19
Липопротеиды
Липопротеиды в качестве простетической группы содержат различные липиды (триацилглицерины, фосфолипиды, холестерин и др.). Между белком и липидом формируются гидрофобные и ионные связи. Липопротеиды принято делить на структурные, входящие в состав клеточных мембран, и транспортные, осуществляющие перенос липидов кровью. Транспортные липопротеиды представляют собой сферические частицы, внутри которых находятся гидрофобные жиры, а на поверхности – фосфолипиды и гидрофильные белки. Примером липопротеида может служить фактор свёртывания крови
– тромбопластин.
Фосфопротеиды
Фосфопротеиды содержат остатки фосфорной кислоты, соединённые с радикалами остатков серина, реже треонина белковой части сложноэфирными связями. Присоединение фосфорной кислоты к белку может носить обратимый характер и сопровождаться формированием или разрывом ионных связей фосфорной кислоты и заряженных групп белка, что меняет структуру и биологическую активность фосфопротеида. К фосфопротеидам относятся структурные белки костной ткани, казеиноген молока, ововителлин белка куриного яйца, некоторые ферменты (фосфорилаза, гликогенсинтетаза, ТАГ-липаза).
Гликопротеиды
Гликопротеиды содержат, как правило, прочно присоединенные гликозидными связями остатки углеводов (моносахаридов, олигосахаридов). Гликопротеиды обычно имеют мозаичную структуру, в которой чередуются углеводные и белковые фрагменты.
Углеводная часть придаёт специфичность гликопротеидам и определяет их устойчивость к тканевым ферментам. Гликопротеиды широко представлены в организме человека. Они содержатся как в тканях, так и в биологических жидкостях. Муцин слюны содержит в своём составе до 15% маннозы и галактозы. Гликопротеидами являются некоторые гормоны, например, гонадотропины гипофиза. Некоторые транспортные белки крови относятся к гликопротеидам (трансферрин). Гликопротеидом является фактор свёртывания крови фибриноген, Все виды иммуноглобулинов содержат углеводные фрагменты. Углеводы придают специфичность тканевым рецепторам. Адгезивные белки (фибронектин, ламинин), будучи гликопротеидами, обеспечивают взаимодействие клеток, волокон, гликозаминогликанов соединительной ткани.
Металлопротеиды
Металлопротеиды – сложные белки, в состав которых входят металлы. Например, гемосидерин и ферритин содержат железо, фермент алкогольдегидрогеназа содержит цинк.
В последнее время предложена классификация белков на семейства - группы близких по структуре и функциям белков, имеющие гомологичные последовательности аминокислот. Например, выделяют семейство сериновых протеаз, содержащих в активном центре аминокислоту серин и участвующих в расщеплении различных белков. В это семейство входят трипсин, химотрипсин, эластаза, многие ферменты свёртывания крови (тромбин), антисвёртывающей системы (фибринолизин). Семейство иммуноглобулинов включает все виды основных и минорных иммуноглобулинов. Иммуноглобулины имеют вилкообразную структуру, состоящую из двух тяжелых (Н) цепей и двух лёгких цепей (L). Иммуноглобулины, в свою очередь, входят в состав суперсемейства, включающего иммуноглобулины, рецепторы к Т-антигенам, белки гистиосовместимости.
2. СТРУКТУРА, СВОЙСТВА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ
2.1. Краткая история ферментологии
Экспериментальное изучение ферментов в 19 веке совпало по времени с изучением процессов дрожжевого брожения, что нашло отражение в терминах «ферменты» и «энзимы». Название ферменты возникло от латинского слова fermentatio – брожение.
20
Термин энзимы произошёл от понятия en zyme - из дрожжей. Вначале этим названиям придавали разный смысл, но в настоящее время они являются синонимами.
Первая ферментативная реакция осахаривания крахмала солодом была исследована отечественным учёным К.С. Кирхгоффом в 1814 году. Впоследствии были предприняты попытки выделения ферментов из дрожжевых клеток (Э. Бюхнер, 1897 год). В начале ХХ века Л. Михаэлис и М. Ментен разработали теорию ферментативного катализа. В 1926 году Д. Самнер впервые выделил очищенный препарат фермента уреазы в кристаллическом состоянии. В 1966 году Б. Меррифилду удалось осуществить искусственный синтез фермента РНК-азы.
2.2. Структура ферментов
Ферменты – это высокоспециализированные белки, способные повышать скорость реакции в живых организмах. Ферменты - биологические катализаторы.
Все ферменты являются белками, как правило, глобулярными. Они могут относиться как к простым, так и к сложным белкам. Белковая часть фермента может состоять из одной полипептидной цепи и относиться к мономерным белкам (например, пепсин). Ряд ферментов являются олигомерными белками, включают в свой состав несколько протомеров или субъединиц. Протомеры, объединяясь в олигомерную структуру, соединяются самопроизвольно непрочными нековалентными связями. В процессе объединения (кооперации) происходят структурные изменения отдельных протомеров, в результате чего активность фермента заметно возрастает. Отделение (диссоциация) протомеров и их объединение в олигомерный белок является механизмом регуляции активности ферментов.
Субъединицы (протомеры) в олигомерах могут быть или одинаковыми, или отличающимися по первичной - третичной структуре (конформации). В случае соединения различных протомеров в олигомерную структуру фермента возникают множественные формы одного и того же фермента – изоферменты.
Изоферменты катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по набору субъединиц, физико-химическим свойствам, электрофоретической подвижности, по сродству к субстратам, активаторам, ингибиторам. Например, лактатдегидрогеназа (ЛДГ)
– фермент, окисляющий молочную кислоту в пировиноградную кислоту, является тетрамером. Он состоит из четырёх протомеров двух типов. Один вид протомеров обозначается Н (выделен из сердечной мышцы), второй протомер обозначается М (выделен из скелетной мускулатуры). Возможно 5 сочетаний этих протомеров в составе ЛДГ: Н4, Н3М, Н2М2, Н1М3, М4 соответственно ЛДГ1, ЛДГ2,ЛДГ3,ЛДГ4, ЛДГ5.
Биологическая роль изоферментов.
•Изоферменты обеспечивают протекание химических реакций в соответствии с условиями в разных органах. Так, изофермент ЛДГ1 – обладает высоким сродством к кислороду, поэтому он активен в тканях с высокой скоростью окислительных реакций (эритроциты, миокард). Изофермент ЛДГ5 активен в присутствии высокой концентрации лактата, наиболее характерен для ткани печени.
•Выраженная органоспецифичность изоферментов используется для диагностики заболеваний различных органов.
•Изоферменты изменяют свою активность с возрастом. Так, у плода при недостатке кислорода преобладает ЛДГ3, а с увеличением возраста и увеличением поступления кислорода возрастает доля ЛДГ2.
Если фермент является сложным белком, то он состоит из белковой и небелковой части. Белковая часть является высокомолекулярной, термолябильной частью фермента и называется апоферментом. Он имеет своеобразную структуру и определяет специфичность ферментов.
Небелковая часть фермента называется кофактором (коферментом). Кофактором чаще всего являются ионы металлов, которые могут прочно связываться с апоферментом
21
(например, Zn в ферменте карбоангидразе, Сu в ферменте цитохромоксидазе). Коферменты обычно являются органическими веществами, менее прочно связанными с апоферментом. Коферментами являются, в частности, нуклеотиды НАД, ФАД. Кофермент – низкомолекулярная, термостабильная часть фермента. Его роль заключается в том, что он определяет пространственную укладку (конформацию) апофермента, и определяет его активность. Некоторые кофакторы могут переносить электроны, функциональные группы, участвовать в образовании дополнительных связей между ферментом и субстратом.
В функциональном отношении в ферменте принято выделять два важных участка в молекуле фермента: активный центр и аллостерический участок.
Активный центр – это участок молекулы фермента, который взаимодействует с субстратом и участвует в каталитическом процессе. Активный центр фермента образован радикалами аминокислот, удалённых друг от друга в первичной структуре. Активный центр имеет трёхмерную укладку, чаще всего в его составе выявляются реакционноспособные
-ОН группы серина
-SH – цистеина
-NH2 лизина
-γ-СООН глютаминовой кислоты
Схема активного центра фермента
|
|
|
|
|
R |
|
|
|
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
R |
R |
10 |
R |
|
R |
|
|
||
1 |
10 |
50 |
|
|||
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
R |
|
|
|
|
|
|
50 |
|
Вактивном центре различают две зоны – зону связывания с субстратом и каталитическую зону.
Зона связывания обычно имеет жёсткую пространственную структуру, к которой комплементарно присоединяется субстрат реакции. Например, трипсин расщепляет белки
вучастках, богатых положительно заряженной аминокислотой лизином, так как в его зоне связывания содержатся остатки отрицательно заряженных аспарагиновой и глютаминовой кислот.
Каталитическая зона - это участок активного центра, непосредственно воздействующий на субстрат и осуществляющий каталитическую функцию. Эта зона более подвижна, в ней возможно изменение взаиморасположения функциональных групп.
Вряде ферментов (чаще олигомерных) кроме активного центра присутствует аллостерический участок – участок молекулы фермента, удалённый от активного центра и взаимодействующий не с субстратом, а с дополнительными веществами (регуляторами, эффекторами). В аллостерических ферментах в одной субъединице может находиться активный центр, в другой - аллостерический участок. Аллостерические ферменты изменяют свою активность следующим образом: эффектор (активатор, ингибитор) действует на аллостерическую субъединицу и изменяет её структуру. Затем изменение конформации аллостерической субъединицы по принципу кооперативных изменений опосредованно меняет структуру каталитической субъединицы, что сопровождается изменение активности фермента.
2.3. Механизм действия ферментов
Ферменты обладают рядом общекаталитических свойств:
•не смещают каталитическое равновесие;
•не расходуются в процессе реакции;
22
•катализируют только термодинамически реальные реакции. Такими реакциями являются те, в которых исходный энергетический запас молекул больше, чем финальный.
Входе реакции преодолевается высокий энергетический барьер. Разница между энергией этого порога и исходным энергетическим уровнем (Е2 – Е0) - энергия активации
(Еа)
Скорость ферментативных реакций определяется энергией активации и рядом других факторов.
Константа скорости химической реакции рассчитывается по уравнению:
− |
E |
a |
|
K = P Z e |
R T |
|
К - константа скорости реакции; Р – пространственный (стерический) коэффициент;
Z – количество взаимодействующих молекул; Еа – энергия активации;
R – газовая постоянная;
Т – универсальная абсолютная температура; е – основание натуральных логарифмов.
В данном уравнении Z, е, R, T – постоянные величины, а Р и Еа - переменные. Причём, между скоростью реакции и стерическим коэффициентом зависимость прямая, а между скоростью и энергией активации – обратная и степенная зависимость (чем ниже Еа, тем выше скорость реакции).
Механизм действия ферментов сводится к увеличению ферментами стерического коэффициента и уменьшению энергии активации.
Снижение ферментами энергии активации
Например, энергия расщепления Н2О2 без ферментов и катализаторов – 18 000 ккал на моль. Если в качестве катализатора используется платина при высокой температуре, энергия активации снижается до 12 000 ккал/моль. При участии фермента каталазы энергия активации составляет лишь 2 000 ккал/моль.
Уменьшение Еа происходит в результате образования промежуточных ферментсубстратных комплексов по схеме: F+S <=> FS-комплекс → F + продукты реакции. Впервые возможность образования ферментсубстратных комплексов была доказана Л. Михаэлисом, М. Ментеном. Впоследствии многие фермент-субстратные комплексы
были выделены. Для объяснения высокой избирательности ферментов при взаимодействии с субстратом предложена теория «ключа и замка» Э Фишера. Согласно ей, фермент взаимодействует с субстратом только при абсолютном соответствии их друг другу (комплементарность) наподобие ключа и замка. Данная теория объясняла специфичность ферментов, но не раскрывала механизм их воздействия на субстрат. Позже разработана теория индуцированного соответствия фермента и субстрата - теория Д. Кошланда (теория «резиновой перчатки»). Её суть состоит в следующем: активный центр фермента сформирован и содержит все функциональные группы ещё до взаимодействия с субстратом (положение 1 на рисунке). Однако эти функциональные группы находятся в неактивном состоянии. Субстрат при присоединении к ферменту индуцирует изменение положения,
23
структуры радикалов в активном центре фермента. В результате активный центр фермента под действием субстрата переходит в активное состояние и, в свою очередь, начинает воздействовать на субстрат, т.е. происходит взаимодействие активного центра фермента и субстрата (положение 2 на рисунке). Вследствие этого субстрат переходит в нестабильное, неустойчивое состояние, что ведёт к уменьшению энергии активации и образованию продуктов реакции с переходом структуры активного центра в исходное состояние (положение 3 на рисунке).
1 |
2 |
3 |
Взаимодействие фермента и субстрата может заключаться в реакциях нуклеофильного замещения, электрофильного замещения, дегидратации субстрата. Возможно также кратковременное ковалентное взаимодействие функциональных групп фермента с субстратом. В основном происходит геометрическая переориентация функциональных групп активного центра.
Увеличение ферментами стерического коэффициента
Стерический коэффициент вводится для реакций, в которых участвуют крупные молекулы, имеющие пространственную структуру. Стерический коэффициент показывает долю удачных пространственно соответствующих столкновений активных молекул. Например, он равен 0,4, если 4 из 10 столкновений активных молекул привели к образованию продукта реакции.
F |
S |
продукты |
4 |
|
реакции |
||||
|
|
|
||
|
|
|
р = 0,4 |
|
F |
S |
нет продуктов |
6 |
|
реакции |
||||
|
|
|
Ферменты увеличивают стерический коэффициент, так как они изменяют строение молекулы субстрата в фермент-субстратном комплексе, в результате чего комплементарность фермента и субстрата возрастает. Кроме того, ферменты за счёт своих активных центров упорядочивают расположение молекул субстрата в пространстве (до взаимодействия с ферментом молекулы субстрата располагаются хаотично) и облегчают протекание реакции.
2.4. Номенклатура ферментов
Ферменты имеют несколько типов названий.
1)Тривиальные названия (трипсин, пепсин).
2)Рабочая номенклатура. В данном названии фермента присутствует окончание – аза, которое прибавляется:
•к названию субстрата (сахараза, амилаза);
•к виду связи, на которую действует фермент (пептидаза, гликозидаза);
24
•к типу реакции, процесса (синтетаза, гидролаза).
3)У каждого фермента есть классификационное название, в котором отражается тип реакции, вид субстрата и кофермента. Например: ЛДГ – L лактат-НАД+ - оксидоредуктаза.
2.5.Классификация ферментов
Классификация ферментов разработана в 1961 году. Согласно классификации каждый фермент расположен в определённом классе, подклассе, подподклассе и имеет порядковый номер. В связи с этим каждый фермент имеет цифровой шифр, в котором первая цифра обозначает класс, вторая – подкласс, третья – подподкласс, четвертая – порядковый номер (ЛДГ: 1.1.1.27.). Все ферменты классифицируются на 6 классов:
1.Оксидоредуктазы.
2.Трансферазы.
3.Гидролазы.
4.Лиазы.
5.Изомеразы.
6.Синтетазы (лигазы).
Оксидоредуктазы
Ферменты, катализирующие окислительно - восстановительные процессы. Общий вид реакции: Аок + Ввос = Авост + Вок. Этот класс ферментов включает несколько подклассов:
1.Дегидрогиназы, катализируют реакции путём отщепления водорода от окисляемого вещества. Они могут быть аэробными (переносят водород на кислород) и анаэробными (переносят водород не на кислород, а на какое-то другое вещество).
2.Оксигеназы - ферменты катализирующие окисление путём присоединения кислорода к окисляемому веществу. Если присоединяется один атом кислорода, участвуют монооксигеназы, если два атома кислорода – диоксигеназы.
3.Пероксидазы – ферменты, катализирующие окисление веществ с участием пероксидов.
Трансферазы
Ферменты, осуществляющие внутримолекулярный и межмолекулярный перенос функциональных групп с одного вещества на другое по схеме: АВ + С = А + ВС. Подклассы трансфераз выделяют в зависимости от вида переносимых групп: аминотрансферазы, метилтрансферазы, сульфотрансферазы, ацилтрансферазы (переносят остатки жирных кислот), фосфотрансферазы (переносят остатки фосфорной кислоты).
Гидролазы
Ферменты данного класса катализируют разрыв химической связи с присоединением воды по месту разрыва, то есть реакции гидролиза по схеме: АВ + НОН = АН + ВОН. Подклассы гидролаз выделяют в зависимости от вида разрываемых связей: пептидазы расщепляют пептидные связи (пепсин), гликозидазы - гликозидные связи (амилаза), эстеразы – сложноэфирные связи (липаза).
Лиазы
Лиазы катализируют разрыв химической связи без присоединения воды по месту разрыва. При этом в субстратах образуются двойные связи по схеме: АВ = А + В. Подклассы лиаз зависят от того, между какими атомами разрывается связь и какие вещества образуются. Альдолазы катализируют разрыв связи между двумя атомами углерода (например, фруктоза 1,6-дифосфатальдолаза «разрезает» фруктозу на две фосфотриозы). К лиазам относят ферменты декарбоксилазы (отщепляют углекислый газ), дегидратазы («вырезают» молекулы воды).
Изомеразы
Изомеразы катализируют взаимопревращения различных изомеров. Например, фосфогексоизимераза переводит эфиры фруктозы в эфиры глюкозы. К подклассам
25
изомераз относятся мутазы (фосфоглюкомутаза переводит глюкозо- 1- фосфат в глюкозо- 6-фосфат), эпимеразы (например, переводят рибозу в ксилулозу), таутомеразы
Синтетазы (лигазы).
Ферменты данного класса катализируют реакции синтеза новых веществ за счёт энергии АТФ по схеме: А + В + АТФ = АВ. Например, глютаминсинтетаза катализирует взаимодействие глютаминовой кислоты с NH3, при участии АТФ с образованием глютамина.
2.6. Свойства ферментов
Ферменты, помимо общих свойств с неорганическими катализаторами имеют определённые отличия от неорганических катализаторов. К ним относятся: более высокая активность, более высокая специфичность, более мягкие условия для катализа, способность к регуляции активности.
2.6.1. Высокая каталитическая активность ферментов
Ферменты отличаются высокой каталитической активностью. Например, одна молекула карбоангидразы за одну минуту катализирует образование (или расщепление) 36 миллионов молекул угольной кислоты (Н2СО3). Высокая активность ферментов объясняется механизмом их действия: они уменьшают энергию активации и увеличивают пространственный (стерический) коэффициент. Высокая активность ферментов имеет важное биологическое значение, состоящее в том, что они обеспечивают высокую скорость химических реакций в организме.
2.6.2. Высокая специфичность ферментов
Все ферменты обладают специфичностью, однако степень специфичности в разных ферментах различна. Выделяют несколько видов специфичности ферментов.
Абсолютная субстратная специфичность, при которой фермент действует только на одно определённое вещество. Например, фермент уреаза расщепляет только мочевину.
Абсолютная групповая специфичность, при которой фермент оказывает один и тот же каталитический эффект на группу соединений, близких по структуре. Например, фермент алкогольдегидрогеназа окисляет не только С2Н5ОН, но и его гомологи с большим числом углеродных атомов,
Относительная групповая специфичность, при которой фермент осуществляет катализ разных классов органических веществ. Например, фермент трипсин проявляет пептидазную и эстеразную активность.
Стереохимическая специфичность (оптическая специфичность), при которой расщепляется только определённая форма изомеров (D, L формы, α, β, цис - трансизомеры). Например, ЛДГ действует только на L-лактат, L-аминокислотоксидазы действуют на L- изомеры аминокислот.
Высокая специфичность объясняется уникальной для каждого фермента структурой активного центра. Она имеет важное биологическое значение, поскольку обеспечивает упорядоченность химических процессов в организме. Специфичность ферментов лежит в основе их обнаружения в тканях и биологических жидкостях.
2.6.3. Термолябильность ферментов
Термолябильность - зависимость активности ферментов от температуры. При повышении температуры от 00 до 400С активность ферментов возрастает согласно правилу Вант-Гоффа (при возрастании температуры на 10 градусов скорость реакции увеличивается в 2 – 4 раза). При дальнейшем повышении температуры активность ферментов начинает снижаться, что объясняется тепловой денатурацией белковой молекулы фермента.
Графически термозависимость ферментов изображена на рисунке:
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
26 |
V |
|
|
|
Инактивация |
фермента |
при 00С обратима, |
а при |
|||
t оптимум |
|
высокой |
температуре |
инактивация |
приобретает |
|||||
|
|
|||||||||
|
|
|
|
необратимый характер. Это свойство ферментов |
||||||
|
|
|
|
определяет максимальную скорость реакции в условиях |
||||||
|
|
|
|
температуры тела человека. Термолябильность ферментов |
||||||
|
|
|
|
должна учитываться в практической медицинской |
||||||
|
|
|
|
деятельности. Например, при проведении ферментативной |
||||||
|
|
|
|
реакции in vitro, необходимо создавать оптимальную |
||||||
|
|
0 |
, C |
температуру. Это |
свойство |
ферментов |
может |
быть |
||
|
|
t |
применено в криохирургии, когда сложная длительная |
|||||||
|
|
|
|
|||||||
0 |
37-40 |
60 |
|
операция проводится при снижении температуры тела, что |
||||||
|
|
|
|
замедляет скорость протекающих в организме реакций, |
||||||
снижает потребление кислорода тканями. Хранить ферментативные препараты необходимо при пониженной температуре. Для разрушения ферментов микроорганизмов используют высокие температуры (автоклавирование операционного материала, кипячение инструментария).
2.6.4. Фотолябильность ферментов
Фотолябильность – чувствительность ферментов к действию ультрафиолетовых лучей. УФЛ вызывают фотоденатурацию белковых молекул и уменьшают активность ферментов. Это свойство ферментов используют в бактерицидном эффекте ультрафиолетовых ламп.
2.6.5. Зависимость активности ферментов от рН.
У всех ферментов есть определённый интервал
V |
рН, в котором активность фермента максимальна - |
|
|
||
|
оптимум рН. Для многих ферментов оптимум около 7. |
|
|
В то же время, для пепсина оптимальная среда 1-2, для |
|
|
щелочной фосфатазы около 9. При отклонении рН от |
|
|
оптимума активность фермента снижается, что видно из |
|
|
графика. Это свойство ферментов объясняется |
|
|
изменением ионизации ионогенных групп в молекулах |
|
|
фермента, что ведёт к изменению ионных связей в |
|
рН |
молекуле белковой молекулы фермента. Это |
|
сопровождается изменением конформации молекулы |
||
|
||
рН-оптимум |
фермента, а это, в свою очередь, приводит к изменению |
|
|
его активности. В условиях организма рНзависимость |
определяет максимальную активность ферментов. Данное свойство находит и практическое применение. Ферментативные реакции вне организма проводятся при оптимуме рН. При сниженной кислотности желудочного сока с лечебной целью назначают раствор НСl.
2.6. 6. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и концентрации субстрата
Зависимость скорости реакции от концентрации фермента и концентрации субстрата (кинетика ферментативных реакций) представлена соответственно на графиках.
График 1 График 2
V
[S] высока
F
27
V максимальное значение
прямопропорциональная 
зависимость [S]
Вферментативной реакции выделяют скорости трёх составляющих этапов:
1.образование фермент-субстратного комплекса FS;
2.обратный распад фермент–субстратного комплекса;
3.распад фермент-субстратного комплекса с образованием продуктов реакции.
F + S |
1 |
|
FS |
3 |
F + P |
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|||
2 |
|
|
||||
|
|
|
|
|
||
Скорость каждой из этих реакций подчиняется закону действующих масс:
V1 = К1 [F] ·[S] V2 = K2 [FS] V3 = K3 [FS]
В момент равновесия скорость реакции образования FS равна сумме скоростей его распада: V1=V2+V3. Из трёх этапов ферментативной реакции наиболее важным и медленным является третий, так как он связан с образованием продуктов реакции. По приведенной выше формуле найти скорость V3 невозможно, так как ферментсубстратный комплекс очень неустойчив и измерение его концентрации затруднено. В связи с этим, Л. Михаэлис, М. Ментен ввели константу Михаэлиса - Кm и преобразовали уравнение для измерения V3 в новое уравнение, в котором присутствуют реально измеримые величины. Ниже представлены два варианта данного уравнения
V |
= |
V |
|
|
S |
max |
|
||||
|
|
|
|||
3 |
|
K |
|
+ S |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
m |
|
|
V |
= |
K |
|
F |
S |
||
|
3 |
|
|
0 |
S |
||
|
|
|
|
|
|||
3 |
|
|
K |
|
+ |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
m |
|
|
[F0] – исходная концентрация фермента; Кm – константа Михаэлиса.
Физический смысл Кm: Кm = (К2+К3) /К1, т.е. она показывает соотношение констант скоростей распада фермент-субстратного комплекса и константы скорости его образования.
Уравнение Михаэлиса-Ментен является универсальным. Оно иллюстрирует зависимость скорости реакции от [F0] от [S].
1. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата. Эта зависимость выявляется при малых концентрациях субстрата [S]<Km. В этом случае концентрацией субстрата в
уравнении можно пренебречь и уравнение приобретает вид: V3 = K3 F0 S . В данном
Km
уравнении K3, [F0], Km – константы и могут быть заменены новой константой К*. Таким образом, при малой концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональна этой концентрации V3 = K* · [S]. Эта зависимость соответствует первому участку графика 2.
2.Зависимость скорости от концентрации фермента проявляется при высокой концентрации субстрата. S > Km. В этом случае можно пренебречь Km и уравнение
|
|
|
28 |
|
F S |
= K3 F0 = Vmax . Таким образом, при |
|
преобразуется в следующее:V3 = K3 |
0 |
|
|
S |
|||
высокой концентрации субстрата скорость реакции определяется концентрацией фермента и достигает максимального значения V3 = K3[F0]=Vmax. (третий участок графика 2).
3. Уравнение позволяет определить численное значение Km при условии V3 = Vmax2 . В этом
случае оно приобретает вид: Vmax = Vmax S , откуда следует, что Km=[S]
2 Km + S
Таким образом, Кm численно равна концентрации субстрата при скорости реакции, равной половине максимальной. Кm является очень важной характеристикой фермента, она измеряется в молях (10-2 – 10-6 моль) и характеризуют специфичность фермента: чем ниже Km, тем выше специфичность фермента.
Графическое определение константы Михаэлиса возможно на графике зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента (слева).
V
Vmax
III
II
Vmax
2
I
S
Km
1 
V
1 Vmax
− |
1 |
|
K |
|
|
|
m |
|
|
|
|
1S
Удобнее использовать график, представляющий предложен Лайнуивером – Берком (график двойных
соответствует обратному уравнению Михаэлиса – Ментен |
||||||
1 |
= |
K |
m |
+ S |
. |
|
|
|
|
|
|||
V |
V |
|
|
S |
||
|
|
|
|
|||
3 |
|
max |
|
|
||
прямую линию. Такой график обратных величин), который (справа)
2.6.7. Зависимость скорости ферментативных реакций от присутствия активаторов и ингибиторов.
2.6.7.1. Влияние активаторов ферментов
Активаторы – вещества, повышающие скорость ферментативных реакций. Различают специфические активаторы, повышающие активность одного фермента (НСl - активатор пепсиногена) и неспецифические активаторы, увеличивающие активность целого ряда ферментов (ионы Mg – активаторы гексокиназы, К, Na –АТФ-азы и ряда других ферментов). В качестве активаторов могут служить ионы металлов, метаболиты, нуклеотиды.
Механизм действия активаторов может быть различным.
1.Достраивание активатором активного центра фермента, в результате чего облегчается взаимодействие фермента с субстратом. Таким механизмом обладают в основном ионы металлов.
2.Аллостерический активатор взаимодействует с аллостерическим участком (субъединицей) фермента, через его изменения опосредованно изменяет структуру активного центра и увеличивает активность фермента. Аллостерическим эффектом
обладают метаболиты ферментативных реакций, АТФ.
29
3.Аллостерический механизм может сочетаться с изменением олигомерности фермента. Под действием активатора происходит объединение нескольких субъединиц в олигомерную форму, что резко увеличивает активность фермента. Например, изоцитрат является активатором олигомерного фермента ацетил-КоА карбоксилазы.
4.Фосфолирирование - дефосфолирирование ферментов относится к обратимой модификации ферментов. Присоединение Н3РО4 чаще всего резко увеличивает активность фермента. Например, два неактивных димера фермента фосфорилазы соединяются с четырьмя молекулами АТФ и образуют активную тетрамерную фосфорилированную форму фермента. Фосфолирирование ферментов может сочетаться с изменением их олигомерности. В некоторых случаях фосфорилирование фермента, наоборот, снижает его активность (например, фосфорилирование фермента гликогенсинтетазы)
5.Частичный протеолиз (необратимая модификация). При данном механизме от неактивной формы фермента (профермента) отщепляется фрагмент молекулы, блокирующий активный центр фермента. Например, неактивный пепсиноген под действием HCL переходит в активный пепсин.
2.6.7.2. Влияние ингибиторов ферментов
Ингибиторы – вещества, понижающие активность фермента. Выделяют различные виды ингибиторов.
•По специфичности выделяют специфичные и неспецифичные ингибиторы
•По обратимости эффекта различают обратимые и необратимые ингибиторы.
•По месту действия встречаются ингибиторы, действующие на активный центр и вне активного центра.
•По механизму действия различают конкурентные и неконкурентные ингибиторы. Конкурентные ингибиторы имеют структуру, близкую к структуре субстрата. В
силу этого ингибитор и субстрат конкурируют за связывание активного центра фермента. Конкурентное ингибирование - это обратимое ингибирование Эффект конкурентного ингибитора может быть уменьшен путём повышения концентрации субстрата реакции
Ing + F |
Ing |
|
[S] |
||
|
IngF - продукты реакции не образуются
Примером конкурентного ингибирования может служить угнетение активности сукцинатдегидрогеназы, катализирующей окисление дикарбоновой янтарной кислоты, дикарбоновой малоновой кислотой, сходной по структуре с янтарной кислотой.
O |
OН |
|
C |
|
СН2 |
|
СН2 |
|
C |
O |
OH |
янтарная
кислота
O |
C |
OH |
|
|
|
|
СН |
2 |
|
|
|
|
C |
|
O |
|
OH |
малоновая |
||
кислота |
||
Принцип конкурентного ингибирования широко используется при создании лекарственных средств. Например, сульфаниламидные препараты имеют структуру, близкую к структуре парааминобензойной кислоты, необходимой для роста микроорганизмов. Сульфаниламиды блокируют ферменты микроорганизмов, необходимые для усвоения парааминобензойной кислоты. Некоторые противоопухолевые препараты являются аналогами азотистых оснований и, тем самым, ингибируют синтез нуклеиновых кислот (фторурацил).
Графически конкурентное ингибирование (2) имеет вид, представленный на рисунке.
V
1
2
0 |
K |
|
K |
|
|
|
m |
m1 |
|
||
|
|
|
а |
||
|
|
|
|
|
V |
= V |
max |
1 |
1 |
V |
|
|
2 |
max |
|
S
30
1 |
|
V |
2 |
1
1 |
= |
1 |
|
V |
V |
||
|
|||
max |
|
1 |
− |
1 |
− |
1 |
1 |
||
K |
|
K |
|
S |
||
|
m |
|
m1 |
|||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
б |
Неконкурентные ингибиторы структурно не схожи с субстратами реакций и поэтому не могут вытесняться при высокой концентрации субстрата. Существует несколько вариантов действия неконкурентных ингибиторов:
1.Блокирование ингибитором функциональной группы активного центра фермента и, вследствие этого, уменьшение активности. Например, активность SН - групп могут уменьшать тиоловые яды обратимо (соли металлов, ртути, свинца) и необратимо (монойодацетат). Эффект ингибирования тиоловых ингибиторов может быть уменьшен введением добавочных веществ, богатых SH группами (например, унитиол). Существуют сериновые ингибиторы, блокирующие ОН - группы активного центра ферментов. Таким эффектом обладают органические фосфофторсодержащие вещества. Эти вещества могут, в частности, ингибировать ОН - группы в ферменте ацетилхолинэстеразе, разрушающей нейромедиатор ацетилхолин.
2.Блокирование ингибитором ионов металлов, входящих в состав активного центра
ферментов. Например, цианиды блокируют атомы железа, ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) блокирует ионы Са 2+, Mg 2+.
3.Аллостерический ингибитор взаимодействует с аллостерическим участком, опосредованно через него по принципу кооперативности, меняя структуру и активность каталитического участка. Графически неконкурентное ингибирование
(2) имеет вид:
V
|
|
V |
1 |
|
max |
|
|
|
|
|
V |
|
2 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
V |
|
|
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
V |
2 |
max |
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
K |
m |
= K |
m1 |
|
|
|
S |
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
а |
|
|
|
1 
V
1 V1
− |
1 |
= − |
1 |
||
K |
|
K |
|
||
|
m |
|
m1 |
||
|
|
|
|
||
б
2 1
1 Vmax
1S
Как видно из рисунка, максимальная скорость реакции при неконкурентном ингибировании не может быть достигнута путём повышения концентрации субстрата.
2.8. Регуляция активности ферментов в процессе метаболизма
Адаптация организма к меняющимся условиям (режим питания, экологические воздействия и пр.) возможна благодаря изменению активности ферментов. Существует несколько возможностей регуляции скорости ферментных реакций в организме:
31
1.Изменение скорости синтеза ферментов (этот механизм требует длительного отрезка времени).
2.Увеличение доступности субстрата и фермента путём изменения проницаемости клеточных мембран.
3.Изменение активности ферментов, уже имеющихся в клетках. Данный механизм
|
осуществляется с большой скоростью и носит обратимый характер. |
|
||||
|
|
|
В многоступенчатых ферментативных |
процессах |
||
|
|
|
выделяют |
регуляторные, ключевые |
ферменты, |
которые |
F |
F |
F |
ограничивают суммарную скорость процесса. Чаще всего |
|||
A → B →C →D |
||||||
1 |
2 |
3 |
|
|
|
|
|
|
|
ими являются ферменты начальной и конечной стадий |
|||
|
|
|
процесса (F1 и F3 на схеме). Изменение активности ключевых |
|||
ферментов происходит по различным механизмам. |
|
|
||||
1. |
Аллостерический механизм: |
|
|
|
||
аллостерический |
действует аллостерическая |
действует каталитическая ведет |
увеличение |
|||
регулятор |
субъединица |
субъединица |
активности фермента |
|||
2. |
Изменение олигомерности фермента: |
|
|
|||
|
Мономеры не активные ↔ олигомеры активные |
|
|
|||
3. Фосфолирирование - дефосфорилирование: |
|
|
||||
Фермент (неактивный) + Н3РО4 ↔ фосфорилированный активный фермент.
В клетках широко распространено ретроингибирование, при котором продукты ферментативного процесса угнетают ферменты начальных стадий (на схеме конечный продукт D угнетает активность F1). Например, высокие концентрации пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов угнетают начальные в стадии их синтеза.
Иногда исходные субстраты активируют конечные ферменты, на схеме: субстрат А активирует F3. Например, активная форма глюкозы (глюкозо-6-фосфат) активирует конечный фермент синтеза гликогена из глюкозы (гликогенсинтетазу).
2.9. Структурная организация ферментов в клетке
Слаженность обменных процессов в организме возможна благодаря структурной разобщенности ферментов в клетках. Отдельные ферменты располагаются в тех или иных внутриклеточных структурах – принцип компартментализации. Например, в плазматической мембране активен фермент калий - натриевая АТФ-аза. В митохондриях активны ферменты окислительных реакций (сукцинатдегидрогеназа, цитохромоксидаза). В ядре высока активность ферментов синтеза нуклеиновых кислот (ДНК-полимераза). В лизосомах активны ферменты расщепления различных веществ (РНК - аза, фосфатаза и другие).
Ферменты, наиболее активные в данной клеточной структуре, называются индикаторными или маркерными ферментами. Изменение их активности отражает глубину структурных повреждений ткани. Некоторые ферменты объединяются в полиферментные комплексы, например, пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК), осуществляющий окисление пировиноградной кислоты.
2.10.Принципы обнаружения и количественного определения ферментов:
Обнаружение ферментов основано на их высокой специфичности. Ферменты
обнаруживают по производимому ими действию, т.е. по факту протекания той реакции, которую катализирует данный фермент. Например, амилазу обнаруживают по реакции расщепления крахмала до глюкозы.
Критериями протекания ферментативной реакции могут быть:
•исчезновение субстрата реакции;
•появление продуктов реакции;
•изменение оптических свойств кофермента.