентрация АБП
Vтеор объем растворителя для навески;
активность АБП ( вещества, субстанции).
расчетное количество невозможно. Поэтому к расчетной , затем пересчитывают количество [4 ]:
m . мг) . (мл)
. мл) = 2)
. (мг)
:
Vпракт. растворителя для навески;
. - полученная ;
m АБтеор расчетная () АБП;
. объем растворителя теоретической навески.
В тем, что различаются по , ряде случаев возникает различные вещества растворения (солюбилизации (растворители для доведения их концентрации (). тех случаях когда разбавители являются , для растворения АБП минимально возможное .
Отличные от и разбавители АБП приведены в . . Основные растворы при температуре не 20 град (сроки хранения при этой различаются). Оптимальными хранения основных является температура - . C и , не более 6 . этом необходимо виду, что бета- могут терять активность более ранние .
После извлечения перед открыванием основными растворами их до комнатной предотвращения конденсации влаги основные растворы использованы для приготовления , повторное замораживание . Для приготовления рабочих дистиллированная вода
Из рабочих двукратные разведения . расчетах за основу концентрация АБП среде, равная , мкг/ более высокие - , , 8 и ..; более низкие - ,; 0,; ,125 и т.). При этом растворов должны учитывать раствора АБП чашек с плотной или при . двукратных серийных разведений от вида , предполагаемой активности АБП исследования.
основных варианта метода в бульоне (пробирочный) (при объема 0, и меньше применения макрометода из низкой производительности необходимости оценки чувствительности .
Макрометод
Процедура:
Тестирование объеме 1 мл АБП с исследуемого микроорганизма примерно 10 КОЕ.
Питательная среда
Питательный определения чувствительности разливают ,5 мл пробирку. Количество необходимым диапазоном и увеличивают на постановки "" .
Приготовление серийных (рис ) [16, ].
. . Алгоритм определения чувствительности культуры к методом разведений в среде
АБП готовят из с использованием среды. Концентрацию рассчитывают исходя максимальной концентрации в разведений, разбавления препарата при . Затем рабочий количестве 0, при помощи стерильным наконечником вносят пробирку, ,5 мл бульона перемешивают и наконечником переносят 0 мл раствора бульоне во вторую , первоначально 0 мл бульона. повторяют, будет приготовлен весь разведений. пробирки 0, бульона удаляют
Таким образом ряд пробирок АБП, концентрации в соседних 2 раза. дополнительные ряды АБП для тестирования . Серия разведений включать в себя и допустимые для контрольных штаммов
Приготовление инокуляция
Для стандартную микробную , 0,5 Мак-, в 100 раз бульоне, концентрация микроорганизма в примерно 10 /.
По 0 мл инокулюма каждую пробирку, 0, соответствующего разведения АБП в одну 0,5 бульона без отрицательный" контроль
Конечная в каждой пробирке - примерно 10 КОЕ/. должен быть пробирки с разведениями позднее 15 мин. с .
Инкубация
стерильными ватно- или металлическим все пробирки с , кроме пробирки " контроль, инкубируют атмосфере при град. C 16- 20-24 в зависимости тестируемого микроорганизма). отрицательный" в холодильник при . C, до учета результатов
Учет
Для определения микроорганизма пробирки просматривают в проходящем . культуры в сравнивают с референтной отрицательный" ), исходный инокулюм и холодильнике. по наименьшей концентрации , подавляет видимый .
Микрометод
является высокая возможность длительного хранения планшет. при величине конечного ,2 мл , что позволяет значительно расходных материалов не имеет отличий , за исключением питательного бульона с и инокулюма требует дополнительного оснащения пипетками, - планшетами для иммунологических с плоским ) стерильными крышками.
Первым изготовление планшет, хранения. рабочих растворов антибиотиков , запаянные в могут храниться при -60 . до момента использования замораживание- допускается.
исследования планшеты из холодильника выдерживают ими комнатной , чего проводят инокуляцию исследуемого микроорганизма проведении инкубации планшет быть закрыт предотвращения высыхания содержимого .
Учет визуально или спектрофотометрически рост микроорганизма АБП с ростом ячейке без . МПК принимают минимальную , полное подавление исследуемого штамма.
Метод в бульоне легко для разработки -. При использовании тест, разрешенных к Российской Федерации в , следует пользоваться .
Контроль качества
При серийных разведений в проводить контроль в среде без . также контролировать микроорганизма, использованной , путем высева среды. Каждая штаммов сопровождается качества исследования с контрольных () [17, ].
) серийных разведений в
Метод в агаре позволяет МПК партии от 15 до штаммов + , в зависимости от инокулятора).
Принцип метода посеве тестируемых чашки Петри с , последовательные двойные . Одновременно проводят тестирование штаммов и штаммов, а роста микроорганизмов без АБП и культуры путем инокулюма на неселективные .
Приготовление АБП
Из исследуемого АБП раствор в концентрации 10 раз из используемых в . Затем готовят разведений рабочего раствора образом, в каждом последующем быть в меньшей, чем . Для приготовления используют любые стерильные лабораторные емкости крышками объемом не мл ( размешивания).
Сухую среду растворяют и соответствии с . После автоклавирования колбы средой помещают баню при 48 град. , выдерживают до достижения , после чего асептически вносят рабочие (1 раствора АБП на расплавленного агара , при необходимости, добавки. тщательно перемешивают и чашкам Петри слоя питательной среды 3- .
Вторым способом Петри с , разведения АБП, питательной среды АБП непосредственно в . Для приготовления чашек диаметром 90 к 2 АБП добавить 18 до 50 . жидкого агара. маркируют с и его концентрации важно тщательно до того, начнет застывать распределения АБП по питательной среды производят на горизонтальной плавными разнонаправленными чашки. После агар должен горизонтальном положении. передвигать, до полного застывания .
Параллельно Петри, содержащими , для контроля чашки Петри без . оставляют при для застывания и 10- .
Приготовленные указанным Петри предпочтительнее , однако допускается хранение полиэтиленовых пакетах -8 град. течение 5 . этом необходимо иметь , что некоторые - антибиотики (прежде , , цефаклор, ), при низких концентрациях выдерживают даже хранения. В стабильность антибиотиков в лаборатории чашках устанавливать экспериментально референтных штаммов.
Приготовление инокуляция
Конечная исследуемого микроорганизма питательной среды должна КОЕ. инокуляторы или стандартная диаметром 3 мм переносят 1 мкл жидкости микроорганизмов в исходной быть 10 /. Такую концентрацию можно разведении стандартной , соответствующей стандарту 0 по Мак, в 10 раз суспензию необходимо поверхность агара в мин. , при этом образуется 5- .
Для контроля суспензий периодически подсчет реальных колониеобразующих высева образца на неселективные питательные .
Инкубация
После инокуляции при комнатной подсыхания, далее инкубируют при град. C 18- (в зависимости тестируемого микроорганизма
Учет результатов
Учет , поместив чашку на отражающую свет . МПК принимают концентрацию полную ингибицию . Для дифференцирования нежного налета, инокулята, в целесообразно использовать . единственной колонии на концентрацией на выше, чем , можно не . оценки антибиотикочувствительности имеет только при культуры.
.
При серийных разведений в проводить контроль на чашке Петри средой, АБП. Важнейшим качества является для инокуляции суспензии неселективную среду чистоты культуры! тестируемых штаммов контролем качества исследования соответствующих контрольных ) штаммов [4 ].
Таким . на то что разведений являются и информативными, в практических со значительными методическим . всего, о необходимости использования с известным , строгого соблюдения режимов , выполнения контроля сред, трудоемкости растворов антибиотиков
Использование тест на основе позволяет избегать трудоемких стандартизации подготовительных , при этом обеспечивает количественных результатов антибиотико-резистентности
Весьма простым в исполнении вариант метода , основанный на использовании концентраций, качественные результаты (.. распределить штаммы на три категории
..2 Диско- (ДДМ
ДДМ основан на диффундировать из пропитанных дисков в , угнетая рост микроорганизмов на поверхности .
Питательная среда
Для ДДМ используют такую , и для в агаре, . К качеству для постановки диско метода выдвигают требования, что плотным питательным постановки метода серийных агаре, и те же качества.
Петри с плотной связано с . Плотную питательную среду соответствии с . Важным моментом при ДДМ является агара в чашке должна составлять ,0 +/- 0) мм, при внесении в диаметром 90 20 мл агара 100 мм мл агара, 150 мм мл агара. расплавленной средой устанавливают на строго (выверенную , без впадин и ). указанных предосторожностей связи с тем размер и ингибиции роста зависят и равномерности .
После заполнения при комнатной застывания. Хранить запаянными в при 4- . C в -10 сут. свежеприготовленных чашек после хранения в необходимо подсушить , что достигается инкубацией град. приоткрытой крышкой в -20 мин инокуляцией необходимо проконтролировать жидкости на крышек [19 ].
Диски
Для определения следует использовать качественные диски. с АБП для определения чувствительности - методом, условиях нецелесообразно. с жесткими исходным материалам ( , картону) значительной трудоемкостью методов дисков.
правильных результатов определения необходимо строго хранения и использования , в противном в них антибиотиков ниже допустимого прежде всего в ) еще до годности.
дисков с в герметичной упаковке камере при 18 град. ниже. дисков, используемые работе, в холодильнике при -8 град , плотно укупоренными так гарантировать невозможность флакон влаги, для дополнительной влаги во флаконах ) с дисками влагопоглотитель (силикагель
Флаконы ) с дисками следует холодильника за до начала работы герметично закрытыми ими комнатной температуры предотвращает образование дисках после открывания .
Приготовление и инокуляция.
При ДДМ используют стандартный , по плотности , по стандарту Мак и содержащий ,5 x 10 /. Инокулюм следует течение 15 мин приготовления. приготовленных чашек с использовать два .
1. способом инокуляции стерильных ватных тампонов необходимо погрузить суспензию микроорганизма, инокулюма удалить тампон о стенки . проводят штриховыми трех направлениях, Петри на .
2. второго способа наносят пипеткой на Петри с в объеме 1 мл, по поверхности покачиванием чего удаляют пипеткой. Приоткрытые при комнатной течение 10- .
Аппликация инкубация
Не через 15 . инокуляции на поверхность наносят диски . Аппликацию дисков проводят стерильного пинцета диспенсера. Расстояние до края между дисками должно -20 мм образом, на диаметром 100 помещать не более с АБП должны равномерно контактировать агара, их следует аккуратно .
Непосредственно дисков чашки Петри термостат кверху инкубируют при температуре . C в -24 ч ( от вида ). Увеличение интервала времени дисков на и началом инкубации соответственно - исследуемой культуры микроорганизма к "" в агар и диаметра зоны .
Учет результатов
После чашки помещают кверху темную матовую , чтобы свет падал под углом град. ( отраженном свете зон задержки роста точностью до , предпочтительнее пользоваться штангенциркулем .
При задержки роста следует зону полного роста. Не внимания на колонии, выявляемые зоны задержки при особых условиях увеличении, заметный налет у . Исключение составляют результатов определения чувствительности оксациллину, учитывать и самые , выявляемые в зоны подавления роста
Крупные , в пределах четкой роста, наличии посторонней микрофлоры гетерорезистентности популяции , этом случае необходимо микроорганизма, колонию, и этого штамма , 24].
чувствительности ДДМ протея зона подавления быть затянута пленкой, которая установлению границы не учитывается при .
При к сульфаниламидам и с триметопримом подавления роста следует уровне ингибиции 80%. Это тем, действием этих препаратов подавлением роста 1-2 микроорганизма.
..3 Методы оценки , циркулирующих в - учреждениях, к
микроорганизма.
выращивание выделенного микроорганизма на соответствующей
Тест культивируют на следующих :
- на казеиновом бульоне -пептонном бульоне Эндо, казеиновом , -пептонном агаре . питательных средах при 370С в -24 ч;
M (особенно штаммы ), нетуберкулезные микобактерии от больных непосредственно учреждении- «Новая, - при температуре в течение 10 суток;
рода Candida - Сабуро, при температуре плюс течение 2 суток.
микробной взвеси с агара стерильной . Полученную взвесь - фильтруют через ватно фильтр и питьевой водой до ·109 клеток мл, соответствующей № 20 мутности (ФГУН научно- стандартизации и контроля препаратов им .А. Тарасевича »).
Приготовление дезинфицирующих средств.
Рабочий с соблюдением мер соответствии с , в Инструкции по средства.
ДС готовят непосредственно исследований на воде комнатной температуры 20 +) при необходимости - температуры ( -50 0С). или отмеренное концентрата вносят в , добавляют воду и закрывают крышкой с раствором полного растворения средства растворы из форме таблеток готовят в отмеренный определенного числа таблеток
Если опасность при ингаляционном , готовят в или в отдельном , приточно- в респираторе РУ РПГ-, рук защищают резиновыми , - защитными .
Приготовление нейтрализатора
Для вещества (ДВ может быть материалом тест- его посеве среду, используют вещество, (нейтрализует) агента на , но не убивает задерживает рост -. В качестве нейтрализаторов различных химических для:
(хлор - и йодактивные) (перекись , комплексы с солями кислота, ) 0,1,0% натрия;
аммониевых солей хлорид, дидецилдиметиламмоний др.), , гуанидина (полигексаметиленгуанидин , биглюконат и .) универсальный нейтрализатор, 80 (%), (0,-%), гистидин (,%), цистеин (0%);
- глутаровый альдегид, , , ортофталевый альдегид 1,0 пиросульфита () или универсальный нейтрализатор . ниже);
– щелочи в ;
- кислоты в эквивалентном ;
- вода;
средств – , содержащий Твин 80 %), сапонин (,-3%), гистидин ,1%), 0,1 в состав окислители, в вводят тиосульфат .
Выбор тест, используемого для выделенного штамма микроорганизма
Выбор - зависит от назначения .
При выделенного штамма микроорганизма , предназначенному для в помещениях, тест- тест-поверхности материалов ( 3-х ), , линолеум, , пластик.
чувствительности выделенного к ДС, обеззараживания изделий (ИМН), -изделия из – металла, , .
При выделенного штамма микроорганизма , предназначенному для , в качестве тест используют столовую тарелки).
чувствительности выделенного к ДС универсального выбирать режимы разными способами: (например ) и погружения (, ) [3 ].
Оценка чувствительности микроорганизма к , предназначенным для обеззараживания .
При в качестве тест используют поверхности см из различных поверхности из , пластика, облицовочной кафельной и , и др.), менее 3 видов поверхностей. -поверхностей для назначением средства.
В -микроорганизма используют штамм , с объекта . Непосредственно перед проведением убедиться в , тест-микроорганизм посторонней микрофлорой чего осуществляют микроскопию культуры.
тест-микроорганизмом механической очистке водой с мылом . Поверхности располагают на них пипеткой взвесь из ,5 мл 2 миллиардной микробной площадь в 100см2 распределяют ее стерильным шпателем. (до ) при температуре плюс -, затем обрабатывают .
Обработку поверхностей протирания или в зависимости от , в инструкции средства).
способом протирания наносят на контаминированные помощью пипетки их стерильной марлевой 5х5см. способом орошения дезинфицирующий с помощью . наносимого дезинфицирующего раствора рекомендуемой нормы , в инструкции по : например, расхода составляет 100мл, то на 10х10см наносят 1 .
После выдержки стерильной марлевой размер 5х5см в растворе нейтрализатора данному ДС протирают контаминированную поверхность салфетку в же нейтрализатора, пробирках с . отмыва марлевой салфетки мин при . Отмывную жидкость сеют -3 чашки ,1-0 мл в соответствующие твердые питательные .
Посевы термостат и культивируют температуре, роста данного микроорганизма течение 2 суток в зависимости микроорганизма (, ).
Контрольные поверхности как и , вместо ДС стерильную .
Учет путем оценки остаточной после обработки в выбранном режиме подсчета количества чашках Петри колоний контаминации 100см2 % обеззараживания, колоний, контрольных поверхностей, %.
Пример обеззараживания:
см2 контрольной 148000 микробных клеток с аналогичного поверхности – 20 . % обеззараживания следующей формуле []:
·
100 - 99,986
где х обеззараживания.
микроорганизма на поверхностях ,99% , выделенный госпитальный штамм к действию , менее 99,% считают устойчивым ДС в исследуемом .
Исходя результатов выдают рекомендации использованию ДС в ЛПУ:
- чувствительности госпитального штамма действию ДС -либо из рекомендованных по применению , средство в данном режимах) для обеззараживания поверхностей
- случае, когда госпитального штамма действию ДС во в Инструкции средства режимах, следует заменить .
Оценка чувствительности микроорганизма к , предназначенным для обеззараживания назначения ( )
В качестве - используют стерильные различных материалов (, , пластмасс). , взятых в эксперимент инструменты, например, корнцанг не имеющие (например, , ), а также резин, стекла .
В -микроорганизма используют выделенный внутрибольничной среды .
На поверхность - (у – в область , при наличии полостей – также изделия) пипетки наносят по , мл 1 . того или иного -микроорганизмов, % инактивированной лошадиной сыворотки -изделия подсушивают высыхания. Мелкие - погружают в тест-микроорганизмов мин, извлекают и подсушивают полного высыхания испытании ДС, свойствами, сыворотки уменьшают до %.
Дезинфицирующие на питьевой воде подсушивания контаминированные погружают в раствор , заполняя им и полости изделий образования воздушных . , имеющие замковые части раскрытыми, ими в растворе рабочих движений проникновения раствора в изделий в . Толщина слоя раствора изделиями должна менее 1 см для контроля в воду.
После выдержки изделия извлекают раствора и размером 5х5 см2 нейтрализатором, изделия делают смывы салфетку помещают с 10 мл нейтрализатора и бусами в течение - мин. промывают раствором нейтрализатора изделия погружают нейтрализатора на 5 , затем переносят с жидкой питательной . контроля эффективности жидкость с поверхности из канала соответствующие питательные среды выдерживают в температуре и времени для роста -микроорганизма, после учет результатов
Учет результатов инкубации посевов отмечая наличие или микроорганизма на .
Если гибель тест- 100% ( во всех ), госпитальный штамм микроорганизма к действию , менее 100% роста в более пробах) устойчивым к в исследуемом режиме .
Исходя результатов выдают рекомендации использованию ДС в ЛПУ:
- чувствительности госпитального штамма действию ДС -либо из рекомендованных по применению , средство в данном режимах) для обеззараживания ИМН
- случае, когда госпитального штамма действию исследованного ДС рекомендованных в применению режимах для , средство следует другое.
выделенного щтамма дезинфицирующим средствам, обеззараживания посуды
В качестве - используют посуду ). В качестве тест используют выделенный внутрибольничной среды штамм .
Перед посуду подвергают механической моют водой и щеткой, (до ) при комнатной температуре -200С. горизонтально и на наносят взвесь - из расчета 0 мл 2 . на площадь в и равномерно по поверхности посуды .
Обработку способом погружения в в соответствии , изложенными в инструкции средства.
аналогично контаминированная посуда погружают в объем стерильной питьевой .
После выдержки посуду извлекают раствора и салфеткой (размер ), смоченной в , соответствующего данному ДС протирают контаминированную , погружают салфетку в этого же , в пробирках с . отмыва марлевой мин при постоянном . отмыва марлевую в соответствующую жидкую . Отмывную жидкость 2-3 0,-,2 мл в твердые питательные 10, 23
Посевы термостате при температуре , оптимальных для тест-микроорганизма чего проводят .
Учет результатов инкубации посевов отмечая наличие или микроорганизма на .
Если гибель посуде составляет % отсутствие роста во ), выделенный госпитальный считают чувствительным к , если менее % наличие роста в более проб считают устойчивым к в исследуемом .
Исходя из выдают рекомендации использованию ДС для ЛПУ:
установлении чувствительности госпитального к действию каком-либо в Инструкции средства режимов, данном режиме ) можно применять для .
том случае, устойчивость госпитального к действию ДС рекомендованных в применению режимах, заменить на .
Результаты оценки штамма микроорганизма ДС оформляют в (Приложение