2.Перечислите наиболее распространенные методы количественного определения содержания белков. Укажите их принципы:

а), б), в), г), д).

3. Укажите биологическое значение первичной структуры белков

а) б) в) г)

4. а) дайте понятие о высаливании белков

б) поясните механизм высаливания

в) укажите практическое применение высаливания белков

5. Коллаген

а) особенности аминокислотного состава

б) физико-химические свойства

в) распространение

г) биологическая роль

6. Напишите трипептид: мет-тир-лей

3

Исследование первичной структуры имеет важное общебиологическое и медицинское значение:

1. Первичная структура является определяющей для последующих структур белка.

2. Знание первичной структуры белка необходимо для искусственного синтеза белков с заданными биологическими свойствами

3. Первичная структура определяет видовую специфичность белков, например, в белке инсулине, обычно в середине молекулы у различных видов животных и человека происходит замена, как правило, 3-х равноценных по свойствам радикалов аминокислот.

4. Изменения в первичной структуре могут причиной молекулярных патологий. Например, при серповидноклеточной анемии в гемоглобине в β - цепи в 6 положении глютаминовая кислота заменяется на валин. Эта замена на неравноценную по свойствам радикала аминокислоту приводит к нарушению функции гемоглобина и появлению серповидной формы эритроцитов.

4

• Высаливание – осаждение белков концентрированными растворами электронейтральных или слабокислых солей, таких как NaCl, KCl, (NH₄)₂SO₄.. Механизм высаливания заключается в обратимом снятии с белковой молекулы двух стабилизирующих факторов. Высаливающие вещества содержат в своем составе гидрофильные катионы и анионы, которые «снимают» водную оболочку с белка. При добавлении (NH₄)₂SO₄ в растворе возникает слабокислая реакция, рН приближается к изоэлектрической точке, что уменьшает заряд молекулы белка. Высаливание не нарушает структуры белка и является полностью обратимым процессом, вследствие чего используется для разделения белков, а также для их концентрирования.

5

Коллаген (рождающий клей) – широко распространённый в организме белок, составляет около трети всех белков организма. Входит в состав костей, хрящей, зубов, сухожилий и других видов соединительной ткани.

К особенностям аминокислотного состава коллагена относится, прежде всего, высокое содержание глицина (1/3 всех аминокислот), пролина (1/4 всех аминокислот), лейцина. В составе коллагена присутствуют редкие аминокислоты гидроксипролин и гидроксилизин, но отсутствуют циклические аминокислоты.

Полипептидные цепи коллагена содержат около 1000 аминокислот. Различают несколько видов коллагена в зависимости от сочетания в нём различных видов полипептидных цепей. К фибриллообразующим видам коллагена относятся коллаген первого типа (преобладает в коже), коллаген второго типа (преобладает в хрящах) и коллаген третьего типа (преобладает в сосудах). У новорожденных детей основная масса коллагена представлена III типом, у взрослых людей- II и I типами.

Вторичная структура коллагена представляет особую «ломаную» альфа-спираль, в витке которой укладывается 3,3 аминокислоты. Шаг спирали равен 0,29 нм.

Три полипептидные цепи коллагена уложены в виде тройного закрученного каната, фиксированного водородными связями, и образуют структурную единицу коллагенового волокна – тропоколлаген. Тропоколлагеновые структуры размещаются параллельными, смещёнными по длине рядами, фиксированными ковалентными связями, и формируют коллагеновое волокно. В промежутках между тропоколлагеном в костной ткани откладывается кальций. Коллагеновые волокна содержат в своём составе углеводы, которые стабилизируют коллагеновые пучки.

2

Для определения концентрации белков в биологических жидкостях и растворах используются оптические, колориметрические и азотометрические методы.

Оптические методы основаны на оптических свойствах белков. К ним относятся:

• спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм. Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;

• рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;

• нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;

• поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.

Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков – биуретовая реакция, метод Лоури, метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.

Азотометрические методы основаны на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота).

БИЛЕТ 10.

1. Приведите примеры содержания белков в различных тканях организма человека в расчете на сырой вес ткани

а) б) в)

2. а) дайте понятие о первичной структуре белков

б) укажите роль пептидной связи в формировании этой структуры

в) приведите основные приемы расшифровки первичной структуры

белков

3. а) приведите примеры молекулярной массы некоторых белков организма человека

б) назовите основные методы определения молекулярной массы

белков

4. Охарактеризуйте протеиноиды

а) коллаген б) эластин

5. Перечислите группы сложных белков. Назовите их простети-

ческие группы:

а), б), в), г), д), ж).

6. Напишите трипептид: асп-гис-вал

1

Содержание белков в тканях организма человека выше, чем содержание липидов, углеводов. Оно составляет 18 – 20%. от общей массы тканей (сырой массы). Преобладание в тканях белков по сравнению с другими веществами наиболее наглядно выявляется при расчёте содержания белков на сухую массу тканей – 40 – 45%. Содержание белков в различных тканях колеблется в определённом интервале. Наиболее высоко содержание белков в скелетных мышцах (18 – 23% от сырой массы или 80% от сухой массы ткани). Низким содержанием белков отличается жировая ткань (6% сырой массы или 4% сухой массы ткани).

2

Первичная структура – порядок чередования аминокислот в полипептидной цепи

Впервые первичная структура изучена в 1954 году Ф. Сенджером для гормона инсулина. Изучение первичной структуры представляет сложный процесс и включает два основных этапа: изучение аминокислотного состава и изучение последовательности соединения аминокислот в полипептидной цепи.

1. Изучение аминокислотного состава белка осуществляется путём его гидролиза до аминокислот. Для разрыва прочных пептидных связей между аминокислотами используют кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз белка. Кислотный гидролиз осуществляется путём кипячения раствора белка с 6-нормальным раствором соляной кислоты в течение 16 - 92 часов. Щелочной гидролиз производится кипячением раствора белка с 2-4 нормальным раствором NaOH в течение 4 – 8 часов. Ферментативный гидролиз происходит при участии ферментов протеиназ (пептидаз): трипсин, пепсин. В отличие от кислотного и щелочного гидролиза ферментативный гидролиз (протеолиз) наиболее специфичен, при нём ферменты расщепляют только определённые связи в белках. Окончание процесса гидролиза оценивают по двум признакам: а) по отсутствию положительной биуретовой реакции на пептидные связи и б) по окончанию прироста концентрации аминогрупп и карбоксильных групп в гидролизате. Динамику прироста аминогрупп и карбоксильных групп оценивают методом формольного титрования, связывая формальдегидом аминогруппы аминокислот, освобождающихся при гидролизе белка. Образовавшиеся при гидролизе аминокислоты идентифицируют хроматографическими методами, основанными на различных физико-химических свойствах аминокислот.

2. Исследование последовательности аминокислот в составе белка, в свою очередь, проводится различными методами. Белки с высокой молекулярной массой предварительно подвергаются частичному ферментативному гидролизу до коротких пептидов. Затем в полученных коротких пептидах определяются последовательно более доступные для исследования концевые аминокислоты, находящиеся или на N-конце, или на С-конце пептида.

С целью распознавания С - и N -концевых аминокислот применяются ферментативные методы. Ферменты аминопептидазы отщепляют от пептида N - концевую аминокислоту, которая определяется хроматографически. Ферменты карбоксипептидазы, отщепляют от белка С - концевую аминокислоту.

Аминопептидазы Карбоксипепетидазы

Наряду с ферментативными используются химические методы распознавания концевых аминокислот:

А) методы исследования N- концевых аминокислот заключаются в присоединении к N -концевой аминокислоте какой - то «химической метки» при помощи связи, более прочной, чем пептидная связь. При последующем г

идролизе N- концевая аминокислота оказывается связанной с каким-либо химическим веществом. - меткой. С этой целью используют реактив Сенджера - динитрофторбензол С₆Н₅(NO₂)₂F. Этот метод неудобен, тем, что он предполагает одноразовое исследование. В связи с этим чаще используют реактив Эдмана - фенилизотиоцианатнат С₆Н₅-N(S)=C. Одновременно с присоединением фенилизотиоцианата к N –концевой аминокислоте происходит образование циклического продукта и ослабление связи N-концевой аминокислоты с полипептидной цепью. С помощью последующего мягкого гидролиза осуществляется отщепление меченой N-концевой аминокислоты с сохранением остальной части белковой молекулы. Вторая аминокислота с N-конца в результате становится концевой и распознается повторным применением реактива (смотри схему).

Б) Методы распознавания С - концевой аминокислоты.

Метод Акобори заключается в использовании фенилгидразина. Фенилгидразин разрывает пептидные связи в белке и присоединяется ко всем аминокислотам, кроме C-концевой. Последующий хроматографический анализ позволяет распознать С - концевую аминокислоту в составе белка (смотри схему).

3

Молекулярная масса белков достаточно велика, находится в пределах от 60 000 д. до 100 000 д. Например, молекулярная масса гемоглобина – 68 000 д., альбумина сыворотки крови – 66 000 д., рибонуклеазы – около 14 000 д., миозина – 500 000 д.

Методы определения молярной массы белков должны быть щадящими, не разрушающими белковые молекулы. Например, к белкам не применим эбулиоскопический метод, основанный на измерении температуры кипения растворов. Наиболее точными методами определения молекулярной массы белков являются метод ультрацентрифугирования и рентгеноструктурный метод.

Метод ультрацентрифугирования (седиментации) основан на изменении скорости осаждения белков различной молекулярной массы под действием центробежных сил при вращении белковых растворов с большой скоростью. Молекулярная масса белков, найденная под воздействием мощных центробежных сил, создаваемых в ультрацентрифугах, выражается в единицах Сведберга (S=10^-13c.).

Рентгеноструктурный метод позволяет рассчитать молекулярную массу путём анализа многочисленных рентгеновских снимков молекулы белка.

Электрофоретический метод основан на зависимости скорости передвижения белков в постоянном электрическом поле от молекулярной массы белка (электрофоретическая подвижность выше у белков с меньшей молекулярной массой).

Метод гельфильтрации основан на различной скорости прохождения различных белков через молекулярные гелевые «сита», называемые сефадексами.

4

Протеиноиды

Протеиноиды (белковоподобные вещества) – фибриллярные, водонерастворимые белки опорных тканей (костей, хрящей, сухожилий, связок). Они представлены коллагеном, эластином, кератином, фиброином.

Коллаген (рождающий клей) – широко распространённый в организме белок, составляет около трети всех белков организма. Входит в состав костей, хрящей, зубов, сухожилий и других видов соединительной ткани.

К особенностям аминокислотного состава коллагена относится, прежде всего, высокое содержание глицина (1/3 всех аминокислот), пролина (1/4 всех аминокислот), лейцина. В составе коллагена присутствуют редкие аминокислоты гидроксипролин и гидроксилизин, но отсутствуют циклические аминокислоты.

Полипептидные цепи коллагена содержат около 1000 аминокислот. Различают несколько видов коллагена в зависимости от сочетания в нём различных видов полипептидных цепей. К фибриллообразующим видам коллагена относятся коллаген первого типа (преобладает в коже), коллаген второго типа (преобладает в хрящах) и коллаген третьего типа (преобладает в сосудах). У новорожденных детей основная масса коллагена представлена III типом, у взрослых людей- II и I типами.

Вторичная структура коллагена представляет особую «ломаную» альфа-спираль, в витке которой укладывается 3,3 аминокислоты. Шаг спирали равен 0,29 нм.

Три полипептидные цепи коллагена уложены в виде тройного закрученного каната, фиксированного водородными связями, и образуют структурную единицу коллагенового волокна – тропоколлаген. Тропоколлагеновые структуры размещаются параллельными, смещёнными по длине рядами, фиксированными ковалентными связями, и формируют коллагеновое волокно. В промежутках между тропоколлагеном в костной ткани откладывается кальций. Коллагеновые волокна содержат в своём составе углеводы, которые стабилизируют коллагеновые пучки.

Эластин – белок эластических волокон, связок, сухожилий. Эластин не растворим в воде, не способен к набуханию. В эластине высока доля глицина, валина, лейцина (до 25 – 30%). Эластин способен растягиваться под действием нагрузки и восстанавливать свои размеры после снятия нагрузки. Эластичность связана с присутствием в эластине большого количества межцепочечных сшивок при участии аминокислоты лизина. Две цепи образуют связь лизил – норлейцин, четыре цепи образуют связь – десмозин.

5

Выделяют следующие группы сложных белков:

1. хромопротеиды;

2. нуклеопротеиды;

3. липопротеиды;

4. гликопротеиды;

5. фосфопротеиды;

6. металлопротеиды

А)Хромопротеиды

Хромопротеиды содержат в качестве простетической группы окрашенные небелковые соединения. В группе хромопротеидов выделяют гемопротеиды и флавопротеды.

В гемопоротеидах простетической группой является гем – органическое, железосодержащее вещество, придающее белку красный цвет.

В флавопротеидах содержится простетическая группа жёлтого цвета. В качестве простетической группы могут быть представлены нуклеотиды ФАД, ФМН

11.

1. Укажите основные этапы выделения индивидуальных белков из

тканей:

а), б), в), г), д).

2. Какими новыми свойствами обладают олигомерные белки по сравнению с мономерными?

а) б) в)

3. Укажите процентное содержание основных химических элементов в составе природных белков

а) б) в) г) д)

4. а) назовите виды вторичной структуры белков

б) укажите связи, стабилизирующие вторичную структуру

в) охарактеризуйте -спиральную структуру белков

5. а) Охарактеризуйте хромопротеиды

б) Приведите примеры

6. Напишите трипептид: мет-тир-лей

5

Хромопротеиды

Хромопротеиды содержат в качестве простетической группы окрашенные небелковые соединения. В группе хромопротеидов выделяют гемопротеиды и флавопротеды.

В гемопоротеидах простетической группой является гем – органическое, железосодержащее вещество, придающее белку красный цвет. Гем соединяется с белком глобином за счёт координационных и гидрофобных связей. Примерами гемопротеидов являются белок эритроцитов гемоглобин, белок мышц миоглобин, тканевые белки цитохромы, ферменты каталаза, пероксидаза. Гемопротеиды участвуют в переносе кислорода и в окислительных процессах в тканях.

В флавопротеидах содержится простетическая группа жёлтого цвета. В качестве простетической группы могут быть представлены нуклеотиды ФАД, ФМН. К флавопротеидам относится фермент сукцинатдегидрогеназа. Некоторые флавопротеиды содержат в своём составе металлы – металлофлавопротеиды. Флавопротеиды участвуют в окислительных процессах в организме.

1

Выделение белков из тканей включает несколько этапов.

1. Гомогенизация (измельчение) ткани для разрушения клеточных и внутриклеточных мембран, препятствующих выделению белков. В процессе гомогенизации нередко добавляются детергенты.

2. Экстрагирование (растворение) белков проводят чаще всего слабыми солевыми растворами.

3. Отделение низкомолекулярных веществ (солей) методом диализа с использованием полупроницаемых мембран, методом гель - фильтрации.

4. Очистка белка от сопутствующих белков (фракционирование), основанная на различных физико-химических свойствах белков.

а) ультрацентрифугирование – разделение белков по молекулярной массе;

б) электрофорез – разделение белков по заряду молекулы и молекулярной массе;

в) фракционное высаливание – подбор концентрации соли для осаждения различных белков;

г) хроматографические методы разделения:

• распределительная хроматография – по различной растворимости белков;

• гель-фильтрация – по различной молекулярной массе белков

• ионообменная хроматография – по разнице зарядов белковых молекул

• аффинная хроматография – по химическим свойствам различных белков

5. Выделение белка в кристаллическом состоянии проводится путём лиофилизации (высушивания) при низкой температуре.

4

Вторичная структура - регулярно повторяющаяся форма укладки полипептидной цепи в пространстве. Чаще всего в белках встречается 2 вида вторичной структуры: α - спираль и β – складчатая структура.

α – спираль в 1951 году изучена Л. Полингом с помощью рентгеноструктурного метода. Она представляет собой правозакрученную спиральную структуру, в одном витке которой укладывается 3,6 аминокислоты. Шаг спирали (расстояние между соседними витками) составляет 0,54 н.м. α - спираль фиксируется водородными связями, которые замыкаются между пептидными связями, образованными каждой 4-ой аминокислотой. Вторичная α - структура укладывается самопроизвольно и определяется первичной структурой белка. Доля участков, уложенных в спиральную структуру, в различных белках различна. Например, в гемоглобине, миоглобине преобладает α - структурная укладка, которая в 4 раза уменьшает размеры белковой молекулы.

β – структура имеет вид «гармошки» и стабилизируется водородными связями между удалёнными участками одной полипептидной цепи или между несколькими полипептидными цепями. Выделяют параллельные β – структуры, в которых N и С-концы соответствуют друг другу, и антипараллельные структуры. Примером белков, содержащих преимущественно β – структуры, являются фиброин шёлка, иммуноглобулины.

Вторичную структуру изучают методами рентгеноструктурного анализа, исследованием поглощения белком ультрафиолетовых лучей (чем больше доля α – структур, тем больше поглощение).

Вторичная структура белков разрушается при денатурации.

3

Химический состав белков достаточно разнообразен. Основными химическими элементами являются углерод (51 – 55%), кислород (21 – 23%), азот (16% - наиболее постоянная величина), водород (6- 7%) и непостоянный элемент сера (0,5 – 2%).

12

1. Укажите наиболее важные биологические функции белков. Приве

дите примеры:

а), б), в), г), д).

2. Укажите основные этапы выделения индивидуальных белков из

тканей:

а), б), в), г), д).

3. а) дайте понятие о четвертичной структуре белков

б) назовите связи, ее стабилизирующие

в) укажите биологическую роль этой структуры

г) приведите примеры белков, имеющих четвертичную структуру

4. а) приведите примеры водорастворимых белков

б) приведите примеры водонерастворимых белков

в) укажите факторы, определяющие растворимость белков

5. а) Охарактеризуйте гликопротеиды

б) Приведите примеры

в) Укажите биологическую роль

6. Напишите трипептид: фен-лиз –мет

1

Биологическая роль белков многообразна. Функции белков связаны с их высокой специфичностью, способностью взаимодействовать с различными лигандами, рецепторами, структурами клеток.

• Пластическая (структурная) функция – белки входят в состав всех клеточных структур вместе с нуклеиновыми кислотами, липидами, углеводами.

• Энергетическая функция - 1г белков обеспечивает образование более 4 ккал энергии.

2

Выделение белков из тканей включает несколько этапов.

1. Гомогенизация (измельчение) ткани для разрушения клеточных и внутриклеточных мембран, препятствующих выделению белков. В процессе гомогенизации нередко добавляются детергенты.

2. Экстрагирование (растворение) белков проводят чаще всего слабыми солевыми растворами.

3. Отделение низкомолекулярных веществ (солей) методом диализа с использованием полупроницаемых мембран, методом гель - фильтрации.

4. Очистка белка от сопутствующих белков (фракционирование), основанная на различных физико-химических свойствах белков.

а) ультрацентрифугирование – разделение белков по молекулярной массе;

б) электрофорез – разделение белков по заряду молекулы и молекулярной массе;

в) фракционное высаливание – подбор концентрации соли для осаждения различных белков;

г) хроматографические методы разделения:

• распределительная хроматография – по различной растворимости белков;

• гель-фильтрация – по различной молекулярной массе белков

• ионообменная хроматография – по разнице зарядов белковых молекул

• аффинная хроматография – по химическим свойствам различных белков

5. Выделение белка в кристаллическом состоянии проводится путём лиофилизации (высушивания) при низкой температуре.

3

Четвертичной структурой обладают белки, состоящие из нескольких полипептидных цепей, ковалентно не связанных друг с другом. Их называют олигомерными белками. Протомером считается отдельная полипептидная цепь, имеющая три уровня структурной организации, субъединицей – функционально активная часть олигомерного белка. Субъединица может содержать один протомер или несколько протомеров. Четвертичная структура - количество и взаимное расположение субъединиц в олигомерных белках.

В формировании четвертичной структуры участвуют непрочные нековалентные связи (гидрофобные, ионные, водородные). Четвертичная структура белков формируются самопроизвольно, и легко нарушается различными воздействиями. Отдельные субъединицы в олигомером белке влияют друг на друга, что приводит к изменению третичной структуры отдельных протомеров. Это явление называется кооперативными изменениями конформации протомеров и сопровождается изменением биологической активности белка.

. Гемоглобин эритроцитов - олигомерный белок, включает 4 полипептидные цепи. Миоглобин мышц – мономерный белок, включает 1 полипептидную цепь.

4

В целом растворимость белков высока, но различна для разных видов белков. На неё влияют следующие факторы:

• форма белковой молекулы (глобулярные белки растворимы лучше, чем фибриллярные белки);

• характер радикалов аминокислот белка, соотношение полярных и неполярных радикалов (чем больше в составе белка полярных гидрофильных радикалов, тем лучше его растворимость);

• свойства растворителя, присутствие солей. Невысокая концентрация солей (KCL, NaCl) иногда повышает растворимость белков. Например, альбумины лучше растворимы в чистой дистиллированной воде, глобулины растворяются только в присутствии 10% солей (KCL, NaCl). Белки соединительной ткани коллаген и эластин не растворимы ни в воде, ни в солевых растворах.

5

Гликопротеиды

Гликопротеиды содержат, как правило, прочно присоединенные гликозидными связями остатки углеводов (моносахаридов, олигосахаридов). Гликопротеиды обычно имеют мозаичную структуру, в которой чередуются углеводные и белковые фрагменты.

Углеводная часть придаёт специфичность гликопротеидам и определяет их устойчивость к тканевым ферментам. Гликопротеиды широко представлены в организме человека. Они содержатся как в тканях, так и в биологических жидкостях. Муцин слюны содержит в своём составе до 15% маннозы и галактозы. Гликопротеидами являются некоторые гормоны, например, гонадотропины гипофиза. Некоторые транспортные белки крови относятся к гликопротеидам (трансферрин). Гликопротеидом является фактор свёртывания крови фибриноген, Все виды иммуноглобулинов содержат углеводные фрагменты. Углеводы придают специфичность тканевым рецепторам. Адгезивные белки (фибронектин, ламинин), будучи гликопротеидами, обеспечивают взаимодействие клеток, волокон, гликозаминогликанов соединительной ткани

13.