1.Перечислите наиболее распространенные методы количественного определения содержания белков. Укажите их принципы:
а), б), в), г), д).
2. Перечислите группы сложных белков. Назовите их простети-
ческие группы:
а), б), в), г), д), ж).
3. а) дайте понятие о четвертичной структуре белков
б) назовите связи, ее стабилизирующие
в) укажите биологическую роль этой структуры
г) приведите примеры белков, имеющих четвертичную структуру
4. а) проиллюстрируйте ионизацию белков по кислотному типу
б) проиллюстрируйте ионизацию белков по щелочному типу
в) отметьте биологическую роль ионизации белков
г) укажите практическое применение ионизации белков
5. а) Охарактеризуйте липопротеиды
б) Укажите их биологические функции
6. Напишите трипептид: арг-вал-тре
1
Для определения концентрации белков в биологических жидкостях и растворах используются оптические, колориметрические и азотометрические методы.
Оптические методы основаны на оптических свойствах белков. К ним относятся:
спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм. Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;
рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;
нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;
поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.
Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков – биуретовая реакция, метод Лоури, метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.
Азотометрические методы основаны на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота).
2
Выделяют следующие группы сложных белков:
1. хромопротеиды;
2. нуклеопротеиды;
3. липопротеиды;
4. гликопротеиды;
5. фосфопротеиды;
6. металлопротеиды
А)Хромопротеиды
Хромопротеиды содержат в качестве простетической группы окрашенные небелковые соединения. В группе хромопротеидов выделяют гемопротеиды и флавопротеды.
В гемопоротеидах простетической группой является гем – органическое, железосодержащее вещество, придающее белку красный цвет.
В флавопротеидах содержится простетическая группа жёлтого цвета. В качестве простетической группы могут быть представлены нуклеотиды ФАД, ФМН
3
Четвертичной структурой обладают белки, состоящие из нескольких полипептидных цепей, ковалентно не связанных друг с другом. Их называют олигомерными белками. Протомером считается отдельная полипептидная цепь, имеющая три уровня структурной организации, субъединицей – функционально активная часть олигомерного белка. Субъединица может содержать один протомер или несколько протомеров. Четвертичная структура - количество и взаимное расположение субъединиц в олигомерных белках.
В формировании четвертичной структуры участвуют непрочные нековалентные связи (гидрофобные, ионные, водородные). Четвертичная структура белков формируются самопроизвольно, и легко нарушается различными воздействиями. Отдельные субъединицы в олигомером белке влияют друг на друга, что приводит к изменению третичной структуры отдельных протомеров. Это явление называется кооперативными изменениями конформации протомеров и сопровождается изменением биологической активности белка.
. Гемоглобин эритроцитов - олигомерный белок, включает 4 полипептидные цепи. Миоглобин мышц – мономерный белок, включает 1 полипептидную цепь.
5
Липопротеиды
Липопротеиды в качестве простетической группы содержат различные липиды (триацилглицерины, фосфолипиды, холестерин и др.). Между белком и липидом формируются гидрофобные и ионные связи. Липопротеиды принято делить на структурные, входящие в состав клеточных мембран, и транспортные, осуществляющие перенос липидов кровью. Транспортные липопротеиды представляют собой сферические частицы, внутри которых находятся гидрофобные жиры, а на поверхности – фосфолипиды и гидрофильные белки. Примером липопротеида может служить фактор свёртывания крови – тромбопластин.
14.
1.Перечислите группы простых белков
а), б), в), г), д), ж), з).
2. Укажите биологическое значение первичной структуры белков
а) б) в) г)
3. а) назовите виды вторичной структуры белков
б) укажитте связи, стабилизирующие вторичную структуру
в) охарактеризуйте -складчатую структуру белков
4. а) дайте понятие о денатурации белков
б) укажите химические денатурирующие агенты
в) каково практическое применение денатурации белков?
5. Альбумины, глобулины
а) особенности аминокислотного состава
б) физико-химические свойства
в) распространение
г) биологическая роль
6. Напишите трипептид: сер-глю-про
1
К протеинам (простым белкам) относят белки, состоящие только из аминокислот.
Они, в свою очередь, делятся на группы в зависимости от физико-химических свойств и особенностей аминокислотного состава. Выделяют следующие группы простых белков:
альбумины;
глобулины;
протамины;
гистоны;
проламины;
глютелины;
протеиноиды
2
Исследование первичной структуры имеет важное общебиологическое и медицинское значение:
Первичная структура является определяющей для последующих структур белка.
Знание первичной структуры белка необходимо для искусственного синтеза белков с заданными биологическими свойствами
Первичная структура определяет видовую специфичность белков, например, в белке инсулине, обычно в середине молекулы у различных видов животных и человека происходит замена, как правило, 3-х равноценных по свойствам радикалов аминокислот.
Изменения в первичной структуре могут причиной молекулярных патологий. Например, при серповидноклеточной анемии в гемоглобине в β - цепи в 6 положении глютаминовая кислота заменяется на валин. Эта замена на неравноценную по свойствам радикала аминокислоту приводит к нарушению функции гемоглобина и появлению серповидной формы эритроцитов
3
Вторичная структура - регулярно повторяющаяся форма укладки полипептидной цепи в пространстве. Чаще всего в белках встречается 2 вида вторичной структуры: α - спираль и β – складчатая структура.
α – спираль в 1951 году изучена Л. Полингом с помощью рентгеноструктурного метода. Она представляет собой правозакрученную спиральную структуру, в одном витке которой укладывается 3,6 аминокислоты. Шаг спирали (расстояние между соседними витками) составляет 0,54 н.м. α - спираль фиксируется водородными связями, которые замыкаются между пептидными связями, образованными каждой 4-ой аминокислотой. Вторичная α - структура укладывается самопроизвольно и определяется первичной структурой белка. Доля участков, уложенных в спиральную структуру, в различных белках различна. Например, в гемоглобине, миоглобине преобладает α - структурная укладка, которая в 4 раза уменьшает размеры белковой молекулы.
β – структура имеет вид «гармошки» и стабилизируется водородными связями между удалёнными участками одной полипептидной цепи или между несколькими полипептидными цепями. Выделяют параллельные β – структуры, в которых N и С-концы соответствуют друг другу, и антипараллельные структуры. Примером белков, содержащих преимущественно β – структуры, являются фиброин шёлка, иммуноглобулины.
Вторичную структуру изучают методами рентгеноструктурного анализа, исследованием поглощения белком ультрафиолетовых лучей (чем больше доля α – структур, тем больше поглощение).
Вторичная структура белков разрушается при денатурации.
4
Денатурация – нарушение физико-химических свойств белка, его биологической активности при воздействии факторов, разрушающих вторичную, третичную, четвертичную структуры белка.
При денатурации белковая молекула теряет свою прижизненную (нативную) структуру и переходит в форму неупорядоченного клубка, на поверхности которого располагается много гидрофобных групп, что резко снижает растворимость белка.
Признаками денатурации являются:
выпадение осадка;
изменение оптических свойств;
изменение активности его химических групп и конформации белковой молекулы;
снижение биологической активности;
более быстрое расщепление ферментами пептидазами.
К денатурирующим факторам относятся химические факторы (минеральные и органические кислоты, соли тяжелых металлов, алкалоиды, высокая концентрация мочевины) и физические факторы (высокая температура, рентгеновское излучение, УФЛ).
На начальных стадиях денатурация носит обратимый характер и возможна ренатурация – восстановление структуры белка. При продолжительном действии денатурирующих факторов она приобретает необратимый характер. Денатурацию белков применяют для обнаружения белков в растворах и биологических жидкостях, для удаления белков из биологических жидкостей при проведении биохимических исследований.
5
Альбумины
Альбумины – широко распространённая группа белков в тканях организма человека.
Они имеют сравнительно невысокую молекулярную массу 50 – 70 тыс. д. Альбумины в физиологическом диапазоне рН имеют отрицательный заряд, так как в силу высокого содержания глютаминовой кислоты в их составе находятся в изоэлектрическом состоянии при рН 4,7. Имея невысокую молекулярную массу и выраженный заряд, альбумины перемещаются при электрофорезе с достаточно высокой скоростью. Аминокислотный состав альбуминов разнообразен, они содержат весь набор незаменимых аминокислот. Альбумины – высоко гидрофильные белки. Они растворимы в дистиллированной воде. Вокруг молекулы альбуминов формируется мощная гидратная оболочка, поэтому для высаливания их из растворов необходима высокая 100% концентрация сульфата аммония. Альбумины выполняют в организме структурную, транспортную функцию, участвуют в поддержании физико–химических констант крови.
Глобулины
Глобулины – широко распространённая гетерогенная группа белков, обычно сопутствующая альбуминам. Они имеют более высокую, чем альбумины молекулярную массу – до 200 и более тыс. д., поэтому медленнее перемещаются при электрофорезе. Изоэлектрическая точка глобулинов находится при рН 6,3 – 7. Они отличаются разнообразным набором аминокислот. Глобулины не растворимы в дистиллированной воде, но растворимы в солевых растворах КCl, NaCl в концентрации 5 – 10 %. Глобулины менее гидратированы, чем альбумины, поэтому высаливаются из растворов уже при 50% насыщении сульфатом аммония. Глобулины в организме выполняют в основном структурную, защитную, транспортную функции.
15.
1.Назовите щелочные функциональные группы белков:
а), б), в), г).
в) охарактеризуйте -складчатую структуру белков
2. а) дайте понятие о третичной структуре белков
б) назовите связи, ее стабилизирующие
в) укажите биологическую роль третичной структуры
г) приведите примеры пространственной конформации белков
3. а) поясните механизм гидратации белков
б) приведите примеры гидрофильных белков
в) укажите биологическую роль гидратации белков
4. а) поясните принцип колориметрических методов определения
концентрации белков
б) приведите примеры колориметрических методов
5. а) Охарактеризуйте фосфопротеиды
б) Приведите примеры
в) Укажите биологическое значение
6. Напишите трипептид: асп-гис-вал
5
Фосфопротеиды
Фосфопротеиды содержат остатки фосфорной кислоты, соединённые с радикалами остатков серина, реже треонина белковой части сложноэфирными связями. Присоединение фосфорной кислоты к белку может носить обратимый характер и сопровождаться формированием или разрывом ионных связей фосфорной кислоты и заряженных групп белка, что меняет структуру и биологическую активность фосфопротеида. К фосфопротеидам относятся структурные белки костной ткани, казеиноген молока, ововителлин белка куриного яйца, некоторые ферменты (фосфорилаза, гликогенсинтетаза, ТАГ-липаза).
4
Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков – биуретовая реакция, метод Лоури, метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.
2
Третичная структура - специфическая для каждого белка форма укладки полипептидной цепи в пространстве. Данная структура формируется самопроизвольно и определяется первичной структурой. Третичная структура значительно, в десятки раз увеличивает компактность белка. В формировании третичной структуры участвуют нековалентные связи (гидрофобные, ионные) и ковалентные (дисульфидные) связи, изображённые на рисунке.
Третичная структура определяет биологическую активность и некоторые физико-химические свойства белков. Изменения в третичной структуре белка отражается на его биологической активности.
Методами изучения третичной структуры являются рентгеноструктурный анализ и определение химической доступности отдельных радикалов аминокислот в белке. Третичная структура белка миоглобина впервые была изучена Дж. Кендрью (1957 г.). М. Перутцем (1959 г.) была изучена структура гемоглобина.
В третичную структуру белков входят α - спиральные, β - складчатые структуры, β- петли (в них полипептидная цепь изгибается на 1800) и, так называемый, неупорядоченный клубок. Например, в белке инсулине содержится 57% α - спиральных участков, 6% β- складчатых структур, 10% молекулы уложены в виде β - петлей и 27% молекулы представляют неупорядоченный клубок.
Совокупность первичной, вторичной, третичной структур составляет конформацию белковой молекулы. Прижизненная (нативная) конформация формируется самопроизвольно, и её образование носит название фолдинг. Конформация белков очень не устойчива и формируется при участии особых белков – шаперонов (компаньонов). Шапероны способны связываться с частично денатурированными, находящимися в неустойчивом состоянии белками, и восстанавливать их нативную конформацию. Шапероны классифицируют по их молекулярной массе (60 – 100 кд.). Наиболее изучены Ш-60, Ш-70 и Ш-90. Например, Ш-70 взаимодействуют с белками, богатыми гидрофобными радикалами, защищают их от высокотемпературной денатурации. В целом шапероны экранируют основные белки организма, препятствуют денатурации и способствуют формировании конформации, облегчают транспорт денатурированных белков в лизосомы, участвуют в процессе биосинтеза белков.
По конформации все белки делятся на три группы:
фибриллярные белки: коллаген, эластин, фиброин;
глобулярные белки: гемоглобин, альбумин, глобулин;
смешанные белки: миозин.
Третичная структура присуща всем белкам.
16.
1. Назовите кислотные функциональные группы белков:
а), б), в).
2. а) дайте понятие о первичной структуре белков
б) укажите роль пептидной связи в формировании этой структуры
в) приведите основные приемы расшифровки первичной структуры
белков
3. а) перечислите оптические свойства белков
б) проиллюстрируйте практическое применение этих свойств
4. а) Дайте понятие о доменных белках
б) приведите примеры
5. а) Охарактеризуйте хромопротеиды
б) Приведите примеры
6. Напишите трипептид: гис-изолей-арг
2
Первичная структура – порядок чередования аминокислот в полипептидной цепи.
Впервые первичная структура изучена в 1954 году Ф. Сенджером для гормона инсулина. Изучение первичной структуры представляет сложный процесс и включает два основных этапа: изучение аминокислотного состава и изучение последовательности соединения аминокислот в полипептидной цепи.
Изучение аминокислотного состава белка осуществляется путём его гидролиза до аминокислот. Для разрыва прочных пептидных связей между аминокислотами используют кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз белка. Кислотный гидролиз осуществляется путём кипячения раствора белка с 6-нормальным раствором соляной кислоты в течение 16 - 92 часов. Щелочной гидролиз производится кипячением раствора белка с 2-4 нормальным раствором NaOH в течение 4 – 8 часов. Ферментативный гидролиз происходит при участии ферментов протеиназ (пептидаз): трипсин, пепсин. В отличие от кислотного и щелочного гидролиза ферментативный гидролиз (протеолиз) наиболее специфичен, при нём ферменты расщепляют только определённые связи в белках. Окончание процесса гидролиза оценивают по двум признакам: а) по отсутствию положительной биуретовой реакции на пептидные связи и б) по окончанию прироста концентрации аминогрупп и карбоксильных групп в гидролизате. Динамику прироста аминогрупп и карбоксильных групп оценивают методом формольного титрования, связывая формальдегидом аминогруппы аминокислот, освобождающихся при гидролизе белка. Образовавшиеся при гидролизе аминокислоты идентифицируют хроматографическими методами, основанными на различных физико-химических свойствах аминокислот.
Исследование последовательности аминокислот в составе белка, в свою очередь, проводится различными методами. Белки с высокой молекулярной массой предварительно подвергаются частичному ферментативному гидролизу до коротких пептидов. Затем в полученных коротких пептидах определяются последовательно более доступные для исследования концевые аминокислоты, находящиеся или на N-конце, или на С-конце пептида.
С целью распознавания С - и N -концевых аминокислот применяются ферментативные методы. Ферменты аминопептидазы отщепляют от пептида N - концевую аминокислоту, которая определяется хроматографически. Ферменты карбоксипептидазы, отщепляют от белка С - концевую аминокислоту.
Аминопептидазы Карбоксипепетидазы
Наряду с ферментативными используются химические методы распознавания концевых аминокислот:
А) методы исследования N- концевых аминокислот заключаются в присоединении к N -концевой аминокислоте какой - то «химической метки» при помощи связи, более прочной, чем пептидная связь. При последующем г
идролизе N- концевая аминокислота оказывается связанной с каким-либо химическим веществом. - меткой. С этой целью используют реактив Сенджера - динитрофторбензол С6Н5(NO2)2F. Этот метод неудобен, тем, что он предполагает одноразовое исследование. В связи с этим чаще используют реактив Эдмана - фенилизотиоцианатнат С6Н5-N(S)=C. Одновременно с присоединением фенилизотиоцианата к N –концевой аминокислоте происходит образование циклического продукта и ослабление связи N-концевой аминокислоты с полипептидной цепью. С помощью последующего мягкого гидролиза осуществляется отщепление меченой N-концевой аминокислоты с сохранением остальной части белковой молекулы. Вторая аминокислота с N-конца в результате становится концевой и распознается повторным применением реактива (смотри схему).
Б) Методы распознавания С - концевой аминокислоты.
Метод Акобори заключается в использовании фенилгидразина. Фенилгидразин разрывает пептидные связи в белке и присоединяется ко всем аминокислотам, кроме C-концевой. Последующий хроматографический анализ позволяет распознать С - концевую аминокислоту в составе белка (смотри схему).
Исследование первичной структуры имеет важное общебиологическое и медицинское значение:
Первичная структура является определяющей для последующих структур белка.
Знание первичной структуры белка необходимо для искусственного синтеза белков с заданными биологическими свойствами
Первичная структура определяет видовую специфичность белков, например, в белке инсулине, обычно в середине молекулы у различных видов животных и человека происходит замена, как правило, 3-х равноценных по свойствам радикалов аминокислот.
Изменения в первичной структуре могут причиной молекулярных патологий. Например, при серповидноклеточной анемии в гемоглобине в β - цепи в 6 положении глютаминовая кислота заменяется на валин. Эта замена на неравноценную по свойствам радикала аминокислоту приводит к нарушению функции гемоглобина и появлению серповидной формы эритроцитов.
В белковой молекуле при чередовании жестких (пептидная связь) и гибких (α -углеродный атом) участков формируется компактная укладка цепи в пространстве.
3
Оптические свойства белков определяются размерами белковых молекул, структурой радикалов аминокислот в белках, а также наличием пептидных связей и альфа-спиральных участков в белках.
Белковые растворы обладают эффектом светопреломления (рефракции) и светорассеивания. Данные свойства обусловлены большими размерами белковых молекул, соизмеримыми с длиной волны видимой части спектра.. При этом короткие синие лучи рассеиваются в большей степени, чем более длинноволновые красные лучи. Степень рефракции пропорциональна концентрации белкового раствора.
Белковые растворы поглощают ультрафиолетовые лучи в диапазоне 190-230 нм за счёт присутствия пептидных связей и в диапазоне 260-280 нм за счёт присутствия в белках циклических аминокислот. Степень поглощения УФЛ пропорциональна концентрации белка в растворе.
Белковые растворы способны вращать плоскость поляризованного света, что обусловлено оптической активностью содержащихся в белке аминокислот и наличием в нём альфа-спиральных участков. Изменение угла вращения поляризованного луча света изменяется при денатурационных воздействиях.
4
Особое положение среди белков занимают доменные белки.
Домены – структурно и функционально обособленные участки одной полипептидной цепи. Домены могут отвечать за взаимодействие белка с различными веществами - лигандами (низкомолекулярные вещества, ДНК, РНК, полисахариды и др.) Примерами доменных белков служат альбумин сыворотки крови, иммуноглобулины, некоторые ферменты (трипсин поджелудочной железы).
В силу высокой избирательности белков они могут объединяться в комплексы, которые чаще всего называются полиферментными комплексами – структурные объединения нескольких ферментов, катализирующих отдельные стадии сложного химического процесса. Например: пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК) включает три вида ферментов, катализирующий окисление пировиноградной кислоты (ПВК).
Возможно специфическое соединение не только отдельных белков, но и белков с липидами (жирами) при образовании клеточных мембран, белков с нуклеиновыми кислотами при формировании хроматина.
5
Хромопротеиды
Хромопротеиды содержат в качестве простетической группы окрашенные небелковые соединения. В группе хромопротеидов выделяют гемопротеиды и флавопротеды.
В гемопоротеидах простетической группой является гем – органическое, железосодержащее вещество, придающее белку красный цвет. Гем соединяется с белком глобином за счёт координационных и гидрофобных связей. Примерами гемопротеидов являются белок эритроцитов гемоглобин, белок мышц миоглобин, тканевые белки цитохромы, ферменты каталаза, пероксидаза. Гемопротеиды участвуют в переносе кислорода и в окислительных процессах в тканях.
В флавопротеидах содержится простетическая группа жёлтого цвета. В качестве простетической группы могут быть представлены нуклеотиды ФАД, ФМН. К флавопротеидам относится фермент сукцинатдегидрогеназа. Некоторые флавопротеиды содержат в своём составе металлы – металлофлавопротеиды. Флавопротеиды участвуют в окислительных процессах в организме.
17
1. Перечислите основные методы фракционирования белков. Укажите их принципы:
а), б), в).