9. Концентрация co₂
Оптимальный уровень около 5−10%5-10 \%5−10% для клеток млекопитающих. CO₂ участвует в поддержании pH среды и влияет на метаболизм клеток. Избыток CO₂ может вызывать ацидоз.
10. Интенсивность перемешивание
Достаточное перемешивание обеспечивает равномерное распределение кислорода, питательных веществ и удаление CO₂ (иначе недостаток питательных веществ) . Избыточное перемешивание может повредить клетки, особенно хрупкие (например, млекопитающих).
Газовая стратегия в процессе культивирования. Основные задачи подачи газа в биореактор.
Основные цели газовой стратегии:
1. Снабжение клеток кислородом в течение всего процесса
2. Обеспечение клеток углекислым газом (СО2) в начальной фазе процесса
3. Отведение избыточного углекислого газа на высоких клеточных плотностях
Более мелкие пузыри увеличивают эффективность насыщения культуральной жидкости кислородом, однако хуже отводят углекислый газ и более травматичны для клеток.
Барботаж газа в культуральной жидкости вызывает повреждение животных клеток, находящихся в суспензии
(Механизмы повреждения клеток: 1. Схлопывание пузырьков с развитием высоких динамических нагрузок вокруг пузырька 2. Сдвиговые нагрузки в текущей плёнке жидкости внутри пены).
Несмотря на это, биореакторы с барботажем остаются основным типом реакторов из-за высокой эффективности доставки кислорода, особенно в промышленном масштабе.
Повреждение животных клеток при барботаже происходит, в основном, на поверхности жидкости
Повреждение животных клеток при барботаже зависит от природы клеток и размера пузырьков.
Разработка процесса производства рекомбинантных белков. Определение, основные проблемы.
Это разработка продуктивного, масштабируемого, воспроизводимого процесса, дающего продукт требуемого качества
Выбор того, что хотим
Подбор клеток (наиболее крутые CHO (из письки хомяка)-Высокий титр белка (3-10 г/л), Возможность суспензионного культивирования, Эффективный фолдинг белка, Высокий потенциал к модификациям
Подбор сред и условий
Попробовать экспрессировать из плазмиды в клетку в единичном масштабе
Если получилось пересев и наработка биомассы (пассажи)
Далее несколько волновых реакторов (малые реатора)
Дальше большие реактора до 2х тонников
Разработка upstream – основные проблемы
сжатые сроки разработки до трансфера на производство
большая длительность экспериментов
высокая вариабельность биологических систем
неготовность аналитических методов, параллельная разработка
сложность профиля оригинальных молекул
недостаточная координация действий между разработчиками технологии и аналитиками
сложность внесения изменений на поздних этапах проекта
Все клеточные линии, используемые при производстве рекомбинантных белков, являются бессмертными, поскольку процесс получения клеточной линии, стабильно продуцирующей целевой белок с помощью трансгена, занимает 6-9 месяцев. Любая конечная клеточная линия за это время практически исчерпает свой жизненный лимит.
Безопасность продуктов от бессмертных клеточных линий достигается за счёт снижения примесей, в первую очередь, остаточной ДНК.
Разработка процесса производства рекомбинантных белков включает следующие стадии:
Рестриктазное расщепление из организма-донора нужных генов нативной ДНК.
Быстрая расшифровка всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющая определить точные границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую геном.
Обработка рестрикционными эндонуклеазами вектора для клонирования, который может реплицироваться в клетке хозяина.
Сшивка с помощью лигазы двух фрагментов ДНК с образованием новой рекомбинантной молекулы.
Введение данной конструкции в клетку хозяина (реципиента), в которой она реплицируется и передаётся по наследству.
Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК.
Получение специфического белкового продукта, синтезированного клетками хозяина.
Основные проблемы в производстве рекомбинантных белков:
Деградация коротких молекул. Её осуществляют протеолитические ферменты в цитоплазме клетки (экзонуклеазы).
Некорректная укладка белка. Например, при сверхэкспрессии рекомбинантного белка клетки E. coli не всегда обеспечивают правильную укладку белка.
Масштабность получения и очистки рекомбинантных белков. Для получения искомого продукта нужно учитывать и оптимизировать множество параметров.
