Культивирование
Проблемы, связанные с использованием культур клеток млекопитающих
Проблема №1 – бессмертие клеток
Все клеточные линии, используемые при производстве рекомбинантных белков, являются бессмертными, поскольку процесс получения клеточной линии, стабильно продуцирующей целевой белок с помощью трансгена, занимает 6-9 месяцев. Любая конечная клеточная линия за это время практически исчерпает свой жизненный лимит.
Безопасность продуктов от бессмертных клеточных линий достигается за счёт снижения примесей, в первую очередь, остаточной ДНК.
Бессмертные клеточные линии обладают серьёзными технологическими преимуществами перед первичными и диплоидными клетками.
Регуляторные требования
В досье на препарат необходимо указывать:
Источник клеток
История культивирования
Получение клеточного субстрата
Проблема №2 – вирусная контаминация
акопитающих могут содержать:
полные вирусы с известными механизмами репликации
вирусные частицы, напоминающие ретровирусы
вирусные геномы или части геномов (гепатит В или вирус Эпштейн-Барр)
Регуляторные требования
Кроме полного описания истории получения клеточного субстрата, необходимо также:
Провести обширные испытания на наличие вирусов в клеточном банке
В технологии получения препарата предусмотреть стадии избавления от вирусов, случайно попавших в клеточную культуру на этапе производства
Проблема №3 – микробная контаминация
Микробная контаминация относительно просто детектируется по сравнению с контаминацией вирусной.
Регуляторные требования
Необходимо проводить тестирование банка клеток на наличие:
Бактерий
Грибов
Микоплазмы
В ходе производства и по его окончании проводится постоянный контроль микробного загрязнения.
Проблема №4 – перепутывание клеток
Регуляторные требования
Необходимо проводить тестирование банков клеток на подлинность. Используются такие методы как:
1. Изоферментный анализ
2. Дифференциальное окрашивание хромосом
3. Анализ ДНК для обнаружения геномного полиморфизма
Проблема №5 – нестабильность генома клеток
1.Любая иммортализованная клеточная линия склонна к постоянному и драматичному эффекту изменения генотипа внутри популяции
2. Хромосомы внутри популяции иммортализованных клеток имеют чёткую тенденцию к неравному их количеству в разных клетках и к изменению своей организационной структуры
3. Генетическое разнообразие стимулируется селективными силами
Регуляторные требования
Необходимо создание банков клеток.
Необходимо исследовать стабильность используемых продуцентов:
1. Исследование проводится в двух точках – ранние пассажи и предельный для производства возраст
2. Подтвердить неизменность кодирующей области экспрессионной конструкции
3. Показать, что качество целевого продукта не меняется на разных генерациях
4. Подтвердить, что применяемые условия консервации не влияют на возможность производства продукта
Преимущества клеток млекопитающих перед другими биологическими системами в отношении производства биотехнологических лекарственных средств.
Использование клеток млекопитающих в производстве биотехнологических лекарственных средств обладает рядом значительных преимуществ по сравнению с другими биологическими системами, такими как бактерии, дрожжи или растительные клетки. Вот основные из них:
1. Производство сложных белков и гликопротеинов: Клетки млекопитающих способны синтезировать сложные белки и гликопротеины, которые по своей структуре и функциям наиболее близки к человеческим. Это особенно важно для производства терапевтических белков, таких как гормоны, антитела и факторы роста, которые должны быть биологически активны и безопасны для человека.
2. Высокое сходство с человеческими белками: Белки, произведенные в клетках млекопитающих, имеют большее сходство с белками человека по сравнению с белками, синтезированными другими системами. Это снижает риск иммунного ответа и других побочных эффектов у пациентов.
3. Посттрансляционные модификации: Клетки млекопитающих осуществляют полный спектр посттрансляционных модификаций, включая гликозилирование, фосфорилирование и другие. Эти модификации критически важны для функциональной активности и стабильности многих белков, в том числе антител и факторов роста.
4. Рекомбинантная ДНК технология: В клетках млекопитающих можно эффективно использовать технологию рекомбинантной ДНК для введения и экспрессии человеческих генов. Это позволяет получать терапевтические белки, идентичные природным, что особенно важно для лечения различных заболеваний.
5. Моделирование человеческих заболеваний: Культуры клеток млекопитающих используются для моделирования человеческих заболеваний in vitro, что позволяет проводить исследования и тестирования новых лекарственных средств в условиях, максимально приближенных к человеческим. Это помогает в разработке более эффективных и безопасных терапий.
6. Масштабируемость и стандартизация: Современные методы культивирования клеток млекопитающих позволяют масштабировать производство биотехнологических препаратов до промышленных объемов. При этом обеспечивается высокая степень стандартизации и контроля качества, что важно для массового производства лекарственных средств.
7. Системы доставки и биодоступность: Клетки млекопитающих могут быть использованы для разработки и производства систем доставки лекарств, таких как липосомы и наночастицы, которые улучшают биодоступность и целенаправленную доставку терапевтических агентов в организме.