Мембраны

Типы лигандов

1. Для аффинной хроматографии:

   • Биологические лиганды: антитела, ферменты, кофакторы (например, белок А или глутатион).

   • Синтетические лиганды: пептиды, аналоги природных молекул.

2. Для ионообменной хроматографии:

   • Катионообменные лиганды: отрицательно заряженные группы (карбоксильные, сульфонатные).

   • Анионообменные лиганды: положительно заряженные группы (амины, четвертичный аммоний).

3. Для хроматографии гидрофобных взаимодействий (HIC):

4. Для обратной фазовой хроматографии (RPC):

   • Гидрофобные углеводородные цепи, такие как C8 или C18.

Типы (модальности) хроматографии:

• Классификация методов на основе свойств компонентов смеси

• Классификация хроматографии по цели проведения

В зависимости от цели проведения хроматографического процесса различают:

• аналитическую хроматографию - качественный и количественный анализ получаемых продуктов (ОКК – отдел контроля качества).

• препаративную хроматографию – разработка ЛС, фундаментальные исследования (отдел разработки, био… лаборатория)

• промышленную – наработка фармбиотехнологического продукта надлежащего качества (производственный отдел).

Cipp-подход в выборе стратегии хроматографической очистки.

Перевод: Захват, Промежуточная очистка, Полировка

CIPP (Capture, Intermediate Purification, Polishing) — это трехэтапная стратегия хроматографической очистки, направленная на последовательное улучшение чистоты биомолекулы.

1. Capture (Захват):

   • Цель: быстро извлечь целевой продукт из сырья, удалив основные примеси.

   • Методы: аффинная хроматография, ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография.

   • Результат: концентрированный продукт с минимальными грубыми загрязнениями.

2. Intermediate Purification (Промежуточная очистка):

   • Цель: удалить специфические примеси, такие как агрегаты и изоформы.

   • Методы: ионообменная хроматография, гель-фильтрация, HIC.

   • Результат: улучшенная чистота продукта.

3. Polishing (Полировка):

   • Цель: финальная очистка для достижения фармацевтического качества.

   • Методы: гель-фильтрация, HILIC, аффинная хроматография.

   • Результат: продукт высокой чистоты, соответствующий требованиям.

18. Фронтальная, вытеснительная и элюентная хроматографии, основные свойства и применение методов.

• Фронтальная хроматография – процедура, в которой образец непрерывно подается на хроматографический сорбент, без дополнительной подвижной фазы.

При этом наименее сорбируемый компонент опережает остальные и выходит в виде зоны чистого вещества раньше всех, а за ним в порядке сорбируемости последовательно располагаются зоны смесей компонентов. То есть только один компонент может быть получен в чистом виде, остальные – не разделяются. Метод удобен для очистки некоторых веществ от примесей, если они сорбируются значительно лучше, чем очищающее вещество. По сути, это фильтрация через сорбент. Используется для определения изотерм сорбции.

• Вытеснительная хроматография -На колонку, заполненную растворителем «E» (связывается с сорбентом слабее чем А и B) наносим пробу (зону) раствора A и B в E. Далее начинаем подавать раствор вытеснителя D. За счёт разницы в силе связывания образуются зоны чистых растворов А и В, разделенные смешанными зонами. Метод не имеет аналитического значения. Может использоваться как препаративный метод, поскольку наиболее полно использует емкость сорбента. Вытеснительный метод отличается от фронтального и проявительного тем, что после введения пробы исследуемой смеси колонку промывают растворителем или газоносителем, к которым добавляют раствор вещества (вытеснитель), обладающего большей сорбируемостью, чем любое из разделяемых веществ.

• По мере продвижения по колонке элюент вытесняет вещество С, которое в свою очередь вытесняет вещество В и т.д. В результате вытесняемая смесь перемещается впереди фронта вытеснителя и скорость движения вещества равна скорости движения вытеснителя. Разделяемые вещества и на колонке, и в элюате располагаются последовательно друг за другом. Каждый из компонентов выделяется в чистом виде, но не количественно, так как зоны компонентов не разделены промежутками чистого сорбента.

• Невозможность получения на выходе из колонки достаточно чистых компонентов разделяемой смеси, а также длительность процесса разделения затрудняют использование этого метода в аналитических целях. Однако для препаративных целей метод не потерял значения, так как возможность применения таких высокоактивных и доступных адсорбентов, как активированные угли, позволяет достигнуть высокой производительности. Достоинством метода является также то, что зоны не размываются в отличие от проявительного анализа.

• Элюентная хроматография – На колонку, заполненную элюентом «Е» (связывается с сорбентом слабее чем А и В) наносим пробу (зону) раствора А и В в Е. Далее начинаем подавать чистый элюент. За счёт разницы в силе связывания образуются зоны чистых растворов А и В, разделенные зонами чистого элюента. Основной аналитический метод. Препаративный метод при работе в области линейной изотермы адсорбции и при небольших перегрузках.

• Основной современный метод! В отличие от предыдущих в этом методе элюирующий раствор обладает немного меньшим сродством к сорбенту, чем любой из компонентов вносимой на колонку или пластинку смеси веществ. Молекул элюента сильно больше, чем аналита, поэтому при его немного большем сродстве все молекулы аналита будут вытеснены с мест связывания => вещество не удерживается! Если сродство сильно меньше – наоборот аналит «засядет» на колонке или старте ТСХ

18. Этапы связывающей хроматографии. Хроматограмма и хроматографический пик. Способы детекции хроматографического сигнала.

Этапы связывающей хроматографии:

1) Equilibration (равновесие): Подготовка неподвижной фазы с помощью буфера для установления оптимальных условий связывания.

2) Sample application (загрузка пробы): Введение пробы в колонку, связывание целевых молекул с неподвижной фазой, элюция несвязавшихся веществ.

3) Column wash (промывка): Удаление несвязанных молекул для повышения чистоты целевого компонента.

4) Elution (элюция): Освобождение связанных молекул путём изменения условий (pH, ионной силы и т. д.).

5) Column wash (промывка): Удаление остатков элюента и восстановление стабильных условий.

6) Re-equilibration (реэквилибрация): Возвращение системы в начальное состояние для последующих циклов.

Хроматограмма и хроматографический пик:

Хроматограмма – график, отображающий зависимость сигнала детектора от времени (или объёма элюента).

Хроматографический пик – отдельная часть хроматограммы, соответствующая выделению одного компонента.

• Высота пика: Пропорциональна концентрации вещества.

• Ширина пика: характеризует разделение веществ (узкий пик = лучшее разделение).

• Площадь пика: Связана с количеством вещества.

Способы детекции хроматографического сигнала:

1) Спектрофотометрия: Измерение поглощения света веществами при фиксированной длине волны (например, 280 нм для белков) или в широком диапазоне (190–700 нм) в mAu (миллиабсорбционные единицы).

2) Кондуктометрия: Измерение электрической проводимости раствора в mSm/cm (миллисименсы на сантиметр).

3) Потенциометрия: Определение уровня pH с использованием потенциометрических датчиков.

4) Рефрактометрия: Измерение изменения показателя преломления света в растворе. Используется внешний рефрактометрический детектор.

5) Флуориметрия: Анализ свечения молекул после возбуждения светом. Применяется для высокой аналитической точности.

6) Масс-спектрометрия: Определение массы и структуры молекул. Используется для сложных смесей, требует внешнего детектора.

18. Понятия «разрешение» и «теоретическая тарелка» в хроматографии. Составляющие колоночного объема в хроматографии. Способы повышения разрешения в хроматографии.

Понятия «разрешение» и «теоретическая тарелка» в хроматографии:

Разрешение характеризует способность колонки разделять компоненты. Оно зависит от: Селективности: Расстояние между максимумами пиков. Эффективности: Узость и симметричность пиков.

где t1, t2​ — время выхода компонентов, Wb1, Wb2 ​ — ширина пиков на базе.

Современные программы рассчитывают значение разрешения не по ширине пиков у основания, а по ширине на половине высоты. Поправочный коэффициент 1.18 в числителе

Факторы, влияющие на разрешение:

• Диаметр частиц сорбента (меньший диаметр — лучшее разрешение).

• Высота слоя сорбента (чем выше, тем лучше разделение).

• Скорость потока (оптимальная скорость улучшает разделение).

• Длительность градиента (более плавный градиент повышает разрешение).

Теоретическая тарелка - гипотетическая зона, где устанавливается равновесие между подвижной и неподвижной фазами. Чем больше теоретических тарелок в колонке, тем эффективнее разделение.

Формула для расчёта числа теоретических тарелок:

где tr— время удерживания вещества, Wb ​ — ширина пика на базе.

Составляющие колоночного объема в хроматографии:

Общий объём колонки (Vc​) включает:

Vo​ — свободный объём (между частицами сорбента, подвижная фаза).

Vi — объём пор (заполнен растворителем, неподвижная фаза).

Vd — объём матрицы сорбента без учёта пор (не участвует в хроматографии).

Полный объём растворителя (Vt​):

Способы повышения разрешения в хроматографии:

1) Использование сорбентов с меньшим диаметром частиц.

2) Увеличение высоты слоя сорбента (bed height).

3) Оптимизация скорости потока (избегать слишком высоких скоростей).

4) Применение более плавного градиента при градиентной хроматографии.

5) Улучшение условий селективности (изменение pH, ионной силы).

18. Объемная скорость потока, линейная скорость процесса, время контакта. Упаковка хроматографических колонн. Тестирование эффективности упаковки: фактор асимметрии As и приведенная высота теоретической тарелки h.

Объемная скорость потока, линейная скорость процесса, время контакта:

Объемная скорость потока (Q): Объём подвижной фазы, проходящий через колонку за единицу времени, измеряется в мл/мин.

Q — объемная скорость потока (мл/мин),

v — линейная скорость потока (см/ч),

S — площадь поперечного сечения колонки (S=πr², где r— радиус колонки, см).

Линейная скорость (v): Расстояние, которое проходит подвижная фаза в единицу времени. Рассчитывается по формуле:

Время контакта (t): Время взаимодействия молекулы с неподвижной фазой. Рассчитывается по формуле:

где h — высота слоя сорбента (см), v — линейная скорость (см/ч).

Упаковка хроматографических колонн:

Цель упаковки — равномерное распределение сорбента в колонке для обеспечения эффективного разделения.

Формула расчёта объёма суспензии (Vslurry):

V_packed​ — целевой финальный объём упакованной колонки (мл).

F — коэффициент компрессии из спецификации сорбента (значение > 1, например, 1,15).

C — концентрация сорбента в суспензии (отношение высоты осевшего слоя сорбента h_slurry ​ к общей высоте слоя h_общая​).

Тестирование эффективности упаковки: фактор асимметрии As и приведенная высота теоретической тарелки h:

Фактор асимметрии (As): Оценивает отклонение пика от идеальной Гауссовой формы. Рассчитывается как:

b — ширина пика справа от его максимума на 10% высоты.

a — ширина пика слева от его максимума на 10% высоты. Норма для лабораторных колонок: 0,8 ≤ As ≤ 1,5

Приведённая высота теоретической тарелки (h):

Показывает эффективность разделения. Рассчитывается по формуле:

HETP=N/L​ - (Приведённая высота теоретической тарелки, где L — длина колонки (см), N — число теоретических тарелок (определяется по форме пика)),

L — длина колонки, NNN — число теоретических тарелок,

dp— диаметр частиц сорбента.

Альтернативная формула через ширину пика:

Wh​ — ширина пика на половине высоты,

Vr— объём удерживания. Норма: h ≤ 3h

18. Эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация). Основные характеристики метода. Порядок выхода компонентов смеси при эксклюзивной хроматографии. Варианты применения метода в сфере биотехнологий.

Эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация). Основные характеристики метода:

Принцип действия:

• Разделение молекул происходит на основе их размера и формы.

• Используются сорбенты с определённой пористостью.

• Молекулы не взаимодействуют с сорбентом (только механическое разделение).

• Мелкие молекулы проникают в поры сорбента и движутся медленнее.

• Крупные молекулы не проникают в поры и элюируются быстрее.

Условия разделения:

1) Элюирование изократическое (без изменения состава подвижной фазы).

2) Состав буфера практически не влияет на разрешение.

3) Образец разбавляется в процессе.

Сорбенты: твердые пористые полимеры, модифицированные силикагели, стекла.

• Элюенты – любые растворители.

• Сорбент не должен взаимодействовать с веществом.

• Заканчивается там, где начинаются другие виды хроматографии.

• Низкая пиковая емкость.

• Желательно увеличение длины колонок.

Ограничения: низкая загрузка образца на цикл: рекомендуется 1–2% от объёма колонки (ОК).

Порядок выхода компонентов смеси при эксклюзивной хроматографии:

1) Крупные молекулы выходят первыми, так как не задерживаются в порах сорбента.

2) Средние молекулы частично задерживаются в пористом материале.

3) Мелкие молекулы задерживаются больше всего и выходят последними.

Варианты применения метода в сфере биотехнологий:

1) Определение молекулярной массы: анализ размеров белков, нуклеиновых кислот и других биополимеров.

2) Очистка белков и биопрепаратов: удаление мелких примесей. Разделение смеси биомолекул по размеру.

3) Замена буфера: используется для подготовки препаратов к следующему этапу анализа или очистки.

4) Контроль качества препаратов: анализ агрегатов и фрагментов моноклональных антител (mAb).

5) Анализ нелетучих веществ: определение чистоты препаратов

18. Аффинная хроматография. Свойства метода и его основные характеристики. Аффинные лиганды для связывания антител IgG из препаратов млекопитающих. Различие сродства к видовым вариантам.

Аффинная хроматография. Свойства метода и его основные характеристики:

Аффинная хроматография (AC) — метод, основанный на специфическом обратимом взаимодействии между целевой молекулой (анализируемым веществом) и лигандом, иммобилизированным на сорбенте. Взаимодействие бывает:

• Биоспецифическим (например, Protein A – антитело).

• Небиоспецифическим (например, металл-аффинное взаимодействие: Ni²⁺ – His-tag).

Основные этапы процесса:

• Нанесение образца.

• Связывание целевого белка с лигандом (молекулы, обладающие сродством к лиганду, задерживаются на сорбенте). Носитель: инертный пористый материал (агароза, полиакриламид, кросс-сшитый декстран, стеклянные шарики), к которому ковалентно через спейсер присоединен лиганд.

• Отмывка несвязанных примесей.

• Элюирование связанного белка (целевые молекулы высвобождаются путем изменения условий среды (pH, ионная сила) или введения конкурентного лиганда).

• Регенерация (восстановление сорбента для дальнейшего использования).

Характеристики метода:

• Высокая специфичность и разрешающая способность.

• Ограниченная емкость, но высокая эффективность концентрирования во время элюции.

• Возможность проводить мягкую элюцию, сохраняющую активность белков.

• Применение в качестве первой стадии при очистке сложных биомолекул (Capture Step).

• Одностадийная очистка для тегированных белков.

Аффинные лиганды для связывания антител IgG из препаратов млекопитающих. Различие сродства к видовым вариантам:

Белок A и белок G являются бактериальными белками бактерий Staphylococcus Aureus и Streptococcus соответственно. В сочетании с сефарозной матрицей, белок A и белок G создают полезные и простые в использовании аффинные хроматографические сорбенты для высокоэффективной очистки антител

Protein A: Связывает Fc-фрагменты IgG антител большинства млекопитающих, особенно IgG1 и IgG2 у человека. Обладает видоспецифичным сродством: эффективен для антител млекопитающих.

Protein G: Широкий спектр связывания антител, включая IgG из различных видов. Эффективнее связывает антитела животных (например, у мышей и коров).

Protein L: Взаимодействует с легкими цепи антител (например, λ-цепями), подходит для фрагментов и биспецифических антител.

Protein A и Protein G имеют различное сродство к антителам разных видов и подтипов, что нужно учитывать при выборе сорбента.

18. Подходы к оптимизации стадии аффинной хроматографии. Pcc - Periodic Counter Current (continuous) chromatography. Сорбенты на основе матрицы Fibro, их основные преимущества.

Подходы к оптимизации стадии аффинной хроматографии:

Для повышения эффективности процесса используют:

• Сокращение времени контакта между образцом и сорбентом.

• Многократное использование сорбентов с высокой устойчивостью к химической регенерации (например, щелочной).

• Увеличение скорости процесса с применением инновационных матриц (например, Fibro).

PCC - Periodic Counter Current (continuous) chromatography:

Метод позволяет проводить хроматографию в непрерывном режиме.

Принципы:

• Использование нескольких колонок, работающих попеременно.

• Обеспечение высокой загрузки образца и минимизации потерь продукта.

• Повышение производительности и экономии сорбента.

Сорбенты на основе матрицы Fibro, их основные преимущества:

Матрицы Fibro представляют собой инновационные сорбенты, обеспечивающие:

• Уменьшение времени контакта с образцом.

• Высокую производительность благодаря увеличенной поверхности связывания.

• Повышенную устойчивость к химической обработке.

• Могут быть однаразовыми

• Fibro-сорбенты могут быть функционализированы для различных типов хроматографии:

• Матрицы Fibro работают при низких давлениях, что уменьшает нагрузку на оборудование и снижает энергозатраты.

18. Металл-аффинная хроматография: объекты для очистки, принцип элюции. Аффинный сорбент Capto avb для очистки аденоассоциированных вирусов; его сродство к различным серотипам.

Металл-аффинная хроматография: объекты для очистки, принцип элюции:

Металл-аффинная хроматография (IMAC) Частный случай аффинной хроматографии, где используется взаимодействие белков с гистидиновыми тегами (His-tag) и ионами металлов (Ni²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺).

Принципы:

1. Связывание белка с сорбентом происходит за счет координационных связей между His-tag (глитаги, глистики))и ионами металлов.

2. Элюция осуществляется увеличением концентрации имидазола, который вытесняет белок с сорбента. Метод применяется для очистки рекомбинантных белков из клеточных лизатов.

Аффинный сорбент Capto AVB для очистки аденоассоциированных вирусов; его сродство к различным серотипам:

Сорбент Capto AVB для очистки AAV Capto AVB — специализированный аффинный сорбент для выделения аденоассоциированных вирусов (AAV): Сорбент Capto AVB содержит специально разработанный синтетический аффинный лиганд, который избирательно связывается с капсидными белками AAV.

Высокая специфичность к различным серотипам AAV (AAV2, AAV5, AAV8). Эффективное связывание вирусных частиц. Простота в использовании и регенерации сорбента.

Применение Capto AVB: Очистка AAV проводится по схеме:

• Лизис клеток.

• Очистка лизата.

• Концентрация и буферный обмен.

• Захват AAV на Capto AVB.

• Полировка и стерильная фильтрация.

18. Ионообменная хроматография. Принцип метода и основные характеристики. Понятие сильных и слабых ионообменных лигандов. Сорбенты ImpAct и ImpRes для ионообменной хроматографии, их преимущества.

Ионообменная хроматография. Принцип метода и основные характеристики:

Принцип метода: Ионообменная хроматография (IEX) основана на обратимом взаимодействии заряженных молекул (например, белков) с противоположно заряженными лигандами, связанными с хроматографической матрицей (анионообменники или катионообменники). Этапы:

1. Нанесение образца (в слабом буфере).

2. Связывание молекул с неподвижной фазой.

3. Отмывка несвязавшихся веществ.

4. Элюция (при увеличении ионной силы или изменении pH).

5. Регенерация сорбента.

Понятие сильных и слабых ионообменных лигандов:

Сильные лиганды (например, SP, S, Q) сохраняют заряд в широком диапазоне pH (2–12).

Слабые лиганды (например, DEAE, CM) меняют заряд в более узком диапазоне pH.

Сорбенты ImpAct и ImpRes для ионообменной хроматографии, их преимущества:

Capto ImpAct: высокая динамическая сорбционная ёмкость (DBC), подходит для больших объемных нагрузок, для работы в колонках высокого давления .

Capto ImpRes: улучшенное разрешение, благодаря меньшему размеру частиц и оптимизированной структуре матрицы, для использования в колонках низкого и среднего давления.

18. Понятие изоэлектрической точки белка, способы ее определения. Зависимость заряда белка от рН буферного раствора. Порядок элюции компонентов смеси с разными pI при ионообменной хроматографии, и при хроматофокусировке.

Понятие изоэлектрической точки белка, способы ее определения:

Изоэлектрическая точка (pI) – это значение pH, при котором суммарный заряд белка равен нулю.

Определение pI:

1. Теоретически: рассчитывается по аминокислотному составу.

2. Экспериментально: методом изоэлектрофокусирования.

Зависимость заряда белка от рН буферного раствора:

При pH < pI белок заряжен положительно.

При pH > pI белок заряжен отрицательно.

Порядок элюции компонентов смеси с разными pI при ионообменной хроматографии, и при хроматофокусировке:

Элюция при IEX: Молекулы связываются с неподвижной фазой (анионообменником или катионообменником) благодаря противоположным зарядам. В градиенте соли: компоненты элюируются по мере увеличения концентрации соли. Первым элюируется компонент, чей pI ближе к pH буфера. Порядок элюции в градиенте соли: Первой элюируется молекула, чья изоэлектрическая точка (pI) ближе к pH буфера (так как её взаимодействие с сорбентом слабее, а сродство с элюентом больше). Например: если pH буфера = 5, а pI белков — 4, 5.5, 7, то первым элюируется белок с pI = 4.

Элюция при хроматофокусировке: Молекулы белка мигрируют через колонку, где постепенно изменяется pH буфера. Белок элюируется, когда pH достигает его изоэлектрической точки (pI), то есть когда заряд молекулы становится равным нулю, и она перестаёт взаимодействовать с сорбентом. В градиенте pH: молекулы элюируются при pH, соответствующем их pI. Пример: Aspartate (pI 2,77), Threonine (pI 5,60), Histidine (pI 7,59) элюируются при соответствующих pH.

Пример:

Начальный pH буфера = 2 (кислый). Все белки заряжены положительно и связываются с катионообменником.

По мере увеличения pH: Белки с низким pI (например, Aspartate, pI = 2.77) теряют заряд первыми и элюируются. Затем элюируются белки с более высоким pI (например, Threonine, pI = 5.60). Последним элюируется белок с самым высоким pI (например, Histidine, pI = 7.59).

Сравнение: IEX: управляется градиентом соли, подходит для очистки больших объёмов. Хроматофокусировка: управляется градиентом pH, используется для тонкого разделения белков с близкими pI.

18. Хроматография гидрофобных взаимодействий. Принцип метода и его основные характеристики. Этапы процесса и режимы элюции при хроматографии гидрофобных взаимодействий. Применение гидрофобной хроматографии в биотехнологическом производстве.

Хроматография гидрофобных взаимодействий. Принцип метода и его основные характеристики:

Основа метода: Белки связываются с гидрофобными лигандами на поверхности сорбента за счёт гидрофобных взаимодействий. В растворе с высокой концентрацией соли белки разворачиваются, выставляя наружу гидрофобные группы, которые взаимодействуют с сорбентом. В растворе с низкой концентрацией соли белки возвращаются в компактное состояние, что снижает взаимодействие с сорбентом, и они элюируются.

Гидрофобность белков: Связана с наличием гидрофобных остатков аминокислот (например, фенилаланина, лейцина, изолейцина). Чем больше гидрофобных остатков, тем сильнее белок связывается с сорбентом.

Сорбенты: Используются сорбенты с иммобилизованными гидрофобными группами (например, Capto Phenyl, Phenyl Sepharose 6 FF). Динамическая ёмкость сорбента зависит от скорости потока, концентрации соли и свойств белков.

Этапы процесса и режимы элюции при хроматографии гидрофобных взаимодействий:

1) Подготовка колонки (Equilibration): Используют буфер с высокой концентрацией соли (например, 1.2 M (NH₄)₂SO₄). Буфер создаёт условия для максимального связывания белков.

2) Загрузка образца: Образец предварительно обрабатывают солевым буфером для повышения гидрофобного взаимодействия белков. Подходит для работы после ионообменной хроматографии, так как там уже используется высокосолевой буфер.

3) Связывание: Гидрофобные группы белков взаимодействуют с сорбентом, закрепляясь на нём.

4) Элюция: Постепенно снижают концентрацию соли в буфере (обратный градиент). Наименее гидрофобные белки элюируются первыми, а самые гидрофобные — последними. В буфер могут добавлять органические компоненты (например, этиленгликоль) для усиления элюции.

5) Промывка (Salt-free wash): Удаляются остатки соли и слабосвязанные примеси.

6) Повторное уравновешивание (Re-equilibration): Колонку подготавливают к повторному использованию.

Применение гидрофобной хроматографии в биотехнологическом производстве:

Очистка моноклональных антител (mAb): Удаление агрегатов, высокомолекулярных примесей. Применяется на полировочной стадии очистки.

Выделение плазмидной ДНК: Используют сорбенты Capto PlasmidSelect и PlasmidSelect Xtra. Этап входит в технологический процесс после щелочного лизиса клеток, ультрафильтрации и ионообменной хроматографии.

Работа с вирусами: Производство и модификация аденоассоциированных вирусов (AAV).

Оптимизация процесса: Применение Capto-смол позволяет повысить продуктивность за счёт высокой скорости загрузки и элюции, сохраняя динамическую ёмкость сорбента.

18. Мультимодальная хроматография. Принцип метода, сорбенты Capto mmc и Capto AdHere для мм хроматографии. Сорбенты Capto и Capto ImpRes. Режимы элюции и особенности метода.

Мультимодальная хроматография (ММ-хроматография) — это метод очистки белков и биомолекул, основанный на сочетании двух и более типов взаимодействий благодаря лигандам различного типа, закрепленным на одном сорбенте. Этот подход отличается от традиционных методов хроматографии, таких как аффинная, ионообменная или гидрофобная, за счет более широкой селективности и способности решать сложные задачи очистки.

Принцип метода:

• ММ-хроматография использует взаимодействия разного типа: ионные, гидрофобные и эксклюзионные.

• Лиганды, закрепленные на сорбенте, могут связываться с целевой молекулой белка через несколько типов взаимодействий одновременно.

• Метод применяется как в режиме связывания/элюции целевого продукта (Bind-Elute), так и в режиме протока (Flow-Through), где связываются примеси.

• Позволяет оптимизировать процесс очистки (одна стадия вместо двух), но требует аккуратного подбора условий как при нанесении, так и при элюции образца.

Основные сорбент

Capto MMC:

• Это мультимодальный сорбент, который сочетает свойства катионообменника и гидрофобного сорбента.

• Устойчив к высоким концентрациям соли, что делает возможным очистку в условиях высокой ионной силы.

• Применяется для полировочной стадии очистки моноклональных антител (mAb), удаления агрегатов и вирусов.

Capto ImpRes:

• Это вариант Capto MMC, который отличается гранулами меньшего размера.

• Благодаря этому повышается разрешение (разделение пиков), что особенно важно для полировочных стадий очистки.

• Основные свойства те же, что и у Capto MMC: катионообмен + гидрофобность.

• Сохраняет высокую селективность и производительность при полировке антител и фрагментов.

Capto Adhere:

• Это мультимодальный сорбент, сочетающий свойства анионообменника и гидрофобного сорбента.

• Эффективен в режиме протока для очистки высокомолекулярных примесей (HMW, агрегатов) или в режиме связывания/элюции для низкомолекулярных продуктов (LMW).

• Работает в широком диапазоне pH и электропроводности.

Capto Adhere ImpRes:

• Это вариант Capto Adhere с гранулами малого размера, обеспечивающий более высокое разрешение.

• Основные свойства такие же, как у Capto Adhere: анионообмен + гидрофобность.

• Высокая производительность и устойчивость к очистке щелочными растворами (до 1 М NaOH).

Режимы элюции:

• Bind-Elute: Целевая молекула связывается с сорбентом, а затем элюируется при изменении условий (например, pH или состава буфера).

• Flow-Through: Примеси связываются с сорбентом, а целевой продукт остается в потоке.

18. Подход Design of Experiment: построение оптимизированной схемы процесса. Факторы, отклики, трансферная функция. Применение Design of Experiment при работе с мультимодальными сорбентами.

Метод Design of Experiments (DOE), или планирование эксперимента, представляет собой структурированный статистический подход, направленный на оптимизацию процессов путем определения влияния различных факторов и их взаимодействий. Применение DOE при работе с мультимодальными сорбентами позволяет эффективно подобрать условия для достижения оптимальных результатов очистки.

Основные понятия метода DOE:

Факторы (Factors):

• Это переменные, которые управляют процессом.

• Примеры: pH, температура, проводимость, концентрация соли, тип буфера.

• Факторы бывают:

  • Числовыми (например, pH, температура);

  • Категориальными (например, тип сорбента или режима хроматографии).

Отклики (Responses):

• Это параметры, измеряемые в результате эксперимента.

• Примеры: эффективность очистки, степень связывания целевой молекулы, разрешение пиков, выход продукта.

Трансферная функция (Transfer Function):

Это математическая модель, описывающая зависимость откликов от факторов.

Пример: где Y — отклик, x1​ и x2​ — факторы, а коэффициенты b отражают влияние факторов и их взаимодействий.

Графики откликов (Response Surface Plots)

• Визуализируют влияние 2-4 факторов на отклик.

• Используются для выявления оптимальных условий и анализа взаимодействий между факторами.

Применение DOE при работе с мультимодальными сорбентами:

Оптимизация условий связывания и элюции:

• Поскольку изоэлектрическая точка (pI) белка не всегда подходит для выбора pH, проводят скрининг.

• Основные факторы: pH и проводимость.

Скрининг факторов: Для первоначального выявления ключевых факторов используются микропланшеты или миниколонки, чтобы протестировать большое количество условий.

Оптимизация параметров процесса:

• Использование DOE помогает подобрать такие условия, при которых обеспечиваются:

  • Максимальная селективность сорбента (например, Capto MMC или Adhere);

  • Эффективное удаление примесей;

  • Высокий выход продукта.

Режимы работы мультимодальных сорбентов: DOE помогает определить, в каком режиме (связывания/элюции или протока) сорбент будет наиболее эффективным для конкретной задачи.

Экономия времени и ресурсов: Благодаря возможности варьировать несколько факторов одновременно, DOE позволяет быстрее достичь оптимальных условий.

Пример применения:

При работе с сорбентом Capto Adhere для очистки антител методом DOE можно:

• Определить оптимальный pH для связывания примесей в режиме протока (Flow-Through mode);

• Найти подходящую концентрацию соли, чтобы минимизировать связывание целевого продукта.

Поскольку изоэлектрическая точка (pI) белка, как правило, не является хорошим индикатором для выбора правильного pH для связывания и элюирования с помощью мультимодальной смолы, скрининг условий имеет первостепенное значение. Это можно выполнить с помощью высокопроизводительных форматов, таких как микропланшеты или миниколонки. Экспериментальная установка для скрининговых исследований должна быть выполнена с использованием DoE, а наиболее часто проверяемыми факторами являются pH и проводимость.

18. Мультимодальная хроматография на сорбентах Capto Core. Назначение и особенности применения данных сорбентов. Определение оптимального объема загрузки очищаемого материала для сорбентов Capto Core.

Назначение сорбентов Capto Core:

Capto Core 400 и Capto Core 700 разработаны для:

• Очистки адено-ассоциированных вирусов (AAV), аденовирусов (AV) и крупных биомолекул, таких как вирусоподобные частицы (VLP) и экзосомы.

• Удаления примесей, таких как остаточные белки, ДНК и мелкие молекулы, в режиме протока (Flow-Through Mode).

Особенности структуры и механизма действия: Структура сорбента:

• Неактивная пористая оболочка:

  • Выполняет функцию гель-фильтрации, исключая крупные биомолекулы из проникновения в ядро.

  • Целевой продукт (вирусы или крупные биомолекулы) остается в протоке.

• Активированное ядро:

• Содержит мультимодальный лиганд, связывающий примеси, такие как остаточные белки и ДНК.

• Малые примеси проникают в оболочку и захватываются ядром.

Capto Core 400 и 700:

• Capto Core 400: предназначен для очистки адено-ассоциированных вирусов (AAV).

• Capto Core 700: используется для очистки более крупных аденовирусов (AV).

Преимущества Capto Core:

• Высокая нагрузочная способность по сравнению с гель-фильтрацией:

  • Гель-фильтрация ограничена объемом загрузки (0,1–0,3 объемов колонки, CV).

  • Capto Core позволяет загрузить до 30 CV материала (для аденовирусов), что значительно повышает производительность процесса.

• Комбинированная технология: сочетание преимуществ гель-фильтрации и мультимодальной хроматографии для более эффективного удаления примесей.

Определение оптимального объема загрузки очищаемого материала:

• Зависимость от типа целевого продукта:

  • Для аденовирусов (Capto Core 700): объем загрузки может достигать 30 CV, обеспечивая эффективное удаление примесей.

  • Для меньших молекул (AAV, Capto Core 400): объем загрузки может варьироваться в зависимости от концентрации примесей.

• Тестирование:

• Для определения оптимального объема загрузки рекомендуется проводить скрининговые эксперименты, включая тесты загрузки с увеличением объема, чтобы оценить удерживающую способность сорбента и эффективность удаления примесей.

• Параметры для мониторинга:

• Концентрация примесей в элюате.

• Чистота и сохранность целевого продукта в протоке.

18. Обращенно-фазовая хроматография, основные характеристики. Применение органических растворителей и ион-парных агентов при проведении обращенно-фазовой хроматографии. Сорбенты SOURCE 15 и SOURCE 30 RPC, их свойства.

Основные характеристики обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ): Принцип работы:

• Основан на гидрофобных взаимодействиях между молекулами вещества и неполярной поверхностью сорбента.

• Неподвижная фаза сорбентов состоит из углеродных цепей (например, C18), что делает ее гидрофобной.

Процесс элюирования:

• Выполняется в градиенте органических растворителей с уменьшением полярности элюента(вода-ацетонитрил, ацетонитрила к концу больше).

• Более полярные компоненты элюируются первыми.

Назначение: Используется для разделения пептидов, белков, олигонуклеотидов и других биомолекул на финальных этапах очистки (полировка) или для аналитических целей.

Применение органических растворителей в ОФХ:

Цель: Уменьшение полярности подвижной фазы для элюирования молекул с сорбента.

Наиболее используемые растворители:

• Ацетонитрил, метанол, тетрагидрофуран, этанол, изопропанол.

• Обязательное условие – смешиваемость растворителей с водой.

Режимы работы:

• Изократический режим: постоянное соотношение вода-растворитель.

• Градиентный режим: постепенное увеличение концентрации органического растворителя.

Применение ион-парных агентов в ОФХ : Ион-парный агент — это поверхностно-активное вещество, которое может образовывать ионные пары с аналитом.

• Назначение:

  • Увеличение гидрофобности заряженных молекул для улучшения их связывания с неподвижной фазой.

  • Создание нейтральных ионных пар для разделения полярных соединений.

• Основные агенты:

• Для кислотных соединений: соединения тетраалкиламмония.

• Для оснований: алкилсульфонаты и сульфоаминовые кислоты.

• Примеры: трифторуксусная кислота (TFA) для белков и пептидов, триэтаноламин для отрицательно заряженных молекул.

Сорбенты SOURCE 15 и SOURCE 30 RPC:

Общие характеристики:

• Материал: жесткий полистирол/дивинилбензол.

• Диаметр частиц: 15 мкм (SOURCE 15RPC) и 30 мкм (SOURCE 30RPC).

• Диапазон pH: 2–12, устойчивая работа при экстремальных значениях.

• Высокая химическая и физическая стабильность.

• Отличная масштабируемость и воспроизводимость.

• Низкое противодавление, высокая скорость потока.

Применение:

• SOURCE 15RPC:

  • Высокое разрешение для белков, пептидов и олигонуклеотидов.

  • Подходит для аналитической работы и полировки в лабораторных процессах.

  • Скорость потока: до 1800 см³/ч.

• SOURCE 30RPC:

• Для крупных молекул, этапов полировки в промышленных масштабах.

• Высокие скорости потока, низкое противодавление.

Преимущества перед сорбентами на основе кремния:

• Более высокая емкость и устойчивость к условиям высокого pH.

• Возможность работы в широком диапазоне условий.

Основные области применения:

• Пептидное картирование.

• Разделение белков, меченых олигонуклеотидов и других биомолекул.

• Очистка и аналитическое разделение в фармацевтических и биотехнологических процессах.

18. Понятие масштабирования при разработке технологии хроматографической очистки. Экстенсивный и интенсивный классический подходы к масштабированию. Плюсы и минусы классического интенсивного подхода.

Масштабирование

— это процесс перехода от лабораторных экспериментов к промышленным масштабам производства.

Целью масштабирования является увеличение объема серии и производства при сохранении удельной производительности процесса и качества продукта.

При разработке в технологию необходимо изначально закладывать такие качества процесса, как технологичность (manufacturability) и масштабируемость (scalability).

1. Экстенсивный подход

Экстенсивное масштабирование предполагает простое увеличение размеров хроматографической колонки и объема сорбента пропорционально увеличению объема обрабатываемого материала. Ключевые параметры, такие как линейная скорость потока, время контакта, и свойства сорбента, остаются неизменными.

• Преимущества:

  • Простота реализации: параметры процесса остаются неизменными.

  • Минимальные изменения в оборудовании и настройке.

• Недостатки:

  • Увеличение объемов сорбента приводит к значительному росту затрат.

  • Ограниченная масштабируемость из-за физических ограничений (например, давление в колонке).

  • Требует значительного пространства на производстве.

2. Интенсивный подход

Интенсивное масштабирование основано на увеличении производительности за счет оптимизации условий процесса. Это может включать увеличение линейной скорости потока, уменьшение времени контакта, изменение параметров сорбента или использование новых технологий.

• Преимущества:

  • Уменьшение объема сорбента и затрат на оборудование.

  • Сокращение времени на обработку больших объемов.

  • Повышение производительности за счет использования современных высокоэффективных материалов и технологий.

• Недостатки:

  • Сложность в настройке параметров, что требует дополнительных экспериментов и моделирования.

  • Риск ухудшения разделения или снижения эффективности очистки при неправильной настройке.

  • Высокие первоначальные затраты на разработку и тестирование.

Плюсы и минусы классического интенсивного подхода к масштабированию

Плюсы:

1. Экономия ресурсов: меньший объем сорбента и буферов снижает эксплуатационные затраты.

2. Ускорение процесса: высокая линейная скорость позволяет значительно сократить общее время очистки.

3. Оптимизация оборудования: возможность использования колонок меньших размеров, что экономит пространство на производстве.

4. Гибкость: подход позволяет адаптироваться к изменениям производственных требований.

Минусы:

1. Сложность в реализации: требуется тщательная проработка и оптимизация параметров.

2. Риски снижения качества: при высокой скорости потока может ухудшиться разделение компонентов.

3. Высокая стоимость разработки: необходимость дополнительных экспериментов, моделирования и тестирования.

4. Ограничения оборудования: не все системы способны поддерживать высокие скорости потока без потерь эффективности.

18. Подходы к масштабированию - интенсивный подход при сохранении cv/час. Плюсы и минусы, применимость данного подхода.

Сохранение линейной скорости + высоты слоя+ качества упаковки колонны

Под теоретической тарелкой понимается условный участок колонки, в пределах которого устанавливается равновесие частиц хроматографируемого вещества между подвижной и неподвижной фазами. Движение вещества вдоль колонки можно представить как последовательный его перенос с одной теоретической тарелки на другую.

Интенсивный подход к масштабированию: сохранение линейной скорости, высоты слоя, качества упаковки и CV/час

При данном подходе процесс масштабирования хроматографической очистки подразумевает увеличение объема колонки при сохранении следующих ключевых параметров:

1. Линейной скорости потока: скорость движения жидкости через колонку (см/ч).

2. Высоты слоя сорбента: высота слоя остается неизменной, что поддерживает одинаковое время контакта и эффективность разделения.

3. Качества упаковки: обеспечивается равномерность распределения сорбента в колонке, что минимизирует эффект каналирования и неравномерного потока.

4. Производительности (CV/час): объем колонны обрабатывается за то же время, что и в лабораторных условиях.

Подходы к реализации

1. Сохранение геометрического подобия Диаметр колонки увеличивается пропорционально увеличению общего объема, при этом высота слоя остается неизменной. Это поддерживает одинаковую гидродинамику и распределение потока.

2. Оптимизация гидродинамических параметров Линейная скорость и время контакта жидкости с сорбентом остаются неизменными. Для этого требуется оборудование, обеспечивающее стабильное давление и равномерный поток.

3. Контроль качества упаковки сорбента На этапе упаковки колонны применяются процедуры, предотвращающие образование пустот или неравномерного распределения сорбента.

Преимущества подхода

1. Сохранение качества разделения Постоянная высота слоя и линейная скорость потока обеспечивают стабильное время контакта, что минимизирует риски ухудшения качества очистки.

2. Унификация параметров Лабораторные параметры легко масштабируются на промышленный уровень, что упрощает валидацию и серийное производство.

3. Стабильность гидродинамики Равномерное распределение жидкости предотвращает образование зон застойного потока или каналирования.

4. Экономия времени Подход позволяет обрабатывать большие объемы материала за то же время, что и на лабораторном уровне.

5. Гибкость применения Подходит для масштабирования как готовых технологий, так и процессов, находящихся на стадии оптимизации.

Недостатки подхода

1. Ограничения оборудования Большие колонки требуют систем, способных выдерживать повышенное давление, возникающее при сохранении линейной скорости на крупных масштабах.

2. Требования к сорбенту Используемые сорбенты должны быть механически прочными, чтобы выдерживать нагрузку и сохранять эффективность на больших объемах.

3. Сложность упаковки колонны Обеспечение равномерного распределения сорбента в масштабных колонках требует высокой точности в настройке процесса упаковки, что может быть трудоемким и дорогим.

4. Риски увеличения давления Увеличение диаметра колонки и сохранение линейной скорости могут привести к увеличению давления на входе, что может ограничить масштабируемость.

5. Затраты на разработку и тестирование Требуется дополнительное моделирование и эксперименты для проверки стабильности процесса на разных масштабах.

18. Дополнительные параметры, сохраняемые при масштабировании хроматографической очистки. Подводные камни и типичные ошибки масштабирования хроматографии.

Дополнительные параметры: 1) Подготовка стартового материала: обеспечение стабильного качества исходного сырья.

2) Концентрация целевого продукта в стартовом материале: контроль допустимых диапазонов для предотвращения снижения эффективности.

3) Нагрузка на сорбент: оптимизация загрузки с учетом емкости сорбента и характеристик целевого продукта.

4) Состав растворов и условия стадии: сохранение буферного состава, pH, температуры и других параметров.

5) Схема фракционирования: определение фракций с целевым продуктом и примесями.

6) Регенерация и санация сорбента: поддержание функциональности сорбента, минимизация утечки лиганда, особенно в случае белков (например, белок А).

Подводные камни и типичные ошибки:

1) Нереалистичный процесс разработки:

• Использование сорбентов с избыточной высотой или объемом, непропорциональных производственным возможностям.

• Превышение реальных скоростей потока или объемов буферов.

2) Проблемы упаковки колонн большого диаметра: сложности в равномерной укладке сорбента.

3) Однородность партий сорбента: вариации между сериями могут влиять на результаты.

4) Дрейф температуры: колебания температуры буферов и промежуточных продуктов, влияющие на стабильность и эффективность процесса.

5) Хранение промежуточных продуктов:

• Снижение стабильности при длительном хранении.

• Проблемы с переработкой больших объемов в ограниченное время.

6) Мертвые объемы системы: нежелательное влияние на выход целевого продукта.

7) Однородность перемешивания: критически важно на финальных стадиях для обеспечения стабильности продукта.

8) Фотостабильность целевого продукта: защита от воздействия света, совместимость с используемой упаковкой и устойчивость при перемешивании.

18. TFF – фильтрация в тангенциальном потоке. Применение TFF в биотехнологическом производстве. Диафильтрация – понятие, реализация. Схема установки диафильтрации.

Тангенциальная фильтрация (TFF) используется для разделения компонентов растворов с использованием мембран. В отличие от традиционной фильтрации, где поток направлен перпендикулярно мембране, при TFF поток направлен вдоль мембраны, что предотвращает забивку пор и увеличивает производительность.

Применение TFF в биотехнологическом производстве

1) Очистка белков и концентрирование биомолекул (белки, ДНК, РНК). 2) Концентрирование и осветление клеточной суспензии. 3) Удаление клеточного детрита из ферментационной среды. 4) Обессоливание лизатов и переведение в конечный буферный состав. 5) Подготовка проб для хроматографии. 6) Диафильтрация как часть этапа очистки.

Типы тангенциальных фильтров

• Половолоконные ультрафильтры.

• Обратноосмотические установки.

• Модульные фильтры.

Преимущества TFF

• Высокая эффективность разделения.

• Масштабируемость процессов.

Недостатки TFF

• Сдвиговые и механические нагрузки на клетки.

• Риск забивки мембран (образование слоя, закупорка пор, сужение просветов).

Диафильтрация – понятие и реализация

Диафильтрация – мембранный процесс очистки, заключающийся в отделении низкомолекулярных примесей от высокомолекулярных целевых продуктов. Продукт движется вдоль мембраны, а через нее вымываются нежелательные компоненты, под действием растворителя или буфера.

Цель диафильтрации: Очистка продукта и переведение в заданный буферный состав.

Реализация диафильтрации

1. Исходный раствор, содержащий целевой продукт и примеси, прокачивается через мембрану.

2. Пермеат, содержащий низкомолекулярные компоненты, удаляется.

3. Концентрат с целевым продуктом возвращается в систему.

4. Добавляется вода или буфер для вымывания примесей, количество которой эквивалентно объему пермеата.

Принцип работы Компонент А (целевой продукт) остается в концентрате, а компонент B (примеси) удаляется через мембрану.

Схема установки диафильтрации

1. Резервуар с исходным раствором.

2. Мембранный модуль (обычно полые волокна).

3. Насос для поддержания тангенциального потока.

4. Линия пермеата для удаления примесей.

5. Линия концентрата для возврата продукта в систему.

6. Линия подачи свежего растворителя или буфера.

18. Основные понятия технологии tff. Масштабирование диафильтрации.

Основные понятия:

Определение:

TFF – мембранная технология, используемая для концентрирования, диализа и разделения растворов. Она удерживает молекулы в диапазоне молекулярного веса 1–1000 кДа.

Принцип работы:

• Поток жидкости направлен вдоль поверхности мембраны (тангенциально).

• Трансмембранное давление (TMP) прижимает часть раствора к мембране, позволяя молекулам, меньшим пор мембраны, проходить в виде пермеата (фильтрата).

• Крупные молекулы остаются на стороне подачи, образуя ретентат.

Преимущества:

• Предотвращение забивки мембран.

• Повышенная эффективность и производительность.

Применение:

• Концентрирование биомолекул.

• Обессоливание и очистка растворов.

• Осветление суспензий.

Масштабирование диафильтрации:

Для успешного перехода процесса диафильтрации с лабораторного на производственный масштаб необходимо учитывать следующие параметры:

Характеристики мембраны: Размер пор. Материал мембраны.

Параметры процесса:

• Объемная нагрузка (Flux): объем жидкости, проходящий через мембрану на единицу площади за единицу времени.

• Трансмембранное давление (TMP): разница давлений по обе стороны мембраны.

• Входное давление: обеспечивает оптимальную работу системы.

• Параметры растворов: вязкость, pH, температура.

• Концентрация продукта: уровень концентрации в начале и во время диафильтрации.

Системные аспекты:

• Мертвый объем системы: минимизация избыточного объема жидкости, не участвующего в процессе.

• Метод санации мембраны: поддержание мембраны в рабочем состоянии.

• Количество кассет: определяет производительность системы и время процесса.

Цикличность масштабирования:

18. Нанофильтрация (вирусная фильтрация). Масштабирование нанофильтрации.

Нанофильтрация – метод очистки биопрепаратов от вирусных контаминантов с использованием мембранных фильтров с размером пор ~20 нм. Это форма тупиковой фильтрации, основанная на физических размерах частиц.

Цель:

• Удаление вирусных частиц из растворов белков и биомолекул.

• Обеспечение безопасности и чистоты биофармацевтических продуктов.

Характеристики процесса:

• Размер пор фильтров: 20, 35, 75 нм.

• Материалы фильтров: целлюлозно-ацетатные полые волокна с полупроницаемыми мембранами.

• Обеспечивает вирусную редукцию более чем на 7 log.

• Эффективен для удаления как оболочечных, так и безоболочечных вирусов (например, вирус гепатита A, парвовирус B19).

Преимущества:

• Высокая надежность и эффективность.

• Совместимость с биофармацевтическими продуктами.

Масштабирование нанофильтрации:

Характеристики мембраны:

• Размер пор: подбирается в зависимости от размеров вирусов и целевого продукта.

• Материал мембраны: влияет на взаимодействие с продуктом и устойчивость к условиям процесса.

Параметры процесса:

• Объемная нагрузка (flux): объем раствора на единицу площади мембраны.

• Давление: оптимальное давление обеспечивает стабильность фильтрации и предотвращает повреждение продукта.

• Критерий окончания процесса: снижение скорости фильтрации до 30% от начальной.

• Концентрация продукта: уровень концентрации целевого вещества в фильтруемом растворе.

• Параметры растворов: вязкость, pH, температура.

Дополнительные аспекты:

• Использование предфильтра: помогает минимизировать нагрузку на нанофильтр.

• Допустимое количество остановок: важно для предотвращения необратимой потери фильтрационной способности.

• Мертвый объем системы: минимизация избыточного объема растворов.

Особенности масштабирования:

Масштабирование проходит через циклическую настройку параметров:

• Выбор размера и материала фильтра.

• Определение объема загрузки и давления.

• Коррекция по времени, скорости и другим процессным параметрам

18. Валидация биотехнологического процесса. Понятие валидации, документы, составляемые при валидации. Что важно не забыть при валидации?

Валидация биотехнологического процесса — это документированный процесс, который гарантирует, что биотехнологические методы производства работают по назначению и производят качественный, стабильный результат.

Цель валидации — продемонстрировать, что процесс способен постоянно производить продукты, соответствующие всем заранее установленным стандартам качества, безопасности и эффективности.

Документы:

a) Программа валидации. В ней указывают задачи, руководителя этапа и рабочую группу, метод, порядок и сроки проведения валидации, перечень организаций, лабораторий и сотрудников, принимающих участие в процессе.

b) План валидации. В нём описывают производственный процесс, перечень выполняемых испытаний и критерии приемлемости, дополнительные элементы контроля в процессе, а также данные, которые должны быть получены.

c) Отчёт по результатам валидации. В нём указывают результаты испытания серий продукта, сертификаты анализа продукта, протоколы производства серий продукта, сведения о полученных неожиданных результатах, отклонениях или внесённых изменениях (с обоснованиями) и выводы. Отчёт оформляют не менее чем в двух экземплярах.

d) Заявка на проведение валидации. Её подают для проведения второго этапа валидации в уполномоченный орган государственного контроля и надзора. В заявке указывают организации и лаборатории, на базе которых будет осуществляться второй этап валидации, последовательность проведения исследований и необходимое количество измерений, используемое оборудование и средства измерения, необходимую квалификацию персонала.

Не менее, чем на 3х последовательных сериях выбора финальном объеме, по финальной технологии и на конечной площадке.

Протокол валидации: описание процесса; оборудования; ответственных лиц; контрольной стратегии производства; сроков проведения.

Отдельный протокол полупродуктов. протокол изучения стабильности

Отдельный протокол репроцессинга ключевых стадий (к примеру, не прошел тест на целостность фильтра).

Отчет по валидации с выводами воспроизводимости и устойчивости процесса.

Что важно не забыть:

a) Охватить все предназначенные для реализации дозировки и производственные участки. Данные о валидации должны подтверждать пригодность процесса для всех продуктов и на каждом производственном участке.

b) Получить соответствующие данные по показателям качества исходных материалов или компонентов, промежуточных продуктов и готового продукта. Также нужно провести верификацию и оценку критических показателей качества и критических параметров процесса, в том числе оценку тенденций.

c) Проверить выход после каждой стадии процесса. Также следует оценить качество продукта до и после каждой отдельной стадии процесса и факторы очистки для удаления загрязняющих белков, нуклеиновых кислот и потенциальных вирусов.

d) Контролировать МБЧ Для этого нужно проверить исходные материалы на наличие вирусов и других патогенов , а также протестировать продукт на наличие вирусов на разных стадиях производства.

e) Контролировать внешний вид продукта. Для растворов проверяют цвет, прозрачность, наличие агрегатов, рН. Для покрытий — цвет, влажность, блеск.

Аналитические методы и разработка спецификации биологического лс

42. Определение качества лекарственного препарата.

Качество лекарственного препарата – это совокупность его свойств, которые обеспечивают соответствие назначению и соответствие установленным стандартам. Оно характеризует пригодность действующего вещества и препарата для его целевого применения.

Основные показатели качества:

• Подлинность: подтверждение идентичности препарата и его активного вещества.

• Дозировка: точность содержания активного вещества.

• Иммуногенность: способность препарата вызывать иммунный ответ (актуально для биологических лекарств).

• Биологическая активность: эффективность действующего вещества в биологических процессах.

• Стабильность: сохранение свойств в течение установленного срока годности.

Контроль качества в процессе разработки:

Качество закладывается и контролируется на всех этапах создания препарата:

• Доклинические исследования: изучают стабильность и основные характеристики препарата.

• Клинические исследования: уточняют, какие показатели должны контролироваться для стабильного качества.

Производственные процессы разрабатываются с учетом обеспечения и сохранения всех ключевых свойств препарата, начиная с выбора сырья и заканчивая упаковкой.

42. Нормативные документы, которыми руководствуются фармкомпании при производстве и разработке биологических или биотехнологических лс.

a) ОФС.1.7.1.0011.18 “Биотехнологические лекарственные препараты” Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания

b) ISO 9000 это система международных стандартов в котором рассматриваются различные аспекты управления качеством и содержатся некоторые из наиболее известных стандартов ИСО. Семейство ISO 9000 состоит из самого известного в мире стандарта систем менеджмента качества (СМК) ISO 9001

c) ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств». Национальный стандарт РФ, в котором есть приложение о производстве биологических лекарственных средств.

d) Рекомендация Коллегии Евразийской экономической комиссии от 22.12.2020 №26 «О Руководстве по разработке и производству активных фармацевтических субстанций». Документ описывает подходы к разработке и процессу производства активных фармацевтических субстанций, включая стадии, необходимые для снижения содержания примесей.

e) Правила проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза, утверждённые Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. №89. Правила разработаны на основе актов, входящих в право Евразийского экономического союза, и международных рекомендаций. 57

f) ГОСТ Р 57688-2017 «Лекарственные средства для медицинского применения. Изучение стабильности биотехнологических/биологических лекарственных препаратов». Национальный стандарт Российской Федерации, который устанавливает подходы к изучению стабильности биотехнологических лекарственных препаратов.

42. Сложность оценки качества биологических лс в отличие от низкомолекулярных лс.

Обеспечивать и контролировать качество биотехнологических продуктов гораздо сложнее, чем продуктов, полученных химическим синтезом — так называемых малых молекул. Это связано с их размерами, сложностью химической структуры и способом получения. Так, если малая молекула обладает массой 100–1000 Да, то антитело имеет массу около 150 000 Да и содержит больше тысячи аминокислотных остатков (имеют вторичную, третичную и четвертичную структуру). Из-за таких размеров подобные продукты получают не химическим синтезом, а в клетках — как правило, бактерий или животных. Методами генной инженерии в клетку вводят ген, кодирующий нужный белок, и другие генетические элементы, необходимые для продукции белка в конкретной клеточной системе. Поскольку тонко контролировать процессы, происходящие в живых клетках, мы пока не научились, свойства получающихся продуктов варьируют, и для них требуются специальные меры обеспечения качества и свои методы контроля.

По сравнению с малыми молекулами, качество биотехнологических продуктов гораздо сильнее завязано на процесс их получения. Небольшие изменения в процессе культивирования клеток могут привести, например, к изменению профиля гликозилирования белка, а это грозит снижением эффективности или появлением иммуногенности. Кроме того, биотехнологические продукты обычно менее устойчивы к воздействиям среды, чем малые молекулы, и потому требуют специальных усилий по разработке стабильного конечного продукта. Часто важно использование неразрушающие методики тестирования.

42. Принцип QbD для аналитики.

Quality by Design (QbD) — это современный подход к обеспечению качества фармацевтических продуктов, включая биологические лекарственные средства, который основывается на принципе "качество проектируется на этапе разработки".

Основные аспекты QbD:

Целевой профиль качества продукта (Quality Target Product Profile, QTPP): определяет ключевые характеристики продукта:

• Показания к применению.

• Популяцию пациентов.

• Способ введения.

• Методы производства.

Характеристики процесса и продукта: все параметры процесса и свойства продукта тщательно изучаются и оптимизируются на этапе разработки.

Управление рисками: Анализируются потенциальные риски для качества на каждом этапе.

Постоянное совершенствование качества: На основе данных, полученных в ходе разработки и эксплуатации продукта, процесс и качество продукта постоянно улучшаются.

Применение QbD в аналитике:

• Разработка аналитических методов с учетом QTPP.

• Внедрение методов, обеспечивающих точность, воспроизводимость и надежность анализа.

• Применение статистических и математических моделей для прогнозирования и управления аналитическими процессами.

42. Критические параметры качества (cqa).

Исходя из QTPP, каждому параметру процесса и показателю продукта приписывается уровень риска влияния на качество. Параметры с высоким риском становятся критическими (critical quality attributes, CQA).

CQA (critical quality attribute) – физическое, химическое, биологическое или микробиологическое свойство или характеристика продукта, которая должна находиться в определённом диапазоне для обеспечения желаемого качества продукта.

Многомерная комбинация и взаимосвязь входящих переменных (например, свойств материалов) и параметров процесса, которая должна демонстрировать подтверждение качества, называется проектируемым полем (design space).

На основе проектируемого поля определяют стратегию контроля качества препарата и внедряют систему постоянного совершенствования качества. Стратегия контроля качества служит для того, чтобы минимизировать риски ненадлежащего качества, снизить влияние вариабельности характеристик исходных материалов и параметров производства на качество и в конечном итоге добиться для продукта соответствия своему целевому профилю.

Обязательные (облигатные) CQA

Содержание белка

Извлекаемый объём

Осмоляльность

рН

Внешний вид

Содержание вспомогательных веществ

Посторонние агенты (вирусы, микоплазма, бактерии, бактериальные эндотоксины)

Методика расчёта критичности показателя качества

Для определения критических показателей качества с помощью ранжирования рисков проводится оценка их воздействия на безопасность (токсичность и иммуногенность) и эффективность (биологическая активность, фармакодинамика и фармакокинетика) препарата.

Подход, используемый при ранжировании рисков, включает в себя разделение риска на несколько компонентов, требующихся для оценки соответствующих факторов риска (например, потенциальное воздействие на безопасность и эффективность и неопределённость относительно информации, используемой для оценки потенциального воздействия).

Две величины (воздействие и неопределённость) перемножаются, чтобы определить уровень риска, который характеризует общую критичность показателя качества.

Критичность показателя = Воздействие х Неопределённость

Факторы влияющие на критические параметры

Оценка риска

Анализ и определение степени риска

Выполняется с привлечением метода FMEA. FMEA (Failure Mode and Effects Analysis, анализ видов и последствий отказов) - общеупотребимый и удобный инструмент для определения параметров процесса, требующих дальнейшей характеристики.

FMEA рассматривает три фактора:

S- тяжесть воздействия параметра на процесс при отклонении (Severity of impact)

O - вероятность возникновения отклонения (probability of Occurrence)

D- вероятность обнаружения отклонения (likelihood of Detection)

RPN = S x O x D

Тяжесть воздействия (Severity)

Может представлять собой шкалу с разным количеством уровней (как правило, от 3 до 10).

5 -Процесс находится на грани эффективности, в 10% случаев возможно отклонение за пределы

10- В 90% случаев продукт выходит за границы спецификации, или

продукт полностью потерян, или не подлежит восстановлению

Вероятность возникновения (Occurrence)

Может представлять собой шкалу с разным количеством уровней (как правило, от 3 до 10).

1 Не наступает совсем либо наступает не чаще, чем раз в 10 лет

5 Наступает не чаще, чем в 2% случаев

10 Наступает чаще, чем в 50% случаев

Вероятность обнаружения (Detectability)

Может представлять собой шкалу с разным количеством уровней (как правило, от 3 до 10).

1 Практически полная гарантия обнаружения отклонения

5 Средняя вероятность обнаружения отклонения

10 Практически невозможно обнаружить, не существует известных

методов контроля для обнаружения отклонения

42. Классификация cqa. «Обязательные» cqa как важнейший этап оценки качества.

Классификация CQA может включать:

a) Варианты продукта, такие как размер, заряд, гликаны или окисление.

b) Примеси, связанные с процессом, например, белок клеточной оболочки, ДНК или выводимые вещества.

c) Регуляторные CQA, такие как состав и сила (pH, вспомогательные вещества, количество/концентрация, осмоляльность) или посторонние агенты (потенциальные вирусы, биообсеменённость, микоплазма, эндотоксин).

Некоторые обязательные CQA:

a) Чистота. Уровень загрязняющих веществ или примесей в лекарственном средстве.

b) Идентичность. Подтверждение, что активное вещество соответствует ожидаемому химическому составу.

c) Содержание активного ингредиента. Концентрация активного вещества в лекарственном продукте.

d) Растворимость. Способность активного ингредиента растворяться в предписанных условиях, что может влиять на его биодоступность.

e) Стерильность. Отсутствие живых микроорганизмов в стерильных продуктах.

f) Распределение размеров частиц. Важно для инъекционных препаратов, где размер частиц может влиять на безопасность и эффективность.

g) Механическая прочность. Параметр относится к способности препарата выдерживать физические нагрузки во время производства, упаковки, транспортировки и хранения.

42. Посттрансляционные модификации (птм) биомолекул.

Посттрансляционные модификации (ПТМ) — это процесс ковалентной модификации белков после их синтеза на рибосомах. Они играют важную роль в регуляции функций белков, увеличении их разнообразия и адаптации к различным условиям.

Ключевые аспекты ПТМ:

Роль ПТМ:

• Увеличение гетерогенности белков.

• Регуляция активности ферментов и транскрипционных факторов.

• Изменение конформации, клеточной локализации, стабильности и взаимодействий белков.

• Контроль длительности жизни белков.

Разнообразие белков: благодаря ПТМ, из ~20 000 генов человека образуется от 300 000 до 1 000 000 функционально активных белков.

Примеры: белок р53, регулирующий клеточный цикл и подавляющий опухолевый рост, подвергается фосфорилированию, ацетилированию и гликозилированию. Эти модификации увеличивают количество участков связывания р53 с ДНК.

Основные виды ПТМ:

• Гликозилирование

  • Присоединение углеводного фрагмента (обычно к аспарагину, серину или треонину).

  • Участвует в регуляции клеточной адгезии, распознавании и иммунном ответе.

• Ацетилирование

  • Добавление ацетильной группы (обычно к N-концу или лизинам).

  • Влияет на упаковку ДНК и экспрессию генов.

• Метилирование

  • Присоединение метильной группы (к лизину или аргинину).

  • Важен для эпигенетической регуляции и сигналинга.

• Фосфорилирование

  • Добавление фосфатной группы (на серин, треонин или тирозин).

  • Регулирует активность ферментов, передает сигналы и участвует в клеточном цикле.

Значение: ПТМ обеспечивают гибкость и адаптацию белков для выполнения различных функций, что делает их неотъемлемой частью клеточной жизни и регуляторных процессов в организме.

42. Влияние птм на эффекторные (adcc и cdc) свойства антител.

Эффекторные свойства антител, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), существенно зависят от посттрансляционных модификаций (ПТМ).

1) Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC): это механизм, при котором антитела связываются с клеткой-мишенью и активируют иммунные клетки, такие как натуральные киллеры (NK-клетки), через Fc-рецепторы.

Влияние ПТМ:

Дефукозилирование (удаление остатка фукозы с Fc-области антитела):

• Увеличивает сродство антител к FcγRIIIa-рецепторам, находящимся на поверхности NK-клеток.

• Это почти в 20 раз усиливает ADCC, что делает антитела более эффективными в уничтожении клеток-мишеней.

2) Комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC): реализуется через активацию системы комплемента, которая уничтожает клетки-мишени. Механизм начинается с связывания компонента C1q комплемента с Fc-областью антитела, прикрепленного к клетке-мишени, что запускает каскад реакций и разрушение мембраны клетки. Влияние ПТМ:

• Изменения в гликозилировании Fc-области могут модулировать способность антитела связывать компонент C1q.

• Эти изменения напрямую влияют на активацию системы комплемента и, следовательно, на эффективность CDC.

Заключение: ПТМ, такие как дефукозилирование и модификация гликозилирования, оказывают критическое влияние на эффективность ADCC и CDC, усиливая или ослабляя связывание антител с Fc-рецепторами и компонентами комплемента. Это делает ПТМ важным инструментом для оптимизации терапевтических антител.

42. Понятие «Спецификация».

Под спецификацией понимается перечень испытаний, ссылок на аналитические методики и соответствующие критерии приемлемости, представляющие собой численные (количественные) пределы, диапазоны и прочие критерии для описанных испытаний. Спецификация задает набор критериев, которым должны соответствовать активная фармацевтическая субстанция, лекарственный препарат или материалы других этапов производства, чтобы считаться приемлемыми для использования по целевому назначению. Спецификации составляются на все исходные материалы, сырье, промежуточные продукты, вспомогательные вещества, активную фармацевтическую субстанцию, лекарственный препарат. Под “соответствием спецификациям” понимается, что при испытании согласно представленным в спецификации аналитическим методикам активная фармацевтическая субстанция и лекарственный препарат будут отвечать заданным в спецификациях критериям приемлемости.

Функции спецификаций:

• Устанавливают набор критериев приемлемости.

• Обеспечивают контроль качества и постоянство характеристик продукции.

• Гарантируют пригодность продукта для целевого использования.

Соответствие спецификациям: предполагает, что продукт, проверенный с использованием указанных методик, удовлетворяет заданным критериям.

Элементы стратегии контроля качества, связанные со спецификациями:

• Характеризация продукта: Подробное описание свойств на этапе разработки.

• Соблюдение стандартов: Выполнение требований надлежащей производственной практики (GMP).

• Валидация процессов: Подтверждение стабильности и воспроизводимости производственных процессов.

• Контроль на этапах производства: Испытания сырья и внутрипроизводственные проверки.

• Изучение стабильности: Определение изменений характеристик продукции со временем.

Спецификации — это ключевой инструмент обеспечения качества лекарственных средств, включающий контроль на всех стадиях их разработки, производства и использования.

42. Электрофоретические методы. А какого хуя форез, его же не было, надо на консультации узнать хмммм

Электрофоретические методы — это аналитические технологии, основанные на движении молекул в электрическом поле. Эти методы используются для разделения, анализа и контроля биологических молекул, таких как белки, по их размеру, заряду или изоэлектрическим свойствам.

Основные типы электрофоретических методов:

1. SDS-PAGE (ЭФ в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия):

   • Разделяет белки по молекулярной массе.

   • Белки денатурируются и приобретают отрицательный заряд, что позволяет разделение исключительно по размеру.

2. Изоэлектрическое фокусирование (IEF):

   • Разделение белков по их изоэлектрической точке (pI) в pH-градиенте.

   • Высокая разрешающая способность для анализа зарядовых изоформ белков.

3. Капиллярный электрофорез (CE):

   • Быстрое и эффективное разделение малых и крупных молекул.

   • Подвиды:

     • Капиллярный изоэлектрический фокус (cIEF): для анализа pI.

     • Капиллярная зона электрофореза (CZE): для анализа молекул по их заряду и массе.

4. 2D-электрофорез:

   • Комбинирует IEF и SDS-PAGE.

   • Используется для сложных смесей, обеспечивает разделение по pI и молекулярной массе одновременно.

Применение электрофоретических методов в биотехнологии и фармацевтике:

Анализ белков:

• Подтверждение присутствия целевого белка.

• Определение чистоты и выявление примесей или деградационных продуктов.

Исследование посттрансляционных модификаций (ПТМ): оценка гликозилирования и других ПТМ, критически важных для биологических лекарственных средств.

Оценка гетерогенности: анализ вариабельности структуры белков, например, гликопротеинов.

Контроль биопроизводства: мониторинг процессов для предотвращения отклонений и контроля качества продукции.

Исследование антител и биотрансформатов: оценка агрегации, стабильности и структуры.

42. Хроматографические методы.

Хроматография — это метод разделения компонентов смеси на основе их взаимодействия с неподвижной и подвижной фазами. Эти методы широко используются для анализа и очистки молекул, таких как белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и малые молекулы, в том числе в биотехнологии и фармацевтике.

Метод впервые использовался для разделения смеси пигментов растений (хлорофиллы, каротиноиды и ксантофиллы) с использованием колонки, наполненной адсорбентом (карбонатом кальция) и жидкого растворителя в 1903 г. русским ученым Михаилом Семеновичем Цветом.

Хроматография (от греч. chroma, родительный падеж chromatos— цвет, краска) – это физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении компонентов смеси между двумя фазами — неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную фазу, т.е. основу метода составляют процессы сорбции и десорбции.

ПО ОФС: Хроматографией называется метод разделения смесей веществ, основанный на их многократном перераспределении между двумя контактирующими фазами, одна из которых неподвижна, а другая имеет постоянное направление движения.

Неподвижная фаза может быть твёрдым веществом, жидкостью, нанесённой на твёрдый носитель или гелем. Неподвижная фаза может помещаться в колонку или наноситься в виде тонкого слоя или плёнки и т.п. Подвижная фаза может быть газом (ГХ), жидкостью (ЖХ) или сверхкритическим флюидом.

Подвижная фаза - поток жидкости, сверхкритического флюида или газа, перемещающий компоненты разделяемой смеси вдоль неподвижной фазы.

Неподвижная фаза - твёрдый сорбент или несмешивающаяся с подвижной фазой жидкость, на которых осуществляется дифференцированное удерживание и разделение компонентов смеси.

Адсорбент - твёрдый сорбент, концентрирующий на своей поверхности газы, пары или растворенные вещества.

Абсорбент - твёрдый или жидкий сорбент, растворяющий в своем объёме газы, пары или компоненты жидких смесей.

Сорбент - твёрдое вещество, жидкость или их смесь, способные поглощать или удерживать растворенные вещества.

Сорбат - вещество, удерживаемое сорбентом (в хроматографии - компонент разделяемой смеси).

Аналит - компонент, искомый или определяемый в пробе вещества или материала объекта аналитического контроля.

Хроматограмма - кривая, изображающая зависимость концентрации соединений, выходящих из колонки с потоком подвижной фазы, от времени с момента начала разделения.

Элюент - жидкость используемая в качестве подвижной фазы.

Элюат - подвижная фаза выходящая из колонки

Изократический режим - способ разделения, при котором состав элюента не изменяется

Градиентный режим - способ разделения, при котором состав элюента изменяется по определённой программе, увеличивая «силу» растворителя за счет изменения полярности, pH или ионной силы. Используется в случае необходимости разделения веществ, которые сильно отличаются по степени связывания с сорбентом

Система – в зависимости от контекста – сам жидкостной хроматограф («Система Аджилент с УФ-детектором»). – элюент («Приготовить систему вода – ацетонитрил, 60:40 (v/v)») – элюент вместе с конкретной колонкой («Получилась селективная система»)

Сорбция (от лат. sorbeo — поглощаю) — поглощение твёрдым телом либо жидкостью различных веществ из окружающей среды. Поглощаемое вещество, находящееся в среде, называют сорбатом, поглощающее твёрдое тело или жидкость — сорбентом. По характеру поглощения сорбата сорбционные явления делятся на два типа: адсорбцию — концентрирование сорбата на поверхности раздела фаз или его поглощение поверхностным слоем сорбента и абсорбцию — объёмное поглощение, при котором сорбат распределяется по всему объёму сорбента.

Адсорбция (лат. ad — на, при, в; sorbeo — поглощаю) —процесс увеличения концентрации растворённого вещества у поверхности раздела двух фаз

Абсо́рбция (лат. absorptio от absorbere — поглощать) — поглощение сорбата всем объёмом сорбента.

Нормально-фазовая хроматография

§ Жидко-твердофазная хроматография

§ Механизмы: и адсорбция и распределение

§ Сорбенты: § силикагель с диольными группами § силикагель с аминными группами § силикагель с нитрильными группами § силикагель (редко)

§ Сорбент всегда полярнее чем элюент

§ Разделяет низко- и среднеполярные вещества без заряда

§ Порядок выхода аналитов – сначала неполярные

§ Не разделяет неполярные (например, алканы)

Адсорбционная хроматография

§ Жидко-твердофазная хроматография

§ Аналит адсорбируется на поверхности сорбента

§ Взаимодействие слабое – силы Ван-дер-Ваальса, водородные связи, π- π взаимодействия

§ Сорбенты – силикагель, окись алюминия, силикат магния, модифицированные силикагели, полиамид, целлюлоза и т.д.

§ Порядок выхода аналитов – сначала неполярные

§ Сорбент полярный, элюент не полярный

§ Разделяет низко- и среднеполярные вещества без заряда § Не разделяет неполярные (например алканы)

С этого вида хроматографии все и начиналось. Были изучены разнообразные полярные органические и неорганические соединения. В результате из неорганики в жидкостной хроматографии (низкого давления) остался силикагель, окись алюминия и флоризил (Florisil – силикат магния). В ВЭЖХ –остался, по сути, только силикагель. При этом адсорбционная хроматография на не модифицированном силикагеле почти не применяется – плохо воспроизводится, могут быть «хвосты» и т.д.

Распределительная хроматография

§ Жидко-жидкофазная хроматография

§ Аналит распределяется между подвижной и неподвижной жидкими фазами

§ Сорбенты – вода на поверхности силикагеля, окиси алюминия, силиката магния, модифицированные силикагели, полиамиды, целлюлоза и т.д.

§ Сорбент полярный, элюент не полярный

§ Разделяет полярные соединения

§ Порядок выхода аналитов – сначала неполярные

§ Не разделяет неполярные соединения

§ В классическом варианте – тройные системы типа H2O – iPrOH – гексан H2O – MeOH – CHCl3

Обращённо-фазовая хроматография

§ Жидко-твердофазная хроматография

§ Механизмы: гидрофобные взаимодействия, адсорбция и распределение

§ Сорбенты: § силикагель с алкильными группами (С2, С4, С8, С18...) § силикагель с другими гидрофобными группами § силикагель с нитрильными группами

§ Сорбент всегда менее полярен чем элюент

§ Порядок выхода аналитов – сначала полярные

§ Разделяет почти все классы соединений, кроме очень полярных (углеводы)

§ Хуже чем НФ разделяет изомеры

Ионообменная хроматография

§ Жидко-твердофазная хроматография

§ Механизмы: кулоновские взаимодействия

§ Сорбенты: § полимерные катионо и анионообменники § силикагели с кислотными и основными группами

§ Разделяет заряженные соединения, растворимые в воде (или водно-органических смесях) по количеству и виду ионогенных групп

§ Использует водные буферные растворы (сорбент не полярный, элюент полярный)

§ Часто требует градиентных режимов

§ Сначала выходят полярные

Эксклюзионная хроматография

§ Жидко-жидкофазная хроматография

§ Механизм: разделение по размерам

§ Сорбенты: § твердые пористые полимеры § модифицированные силикагели § стекла

§ Элюенты – любые растворители

§ Сорбент не должен взаимодействовать с веществом

§ Заканчивается там, где начинаются другие виды хроматографии

§ Низкая пиковая емкость

§ Желательно увеличение длины колонок

HILIC хроматография

§ Жидко- жидкофазная хроматография

§ Механизм: распределение и адсорбция

§ Сорбенты: § как для НФ хроматографии § силикагель, диол, амин, нитрил

§ Элюенты – как в ОФ. Смеси воды и CH3CN, часто добавляют соли типа AcONH4 (сорбент полярный, элюент полярный)

§ Порядок выхода аналитов – как в НФ (сначала неполярные)

§ Позволяет разделять сильно полярные и заряженные соединения

Оценка вирусной безопасности биотехнологических лекарственных средств

53. История вирусной безопасности. Примеры случаев контаминации.

На биотехнологическом производстве проводят экскурсию для студентов. Гид с гордостью показывает оборудование: – Вот здесь мы выращиваем клеточные культуры!

Один студент с интересом спрашивает: – А если кто-то чихнёт, это сильно повлияет на процесс?

Гид, не задумываясь: – Смотря кто чихнёт. Если лаборант – ничего страшного, а если клетка – пишите пропало!

-# 1. Ранние этапы развития вирусной безопасности

- 1950-1960-е годы:

- Поливирусные контаминации в вакцинах:

- Полиовакцинация (1955): Использование клеточных культур почек обезьяны для производства полиовакцины привело к случайной инфицировании вакцин вирусом Симпсона (SV40).

- Последствия: Обнаружение SV40 в вакцинах привело к массовому пересмотру методов очистки и проверки вакцин на наличие вирусных контаминантов.

- 1980-е годы:

- Вирусные инфекции в биологических препаратах:

- HIV и гепатиты B/C в иммуноглобулинах и факторах свертывания: Контаминация этих препаратов кровью доноров до внедрения надёжных тестов и методов инактивации вирусов.

--# 2. Введение рекомбинантных технологий и новые вызовы

- 1980-е – 1990-е годы:

- Развитие рекомбинантных белков:

- Рекомбинантный инсулин и гормон роста: Переход от использования тканей животных к генно-инженерным клеточным линиям снизил риск вирусной контаминации, но выявились новые вызовы, связанные с использованием ретротранспозонов и потенциальных эндогенных вирусов в клеточных линиях-хозяевах.

- 1990-е годы:

- Появление методов валидации чистоты:

- Тестирование на адвенциальные (побочные) вирусы: Введение in vitro и in vivo тестов для обнаружения потенциальных вирусных контаминантов в биофармацевтических продуктах.

--# 3. Современные стандарты и технологии обеспечения вирусной безопасности

- 2000-е годы – настоящее время:

- Разработка и внедрение продвинутых методов фильтрации и инактивации: Использование ультрафильтрации, ультрафиолетового излучения, химических методов для удаления или инактивации вирусов.

- Введение систем управления качеством по принципу "безопасность по дизайну" (Safety by Design): Интеграция вирусной безопасности на всех этапах разработки и производства лекарственных средств.

- Использование широкоспектровых метагеномных и масс-спектрометрических методов: Позволяют обнаруживать неизвестные и трудно идентифицируемые вирусные агенты.

--# 4. Влияние случаев контаминации на нормативные требования

- Разработка руководящих документов:

- Guidelines by WHO, FDA, EMA: Введение строгих нормативов по тестированию и контролю вирусной безопасности биотехнологических продуктов.

- Внедрение многоступенчатых систем контроля:

- Сочетание физических, химических и биологических методов очистки и инактивации вирусов для обеспечения безопасности конечного продукта.

53. Общая стратегия обеспечения вирусной безопасности.

Обеспечение вирусной безопасности — это комплекс мероприятий, направленных на предотвращение попадания вирусов в биологические препараты и обеспечение их чистоты и безопасности для конечного пользователя. Основные элементы стратегии включают контроль источников, эффективность процессов инактивации/удаления вирусов и тестирование продукции.

Основные этапы стратегии:

1. Контроль источников сырья:

   • Использование сертифицированных поставщиков.

   • Тестирование сырья на вирусное загрязнение.

   • Выбор проверенных клеточных линий.

2. Контроль клеточных культур и производственных систем:

   • Регулярный мониторинг клеточных линий на вирусное загрязнение.

   • Использование проверенных и безопасных систем производства.

3. Гигиена и асептические условия:

   • Стерилизация оборудования и инвентаря.

   • Поддержание чистоты производственных помещений.

   • Контроль микробной и вирусной чистоты воздуха.

4. Процессы очистки и инактивации вирусов:

   • Методы удаления вирусов:

     • Ультрафильтрация и мембранные технологии.

     • Хроматографические методы.

   • Методы инактивации вирусов:

     • Тепловая обработка.

     • Химическая инактивация.

     • Воздействие ультрафиолета.

5. Валидация процессов:

   • Подтверждение эффективности удаления или инактивации вирусов.

   • Регулярные аудиты и проверки процессов.

6. Тестирование продукции:

   • Проведение молекулярных и фаг-тестов.

   • Использование инкубационных методов для обнаружения вирусов.

   • Тестирование полупродуктов и конечных субстанций.

7. Регуляторные требования:

   • Соблюдение стандартов и рекомендаций (FDA, EMA, ICH).

   • Ведение документации по всем этапам производства.

8. Управление рисками:

   • Анализ и минимизация рисков вирусного загрязнения.

   • Постоянный мониторинг безопасности.

9. Обучение и квалификация персонала:

   • Регулярные тренинги по мерам вирусной безопасности.

   • Контроль компетентности сотрудников.

10. Инновационные технологии:

    • Использование биофильтров и систем автоматизации.

    • Внедрение нанотехнологий для эффективного удаления вирусов.

53. Анализ источников контаминации.

Контаминация вирусами может происходить из разных источников на всех этапах производства. Основные источники контаминации:

1. Сырьевые материалы:

   • Биологические исходные материалы, такие как клеточные линии или сырье животного и растительного происхождения, могут содержать эндогенные вирусы (ретровирусы, герпесвирусы, парамиксовирусы и др.).

   • Компоненты среды культивирования (сыворотки, добавки) могут быть заражены вирусами (например, MVM, парвовирусами).

2. Поставщики и поставляемые материалы:

   • Географическое происхождение сырья из регионов с высокой вирусной активностью увеличивает риск контаминации.

   • Несоответствие стандартам и отсутствие сертификации поставщиков усиливает вероятность заражения.

3. Производственные процессы:

   • Оборудование: Некачественная стерилизация или неправильное обслуживание приводит к заражению.

   • Производственные помещения: Недостатки в проектировке, такие как плохая вентиляция или отсутствие зон асептики, способствуют распространению вирусов.

4. Персонал:

   • Недостаточное обучение сотрудников повышает вероятность ошибок.

   • Зараженные вирусами сотрудники могут стать источником контаминации.

5. Окружающая среда:

   • Загрязненные вода и воздух могут переносить вирусные частицы.

   • Несоблюдение условий асептики и гигиены увеличивает риск вирусного загрязнения.

6. Транспортировка и хранение:

   • Неправильные условия хранения и транспортировки позволяют вирусам выживать и распространяться.

   • Недостаточная защита упаковочных материалов также повышает вероятность контаминации.

7. Воздействие внешних факторов:

   • Сбои в системах безопасности (например, отключение фильтров или аварии) увеличивают риск заражения.

   • Природные катастрофы (наводнения, землетрясения) могут повредить производственные объекты и нарушить меры безопасности.

8. Тестирование и контроль качества:

   • Пропущенные этапы тестирования или ошибки в анализах снижают вероятность своевременного выявления контаминации.

53. Планирование и проведение тестирований in vitro и in vivo для выявления вирусной контаминации и эндогенных вирусов.

I. Планирование тестирований

1. Цели тестирований:

   • Обнаружение эндогенных вирусов (например, ретровирусов, герпесвирусов).

   • Выявление вирусной контаминации из внешних источников, таких как персонал, оборудование, помещения или сырьё.

   • Проверка эффективности стадий удаления и инактивации вирусов в производственных процессах.

2. Выбор вирусов:

   • Релевантные вирусы: обнаруженные вирусы или те, которые могут контаминировать процесс.

   • Модельные вирусы: вирусы из того же рода или семейства с схожими свойствами.

   • Разнообразные вирусы: для оценки робастности стадий очистки.

3. Регуляторные требования:

   • Проведение исследований с ретровирусами (например, MuLV) до начала клинических исследований.

   • Проведение тестов с не менее чем тремя вирусами к III фазе клинических исследований.

4. Подготовка процесса:

   • Демасштабирование производственных стадий для лабораторных исследований.

   • Подбор условий, максимально приближенных к производственным или худших случаев.

II. Проведение тестирований in vitro

1. Методы скрининга:

   • Цитопатическое действие (CPE): наблюдение разрушения клеток.

   • Гемадсорбция и гемагглютинация: тесты на взаимодействие вирусов с эритроцитами.

   • Электронная микроскопия: визуализация вирусов и вирусоподобных частиц.

2. Специфические методы:

   • ПЦР и qPCR: количественное определение вирусной РНК/ДНК.

   • Иммуноферментный анализ (ELISA): выявление вирусных белков.

   • Тесты обратной транскриптазы: детекция активности ретровирусов.

3. Используемые клеточные линии:

   • MRC-5, Vero, CHO-K1 и другие.

4. Контроль тестов:

   • Обязательный положительный контроль (введение известного вируса).

   • Оценка пределов чувствительности тестовой системы.

III. Проведение тестирований in vivo

1. Цели тестирования:

   • Выявление вирусов, которые невозможно обнаружить in vitro.

   • Проверка биологической активности вирусов в живом организме.

2. Выбор тестовых животных:

   • Мыши (взрослые и сосунки), морские свинки, куриные эмбрионы.

3. Методы анализа:

   • Мониторинг состояния животных: выявление признаков инфекции.

   • Тесты выработки антител: проверка иммунного ответа.

   • Гемагглютинация: для куриных эмбрионов.

4. Этические аспекты:

   • Соблюдение принципов 3R:

     • Замена (Replacement): использование альтернативных методов.

     • Сокращение (Reduction): минимизация числа животных.

     • Улучшение (Refinement): оптимизация условий содержания.

IV. Анализ и интерпретация результатов

1. Оценка данных:

1. Расчет логарифмического фактора снижения вирусной нагрузки (LRV).

2. Учет чувствительности тестов и анализа матрицы образцов.

2. Документирование:

3. Полное описание методов, условий и результатов тестирования.

4. Соответствие требованиям регуляторов.

3. Выводы:

5. Подтверждение удаления и инактивации вирусов.

6. Оценка оставшихся рисков для безопасности продукта.

53. Оценка результатов тестирования. Случаи, согласно регуляторным документам. Ситуация a (Case a)

Описание: Вирусы и вирусоподобные частицы отсутствуют. Действия:

• Оценка эффективности противовирусной очистки с модельными вирусами.

• Обоснование отсутствия вирусов на основе данных тестирования клеточных банков и сырья.

Ситуация B (Case B)

Описание: Обнаружены ретровирусы грызунов (например, A, C и R частицы). Действия:

1. Оценка противовирусной очистки с включением специфического ретровируса (например, MuLV).

2. Проведение тестирования 3 серий очищенного нерасфасованного продукта на выявленный вирус.

3. Необязательно для хорошо описанных частиц в стандартных клеточных линиях (CHO, BHK).

Ситуация C (Case C)

Описание: Выявлены вирусы, не инфицирующие человека. Действия:

1. Желательно оценить эффективность очистки с обнаруженным вирусом.

2. Провести подробное исследование инактивации выявленного вируса.

3. Обязательное тестирование 3 серий очищенного продукта на обнаруженный вирус.

Ситуация D (Case D)

Описание: Обнаружены вирусы, инфицирующие человека. Действия:

• Подробный анализ и обязательное тестирование на их удаление/инактивацию.

• Дополнительные меры безопасности на всех стадиях производства.

Ситуация E (Case E)

Описание: Выявлены неизвестные вирусы. Действия:

1. Проведение дополнительных исследований для идентификации вирусов.

2. Оценка возможности их удаления/инактивации.

3. Включение модельных вирусов для дальнейших исследований.

Общие положения

1. Оценка результатов тестирования

a. Интерпретация данных

b. Статистический анализ

c. Верификация и подтверждение

2. Случаи согласно регуляторным документам

a. Положительный результат тестирования

- Действия:

- Изоляция и оценка контаминации:

- Уведомление регуляторов

- Прекращение производства и отзыв продукции:.

- Корректирующие меры:

b. Отрицательный результат тестирования

- Продолжение производства: c. Неопределенные или лимитированные результаты

- Действия:

- Дополнительное тестирование:

53. Цели и основные принципы исследований эффективности удаления и инактивации вирусов.

Цели:

• продемонстрировать, что вирусы, которые были обнаружены на этапе тестирования будут удалены/инактивированы в процессе очистки

• продемонстрировать, что привнесенные извне вирусы, которые не обнаруживаются на этапе тестирования, будут также удалены/инактивированы в процессе очистки

Основные принципы исследований

1. Использование релевантных и модельных вирусов:

   • Выбор вирусов, идентичных обнаруженным при тестировании, или вирусов из того же рода/семейства.

   • Применение модельных вирусов с различными физико-химическими свойствами для оценки робастности процессов.

2. Демасштабирование процессов:

   • Проведение стадий очистки в лабораторных условиях с сохранением параметров, аналогичных производственным, или обоснование худшего случая.

3. Многоступенчатая очистка:

   • Оценка логарифмического фактора снижения вирусной нагрузки (LRV) на каждой стадии очистки.

   • Использование нескольких независимых стадий удаления/инактивации вирусов для повышения безопасности.

4. Тестирование эффективности методов удаления/инактивации:

   • Нанофильтрация для удаления вирусов по размеру.

   • Инактивация вирусов через воздействие низкого pH, растворителей/детергентов или нагрева.

   • Хроматографические методы для оценки дополнительного вклада в удаление вирусов.

5. Контроль параметров процесса:

   • Время, температура, pH, концентрация реагентов и другие параметры, влияющие на эффективность стадий удаления/инактивации.

   • Регулярное тестирование стабильности и воспроизводимости процесса.

6. Оценка рисков:

   • Анализ потенциальных источников контаминации.

   • Оценка эффективности стадий для вирусов с различными характеристиками.

7. Регуляторное соблюдение:

   • Проведение исследований в соответствии с руководствами и нормами (например, необходимость тестирования с модельным ретровирусом MuLV для грызунов).

8. Документирование и анализ:

   • Полное документирование экспериментов, включая расчет LRV, анализ рисков и статистическую обработку результатов

53. Выбор вирусов и стадий процесса для исследований.

Панель выбранных вирусов

Релевантные • Идентичные обнаруженным при тестировании

• Вирусы, способные контаминировать клеточную культуру или сырье

Модельные специфические • Вирусы из того же рода или семейства, со схожими с релевантными свойствами

Модельные • Вирусы с разными физикохимическими свойствами для исследования робастности

Общие рекомендации

• Возможность наработки высокого титра вируса (10⁶ - 10⁹ на мл).

• Эффективная и надежная система детекции выбранного вируса • Безопасность выбранного вируса для исследователей

Регуляторные аспекты для клеточных культур грызунов

• До начала 1-й фазы клинических исследований: исследования с двумя вирусами из которых один – модельный ретровирус MuLV.

• До начала 3-й фазы клинических исследований исследования с не менее чем c тремя вирусами из которых один – модельный ретровирус MuLV.

Или был вариант

Захват на Prot A сорбенте: начальная стадия очистки.

Инактивация при низком pH: разрушение оболочечных вирусов.

Анионообменная хроматография: дополнительное удаление вирусов.

Диафильтрация и приготовление конечного продукта: удаление примесей и вирусных частиц.

Противовирусная нанофильтрация: задержка вирусов на мембранах (~20 нм).

53. Направленные противовирусные стадии. Принцип работы и регуляторные аспекты.

Нанофильтрация задержка на фильтре по размеру (поры~ 20 нм)

Инактивация разрушение оболочки вируса Понижение pH до 3-4 Растворитель/ детергент Triton X-100; Tween 80 Трибутил фосфат

1. Противовирусная нанофильтрация:

   • Принцип работы:

     • Задержка вирусов на мембране на основе размера пор (~20 нм).

     • Эффективно удаляет как оболочечные, так и безоболочечные вирусы.

   • Ключевые параметры:

     • Размер пор мембраны.

     • Нагрузка на фильтр.

     • Скорость фильтрации и трансмембранное давление.

   • Примечания:

     • Важен выбор мембраны, аналогичной производственной.

2. Инактивация при низком pH:

   • Принцип работы:

     • Разрушение липидной оболочки вирусов за счёт снижения pH до 3-4.

   • Ключевые параметры:

     • Время выдержки.

     • Значение pH (чем ниже, тем эффективнее).

     • Температура реакции.

   • Примечания:

     • Белки или липиды в матрице могут снижать эффективность процесса.

3. Обработка растворителями/детергентами:

   • Принцип работы:

     • Разрушение липидной оболочки вирусов с помощью веществ, таких как Triton X-100, Tween 80 или трибутилфосфат.

   • Ключевые параметры:

     • Концентрация детергента.

     • Время обработки.

     • Перемешивание и температура.

   • Примечания:

     • Требуется контроль минимального объёма для предотвращения неполной инактивации.

4. Хроматографические стадии (например, анионообменная или аффинная хроматография):

   • Принцип работы:

     • Удаление вирусов за счёт специфического связывания или исключения.

   • Ключевые параметры:

     • Нагрузка на сорбент.

     • Состав и параметры буферов.

     • Скорость потока и объём промывки.

   • Примечания:

     • Хроматографические стадии не являются робастными с точки зрения удаления вирусов, но могут вносить дополнительный вклад при правильном планировании.

Регуляторные аспекты

Две направленные противовирусные стадии для релевантного вируса

• Корректное демасштабирование процесса

• Понимание механизма работы стадии (удаление или инактивация? и т.п.)

• Исследуемые образцы должны быть оценены на цитотоксичность и влияние на тестовые систему

• Изучить распределение вирусной нагрузки по различным фракциям (проскок нанесения; промывки; элюат)

• Оценка эффективности «старого» сорбента

• Оценка регенерации сорбента (carry over)

• Корректная статистическая обработка

• Корректное суммирование отдельных логарифмических факторов и анализ рисков

53. Определение параметров и демасштабирование выбранных стадий.

Для каждой стадии очистки/инактивации определяются критические параметры, влияющие на эффективность удаления/инактивации вирусов. Это может включать:

* Фильтрация: Размер пор фильтра, давление, скорость потока.

* Хроматография: Тип смолы, буфер, градиент элюции.

* pH-инактивация: pH, время, температура.

* Сольвент/детергентная обработка: Тип и концентрация сольвента/детергента, время, температура.

Цель: Выявить параметры процесса, которые могут влиять на эффективность стадии. По возможности сохранить параметры, как в производственном процессе, или обосновать худший случай для них.

1. Инактивация

Параметры процесса

• Время – чем дольше, тем полнее инактивация

• pH – чем ниже, тем эффективнее

• Концентрация детергента/растворителя – чем выше тем эффективнее

• Температура – чем ниже, тем медленнее инактивация

• Перемешивание – эквивалентно производственному

• Белки и липиды – могут влиять на процесс

Дополнение • Температура – минимально допустимая при производстве (потребуется контроль)

• Недопустим слишком маленький объем – может произойти неполная инактивация в каплях и т.п.

• Процесс динамический – надо оценивать в разное время.

2. Нанофильтрация

Параметры процесса

• Тип мембраны, производитель и т.п. – аналогично производственному

• Нагрузка на фильтр – не менее производственной

• Скорость фильтрации/трансмембранное давление – должны охватывать производственный диапазон

• pH, осмоляльность и др. – влияют на скорость и забивку

• Концентрация белка, олигомеры и т.д. – влияет на забивку фильтра

Дополнение

Чистота вирусного материала – не параметр производственного процесса, однако очень сильно влияет на забивку мембран

3. Хроматографические стадии

Хроматографические стадии не являются робастными стадиями (означает малое изменение выхода замкнутой системы управления при малом изменении параметров) с точки зрения удаления вирусов! Однако при правильном планировании могут вносить существенный вклад .

Параметры процесса

• Высота сорбента сохраняется, диаметр уменьшается до лабораторного

• Состав и параметры буферов – идентичны производственным или худший случай

• Скорость потока и объем промывок и элюции – худший случай

• Нагрузка на сорбент – как правило, увеличена относительно производственной

• Регенерация – оценка эффективности регенерации • Оценка работы «старого сорбента»

4. Оценка цитотоксичности

Цитотоксичность

• Необходимо определить влияние исследуемых образцов на тестовые клеточные линии

• Определяется минимальное разведение образца, при котором влияние не выявляется

• Если цитотоскичность высока, то LRV и эффективность стадии будет низкой, могут потребоваться дополнительные методы

Влияние на тестовые системы и вирусы

• Даже при низкой цитотоксичности образцы могут препятствовать заражению тестовых клеток вирусами (инактивировать, мешать связыванию и т.п.)

• Проводятся исследования с добавлением известного титра вируса.

53. Выводы по результатам исследований. Ограничения.

Выводы : я пиздатый, по результатам исследований вирусной безопасности должны включать:

• Эффективность выбранных методов: Демонстрация логарифмического снижения титра вирусов для каждого метода.

• Достигнутый уровень вирусной безопасности: На основе полученных LRV делается вывод о достигнутом уровне вирусной безопасности процесса.

• Оптимальные параметры процесса: Определяются наиболее эффективные параметры для каждой стадии очистки/инактивации.

• Робустность процесса: Оценивается способность процесса сохранять эффективность при небольших отклонениях параметров.

Ограничения:

• Модельные вирусы: Модельных вирусов не может быть идентичным всему спектру потенциальных вирусных контаминантов.

• Scale-down модель: Модель может не полностью отражать все сложности полномасштабного производства.

• Экстраполяция результатов: Перенос результатов, полученных в scale-down исследованиях, на полномасштабное производство может быть не всегда точным.

• Изменчивость вирусов: Вирусы могут мутировать и изменять свою устойчивость к методам удаления/инактивации.

Такое ощущение, что тут методы не нужны… Только если на что опираются выводы, но не методики

Подробнее:

1. Способы определения кол-ва вируса

ТКИД50 (TCID50) — 50% инфекционная доза для тканевой культуры – определяет активные вирусы по ответу тестовой клеточной культуры

qPCR - количественная ПЦР – количественно определяет наличие ДНК или РНК вируса в образце. При применении контролей и некоторой экстраполяции можно привести в соответствие с ТКИД50 • Применяется для подтверждения инактивации вируса, если «живой» вирус не обнаружен методом ТКИД50 • Дополнительная информация о стадии и т.п.

2. Фактор снижения вирусной нагрузки

LRV – Logarithmic Reduction Value – логарифмический фактор снижения вирусной нагрузки – RF (Reduction Factor) и т.п.

3. Статистическая обработка

Расчет доверительных интервалов в зависимости от метода определения метода вируса ( log10 [ТКИД50] = 6.38 ± 0.25)

• Не менее двух повторов каждой стадии для каждого из вирусов! Расчет стандартного отклонения и указание этого значения вместо доверительного интервала некорректен!

• Правильная оценка низких титров вируса. - Титр вируса не может быть равен нулю. Отсутствие ответа тестовой системы, говорит только о ее чувствительности, а не об отсутствии вируса!

4. Ограничения валидационных исследований

• LRV зависит от титра в стартовом материале + титр вируса в стартовом материале должен быть «адекватным»

• Демасштабированный процесс, скорее всего, будет отличаться от производственного Лабораторные штаммы вируса могут отличаться как между собой, так и от дикого штамма

• Стадии с одинаковым принципом действия и LRV < 1 не учитываются

• Небольшие различия в производственных параметрах могут приводить к большим различиям в снижении LRV за счет различных механизмов

5. Практические рекомендации

• Предварительная оценка рисков

• Противовирусные стадии закладываются на этапе R&D

• Максимально очищенный вирусный материал

• Открытое и всестороннее обсуждение работ с исполнителем, если работы ведутся с контрагентом!

Фильтрация

63. Тупиковая фильтрация. Основные понятия. Общий план строения тупикового фильтра и направления потока в корпусах.

Тупиковыми системами фильтрации называют такие, в которых весь поток продукта, входящий в установку, пропускается через фильтрационную перегородку. В таких фильтрах один вход и один выход.

Чтобы пройти через фильтр, поток весь должен пройти через фильтрационный материал и быть очищенным. (рис. 16). На перегородке задерживаются загрязнения из потока, перепад давления из-за этого растет относительно быстро. Все частицы, больше размера пор фильтра, задерживаются на поверхности, образуя осадок (кек). По мере накопления кека, сопротивление фильтра увеличивается, и скорость фильтрации падает. Процесс останавливается, когда фильтр полностью забивается или скорость фильтрации становится неприемлемо низкой.

Чтобы увеличить площадь фильтрации можно: увеличить сечение трубы, изменить геометрию перегородки. В любой промышленной фильтрационной системе прибегают, как правило, к обеим возможностям

Рисунок 16. Схема тупикового фильтра

Поток в этих фильтрах так, или иначе имеет перпендикулярное направление к фильтрующей поверхности. Имеются и такие, как на схеме, внутритрубные фильтры, но в подавляющем большинстве промышленных и бытовых фильтров прибегают к значительному расширению трубопровода (диаметр корпуса фильтра) и максимально увеличивают площадь перегородки, выполняя ее в виде мешков, глубинных и гофрированных патронов, наборов пластин и т.д., которые устанавливаются в этот корпус и уплотняются с помощью различных приспособлений и прокладок.

Примеры тупиковых фильтров:

· Дисковые

· Большинство патронных

· Нутч-фильтры

· Мешочные фильтры различной конструкции

· Рамные фильтры

· Барабанные вакуум-фильтры

· Многие другие…

63. Тангенциальная фильтрация. Основные понятия. Общий план строения тупикового фильтра и направления потока в корпусах.

В них поток разделяется на поток очищенного продукта и концентрат загрязнений. В тангенциальной системе фильтрации поток направлен вдоль фильтрующей поверхности. Одним из важных факторов нормальной работы такого фильтра – высокая линейная скорость вдоль поверхности. В качестве фильтрующего материала в таких системах используются высокотехнологичные микропористые мембраны. Принципиальная организация такого потока показана на рис. 17. Интенсивный поток не даёт загрязнениям осаждаться на поверхности мембраны и смывает их. В результате того, что часть потока проходит через мембрану и удаляется из фильтра в виде фильтрата (пермеата), образуется концентрат загрязнений, который сливается, или подается на следующий цикл тангенциальной очистки. Направления потока: Исходный раствор движется параллельно поверхности фильтра. Пермеат проходит перпендикулярно фильтру или под углом, а ретантат продолжает двигаться вдоль мембраны.

Для таких систем применяются фильтрующие поверхности больших площадей, т.к. пропускная способность применяемых мембран мала, чтобы обеспечить достаточную производительность, применяют рулонные системы модулей, или половолоконные системы, и, кроме того, такие системы требуют применения высоких уровней давления для нормальной работы.

Рисунок 17. Принципиальное устройство тангенциальных фильтров

Применяются системы тангенциальной фильтрации в основном в самых тонких процессах сортировки макромолекул биополимеров (ультрафильтрация), для удаления вирусных частиц (нанофильтрация), для замены буфера, в котором растворены молекулы биополимеров (диафильтрация), для концентрирования, для обессоливания воды (обратный осмос). Такие мембраны имеют сечения пор, измеряемые в единицах нанометров.

Примеры тангенциальных фильтров:

· Половолоконные ультрафильтры

· Модульная фильтрация

· Обратноосмотические установки

63. Глубинные патроны «свечного типа». Структура. Преимущества и недостатки.

Глубинные патроны "свечного типа" представляют собой цилиндрические фильтрующие элементы, изготовленные из различных материалов, таких как полипропилен, полиэстер, стекловолокно, спрессованные в плотную структуру. Фильтрация происходит по всему объему патрона, а не только на поверхности, как у мембранных фильтров. Структура материала патрона имеет градиентную плотность: наружные слои более пористые для задержки крупных частиц, а внутренние – более плотные для улавливания мелких частиц. Это обеспечивает высокую грязеемкость. Фильтрующий слой, как правило, 20 мм и направление потока снаружи - внутрь. Эти патроны выпускаются для обеспечения возможностей работы с большими потоками различной высоты (обычно 250 мм, 500 мм, 750 мм и 1000 мм).

Толщина фильтрующего слоя таких патронов зависит от характера фильтрационного материала. Фильтрационный слой (обычно толщина его составляет 20-25 мм) может быть образован из волокна, намотанного на перфорированный сердечник патрона, тесьмы, специальных нетканых материалов. Некоторые глубинные патроны не имеют сердечника, если фильтр изготавливают по специальным технологиям, которые позволяют создать пористый толстостенный цилиндр патрона достаточно прочным.

В ряду таких технологий – экструзия расплава полимера, пропитка волокнистого слоя связующими веществами, определяющими жесткость пористой структуры, спекание частиц, или волокон, образующих прочную самоподдерживающую структуру глубинного фильтрационного материала.

Такие патроны устанавливаются в различные корпуса, которые могут вмещать от одного до нескольких десятков патронов.

А) патрон, заглушенный с одной стороны, требует только уплотнения с одной стороны, где имеется специальный уплотнительный адаптер.

Б) патрон, открытый с обоих торцов, требует уплотнения в корпусе с двух сторон (такая конструкция патронов применяется на менее ответственных операциях очистки).

В) наиболее применимая в фармацевтических производствах конфигурация глубинного фильтропатрона свечного типа: пикообразная верхняя заглушка, байонетный уплотнительный адаптер с посадочным диаметром 56 мм, кольцевые прокладки №226.

Такие патроны применяются для:

- Удаление грубых осадков и мехпримесей.

- Снижения количества механических примесей.

-Снижения уровня мутности.

Преимущества: Высокая грязеемкость, что увеличивает срок службы патрона; Широкий диапазон рейтингов фильтрации; Разнообразие материалов для различных применений; Простота установки и замены; относительно низкая стоимость.

Недостатки: Одноразовое использование (обычно не регенерируются); Адсорбция некоторых компонентов фильтруемой жидкости, особенно на патронах из волокнистых материалов; Возможность миграции волокон фильтрующего материала в фильтрат; Ограниченная химическая стойкость некоторых материалов.

63. Экранные фильтры. Гофрированные фильтры. Способы гофрирования

Экранные фильтры применяют на более поздних стадиях очистки, чтобы эффективно контролировать содержание самых мелких частиц, которые способны проникать через глубинные фильтры и там, где основная масса загрязнений уже удалена. Экранные фильтры для промышленных установок, как правило, выпускаются в виде гофрированных патронов свечного типа. Гофрирование фильтрующего материала в таких фильтрах применяется для максимизации площади фильтрации. Чем больше площадь патрона доступная для потока, тем меньше перепад давления на фильтре, тем выше качество фильтрации и больше ресурс фильтра.

Общий принцип конструкции гофрированного фильтропатрона приведен на рис. 12. Такой патрон представляет собой два перфорированных цилиндра (сердечник и внешний корпус). Между ними уложен гофрированный фильтрующий материал. Материал гофрируется вместе с защитно-дренажными слоями, расположенными с обеих сторон фильтрующего материала. Сверху приварена заглушка, а снизу – уплотнительный адаптер. Если перед вами корпус для патронов конфигурации «код 7» - в него с равным успехом можно поставить и глубинный свечной, и экранный свечной патроны, если они имеют нужную конфигурацию посадочного гнезда, высота патронов также унифицирована.

Рисунок 12. Общий принцип устройства гофрированных фильтропатронов экранного типа и капсульная форма выпуска экранных фильтров

При работе с гофрированными фильтропатронами важно иметь виду, что эффективность фильтрации гофрированных фильтрационных материалов может очень сильно различаться.

Как уже отмечали выше, в современной биофармацевтике приоритет использования приобрели одноразовые устройства. Поэтому экранные фильтры, применяемые в этом секторе производства, тоже производятся в капсульном исполнении, т.е. представляют собой готовые фильтрационные устройства с пластиковым корпусом, входным и выходным соединительным патрубками, вентильным и дренажным кранами. Внутреннее устройство таких изделий однотипно. Гофрированный патрон с плоской верхней заглушкой просто вварен в пластиковый корпус.

Типы экранных фильтров:

· Немембраные (нетканные материалы из волокна) - Соединение слоя волокон в листовую пористую структуру различными способами

· Мембранные (микропористые мембраны) - гомогенные, непрерывные- Образование сетчатой структуры фильтра из раствора полимера в тонком слое (коагуляция, конденсация молекул полимера)

Гофрированные экранные фильтры из волокон

Большинство гофрированных патронов с уровнями эффективности удаления частиц 98-99,99% производятся из так называемого, каландрированного материала. Этот материал производят путем прокатки волокнистого полипропиленового мата (равномерно распределенного в слое волокна) через горячие валки (процесс называют каландрированием). При этом температура достаточна, чтобы волокна полипропилена уплотнились и спеклись в местах контакта волокон друг с другом. Чем тоньше волокно, из которого состоит каландрируемый мат, тем более тонкую фильтрацию может обеспечить производимый материал.

Очевидно, что после прокатки отдельные волокна сделались уплощенными, места контакта волокон сварены. Видно, что разброс в размере и форме пор этого материала довольно значительный. Именно поэтому даже лучшие из таких материалов могут достигать устойчивой и воспроизводимой эффективности удаления частиц 99,98% но, как правило, не более. Такая эффективность является высокой в случае мех. примесей и совершенно недопустима в случае задержания клеток. Поэтому для задач, связанных с необходимостью удаления микроорганизмов, или снижения содержания бактерий с воспроизводимой и устойчивой эффективностью волокнистые фильтры не годятся.

Такие патроны применяются для:

- удаления тонких механических примесей;

- тонкой очистки растворителей и вспомогательных потоков;

- предварительной фильтрации для защиты фильтров из микропористых мембран.

Для удаления бактерий применяют экранные гофрированные фильтры с принципиально другими материалами, произведенными по гораздо более сложной технологии – микропористые мембраны.

Гофрированные экранные фильтры из микропористых мембран

Микропористые мембраны (ММ) на сегодняшний день являются наиболее высокотехнологичным и продвинутым классом фильтрационных материалов. Технологии их производства позволяют создавать материалы с заранее заданными свойствами. Специальные материалы мембран позволяют разделять объекты даже с размерами на уровне атомных радиусов.

Пористая структура тонких пленок ММ может создаваться за счет нескольких физико-химических процессов, главными из которых являются формование из растворов и расплавов полимеров. Сущность основных процессов производства ММ состоит в строго контролируемом процессе конденсации молекул полимеров из особых растворов и расплавов. При такой конденсации за счет снижения концентрации растворителя в растворе полимера, или снижения температуры расплава молекулы агрегируют и образуют микропористый слой. Структура пор при этом образуется практически на молекулярном уровне полимерного материала. За счет реализации такой тонко управляемой технологии перехода жидкой фазы полимерного материала в твердую получают пористые пленки с очень узким распределением сечения микропор. Размер и конфигурация пор могут контролироваться за счет концентрации и состава раствора полимера и условий конденсации.

Это монолитная прочная микрогубка с открытыми порами фиксированной геометрии. В этой структуре нет никаких сшивок нитей и волокон. От любой точки структуры до любой другой можно проследить непрерывный мостик из полимерного материала. Именно поэтому ММ предназначены для применения на самых ответственных участках процессов очистки, в том числе и для финальной стерилизующей фильтрации.

Наиболее распространенными полимерами, на основе которых производят ММ для контроля микроорганизмов в водных растворах являются:

полиэфирсульфон (ПЭС),

полиамид (нейлон),

поливинилиденфторид (ПВДФ),

эфиры целлюлозы.

Каждый из этих полимеров, как конструкционный материал для ММ, имеет свой спектр химической совместимости, свои преимущества и недостатки. Например, ПЭС дает мембраны с максимальной производительностью на единицу площади фильтра, а мембрана из эфиров целлюлозы обладает минимальной сорбцией компонентов фильтруемых растворов.

Итак, благодаря очень узкому распределению диаметров сечения пор материал фильтров, изготовленных по технологиям конденсации полимера из растворов и расплавов, можно и нужно использовать для радикального сокращения содержания микроорганизмов в различных продуктах, или их полного удаления. Одним из важнейших факторов широкого применения ММ в фармацевтических технологиях является возможность проверки целостности мембранных пленок. В фармацевтическом и биотехнологическом производствах возможность и методология контроля процесса на всех этапах его проведения является одним из ключевых требований. Главное свойство ММ, которое позволяет осуществлять контроль их целостности – это очень узкий разброс сечения пор в полученном материалах. Чем меньше внутреннее сечение капилляра, тем выше капиллярная сила, удерживающая водяную пробку в поре.

63. Коллоидные загрязнения. Общие свойства коллоидов. Структура коллоидной частицы. Основные методы изучения коллоидов.

Коллоидные загрязнения: Это загрязнения, представленные коллоидными системами, которые состоят из мельчайших частиц (дисперсной фазы) равномерно распределенных в другой среде (дисперсионной среде). Размер коллоидных частиц варьируется от 1 нм до 100 нм (иногда до 1 мкм).

К какому состоянию вещества их отнести: Дисперсное состояние вещества

Дисперсная система: Дисперсионная среда (в чем диспергировано) ´ Дисперсная фаза (что диспергировано)

Дисперсное состояние вещества:

Грубодисперсные (взвеси), содержащие частицы размером более 1 мкм (10−3 мм);

Тонкодисперсные (коллоидные системы), в которых частицы имеют размеры от 1 мкм до 0,001 мкм (10−6 мм) = 1000 нм - 1 нм;

Монодисперсные и полидисперсные системы

Особые свойства дисперсных систем:

Взаимная нерастворимость;

Гетерофазность;

Большая поверхность раздела фаз;

Взаимодействие дисперсионной среды и дисперсной фазы

Степень Дисперсности (СД) численно равна числу частиц, которые можно плотно уложить в ряд на протяжении одного сантиметра (1 мкм = 10^4)

Получение высокодисперсных коллоидных систем:

· Измельчение: - коллоидные мельницы - ультразвук - метод инжекции

· Метод конденсации: Получение нерастворимых соединений путем реакций обмена, гидролиза, восстановления, окисления в сильно разбавленных растворах и в присутствии небольшого избытка одного из компонентов, получают не осадки, а коллоидные растворы

· Испарение металлов на электрической дуге в растворе

· Вариант метода конденсации - получение коллоидов путем замены растворителя, изменения его концентрации

Особый случай высокодисперсных коллоидных систем (Молекулярные коллоиды):

· Растворение высокомолекулярных соединений (ВМС) Мол. масса более 10000 г/моль;

· Истинные р-ры, но проявляют ряд характерных св-в коллоидов:

- Светорассеяние

- ДЭС

- Броуновское движение

- Адсорбция

- Адгезия

- Способность к высаливанию

· Пример:Белки, крахмал, пектины, казеин, высшие полисахариды и другие

При движении одной фазы относительно другой в коллоидной системе наблюдается скачок потенциала между жидкостью, непосредственно связанной с поверхностью частицы, и всей остальной жидкостью. Это явление называется электрокинетическим (или дзета -) потенциалом

Чем больше слой противоионов ДЭС (или чем больше ионов находится в диффузной части), тем больше значение ξ(дзета) – потенциала. Состояние дисперсной системы, при котором ξ –потенциал равен нулю, называется изоэлектрическим состоянием

От чего зависит дзета (ξ) – потенциал: Химическая природа дисперсионной среды и дисперсной фазы; Толщины ДЭС; Валентности электролита; pH раствора (если дзета потенциал по абсолютной величине близок к 30, то дисперсии стабильны)

Тонкодисперсные (коллоидные системы). Виды устойчивости:

Кинетическая - устойчивость к оседанию: Определяется способностью частиц к броуновскому движению. В качестве меры кинетической устойчивости принимается гипсометрическая высота, т.е. высота, на которой концентрация частиц уменьшается в 2 раза

Агрегативная - способность системы к сохранению постоянной дисперсности

Управление устойчивостью коллоидной системы:

· Влияние электролитов на устойчивость коллоидов носит сложный характер ´ В одних случаях ничтожные добавки электролита способны привести к нарушению устойчивости системы ´ В других - введение электролита способствует увеличению стабильности

· Роль стабилизаторов:Стабилизатор может иметь как ионную, так и молекулярную, часто, высокомолекулярную, природу ´ Ионная стабилизация коллоидов связана с присутствием малых концентраций электролитов, создающих ионные пограничные слои между дисперсной фазой и дисперсионной средой ´ Высокомолекулярные стабилизаторы (белки, полипептиды, поливиниловый спирт и другие). Адсорбируются на границе раздела фаз, они образуют сетчатые и гелеобразные структуры, создающие структурно-механический барьер объединению частиц. Такая стабилизация важна для стабилизации взвесей, паст, пен, концентрированных эмульсий

Коагуляция: Воздействие физических факторов: - при нагревании, - замораживании, - интенсивном перемешивании, - пропускании электрического тока, - освещении ´ Добавлении электролитов ´ Добавление коагулянтов (флокулянтов). Стабилизаторы в недостаточном количестве могут играть такую роль (Эффект сближения)

Эффект Тиндаля

Свечение оптически неоднородной среды вследствие рассеяния проходящего через нее света. Обусловлен дифракцией света на отдельных частицах или элементах структурной неоднородности среды, размер которых сравним длиной волны рассеиваемого света.

Общие свойства коллоидов:

Гетерогенность: Коллоидные системы состоят из двух и более фаз.

Дисперсность: Частицы дисперсной фазы очень малы.

Устойчивость: Коллоидные частицы не оседают под действием силы тяжести благодаря броуновскому движению и электростатическому отталкиванию.

Оптические свойства: Коллоидные растворы могут рассеивать свет (эффект Тиндаля).

Адсорбционная способность: Коллоидные частицы обладают большой поверхностью и могут адсорбировать различные вещества.

Отличительные свойства коллоидов

- способность к рассеиванию света;

- медленная диффузия частиц дисперсной фазы в дисперсионной среде;

- способность к диализу;

- относительная неустойчивость;

- наличие заряда частиц.

Электрокинетические оболочки частицы двойной электрический слой (ДЭС):

Структура коллоидной частицы (мицелла): Коллоидная частица (мицелла) состоит из ядра, адсорбционного слоя и диффузного слоя.

· Ядро: Центральная часть мицеллы, состоящая из агрегата атомов или молекул.

· Адсорбционный слой: Слой ионов, прочно связанных с поверхностью ядра. Он определяет заряд коллоидной частицы.

· Диффузный слой: Слой ионов, слабо связанных с ядром и компенсирующих заряд адсорбционного слоя.

Основные группы актуальных коллоидных загрязнений:

Бактериальные клетки ´

Клеточный дебрис (обломки клеток) ´

Денатурированные белки ´

Вирусные частицы ´

Мелкодисперсные взвеси ´

Металлические коллоиды ´

Микрокапли жиров, силиконов ´

Нерастворимые в воде продукты реакции разбавленных р-ров веществ

Основные методы изучения коллоидов:

Электронная микроскопия: Позволяет визуализировать коллоидные частицы и определить их размер и форму.

Ультрацентрифугирование: Разделяет коллоидные частицы по размеру и плотности под действием центробежной силы.

Динамическое рассеяние света (DLS): Определяет размер частиц по флуктуациям интенсивности рассеянного света, вызванным броуновским движением.

Электрофорез: Измеряет электрокинетический потенциал (дзета-потенциал) коллоидных частиц, который характеризует их устойчивость.

Нефелометрия и турбидиметрия: Определяют концентрацию коллоидных частиц по интенсивности рассеянного или поглощенного света.

Адсорбционные методы: Используются для определения удельной поверхности коллоидных частиц.

Оптические методы - оценивают степень светорассеяния по оси, перпендикулярной, или расположенной под каким-то определенным углом к направлению прохождениия света через определенный слой дисперной системы • Нефелометрия и турбидиметрия (от греч. nephele - облако, лат. turbidus-мутный и греч. metreo-измеряю)

Единицы измерения мутности

Формазин - единственный стандарт, который можно приготовить из контролируемых исходных веществ. Все прочие стандарты, альтернативные или вторичные следует контролировать по суспензиям формазина. Первичные стандарты мутности, получаемые прямым синтезом суспензии формазина приняты в водном хозяйстве и других связанных отраслях промышленности. ´ FNU (ЕМФ единицы мутности по фармазину) = FTU ´ NTU (Нефелометрические турбидиметрические единицы)

63. Методы удаления коллоидных частиц.

Удаление коллоидных частиц представляет собой сложную задачу из-за их малого размера и устойчивости. Для этого используются следующие методы:

1) Коагуляция и флокуляция:

Коагуляция: Процесс дестабилизации коллоидных частиц путем нейтрализации их заряда с помощью добавления коагулянтов (соли алюминия, железа, полиэлектролиты).

Флокуляция: Процесс агрегации дестабилизированных коллоидных частиц в более крупные хлопья (флоки) с помощью добавления флокулянтов (высокомолекулярные полимеры). Флоки легче удаляются методами осаждения или фильтрации.

2) Фильтрация: После коагуляции и флокуляции используется фильтрация для удаления образовавшихся флоков. Применяются различные типы фильтров:

Глубинные фильтры: Задерживают частицы в толще фильтрующего материала.

Мембранные фильтры: Задерживают частицы на поверхности мембраны.

Осветлительные фильтры: Используются для удаления мелких частиц и осветления жидкости.

Ультрафильтрация: Мембранный метод разделения, который позволяет удалять коллоидные частицы и макромолекулы.

Обратный осмос: Мембранный метод, который позволяет удалять даже самые мелкие коллоидные частицы и растворенные соли.

3) Электрокоагуляция: Метод, основанный на использовании электрического поля для дестабилизации и удаления коллоидных частиц.

4) Адсорбция: Используется для удаления коллоидных загрязнений с помощью адсорбентов (активированный уголь, силикагель). Выбор метода удаления коллоидных частиц зависит от их природы, концентрации, требуемой степени очистки и других факторов. Часто используется комбинация нескольких методов для достижения наилучшего результата.

Фильтровать на тупиковом фильтре?

Необходимо оценить массу дисперсной фазы в системе:

Если она приближается к 1% - снизить ее: - коагуляцией-декантацией - центрифугированием - грубой фильтрацией

Либо фильтровать на фильтре с тангенциальным потоком (ультрафильтре) с риском его забивки на некоторых коллоидных системах

Добиться такого же эффективного удаления коллоидов как фильтрацией одним центрифугированием, или коагуляцией невозможно при технологичных значениях центробежных сил

Поверхностный заряд пор фильтра Фильтрация с элементом хроматографии:

Частицы даже меньшие, чем диаметр поры, притягиваются к поверхности пор и друг к другу поэтому задерживаются благодаря разнице зарядов, происходит коагуляция на поверхности фильтра

Дополнительные свойства:

Механическое удаление некоагулированных коллоидов на фильтрах с абсолютной фильтрацией более 5 микрон бесперспективно! Лучше всего не более 1-2 мкм.

Лучше применять глубинные фильтры с модифицированным «+» зарядом с зета (дзета) потенциалом

Основной метода:

Для удаления коллоидных примесей средствами тупиковой фильтрации наиболее эффективны фильтры с модифицированным зарядом (положительным) зета-потенциалом с уровнем фильтрации 0,5 – 5,0 микрон (абсолютная фильтрация) и менее (выбор зависит от степени дисперсности коллоидной системы).

63. Пирогены и эндотоксины. Действие на организм. Химическая природа. Методы борьбы с эндотоксинами в растворах

Пирогенами называют вещества, при введении которых в полостные жидкости организма, наблюдается повышение температуры тела. Пирогенных веществ в окружающей среде - тысячи. Но рекордсменами по эффективности являются бактериальные эндотоксины.

Парентеральные препараты (предназначенные для ведения в полости организма), производимые промышленностью, не должны содержать микрочастиц, опасных химических примесей, они должны быть не только стерильными (не содержать микроорганизмов), но и не содержать следов их присутствия. Основным опасным пирогенным компонентом убитых бактериальных клеток являются бактериальные эндотоксины – компоненты клеточных оболочек большинства бактерий. Это молекулы, входящие во внешний слой билипидной оболочки бактериальной клетки – липополисахариды (ЛПС).

Два билипидных слоя (внешний и внутренний) с молекулярной ячеистой сеткой из пептидогликана, который тоже является мощным пирогеном. Молекулы эндотоксинов (ЛПС) занимают большую часть внешней поверхности бактерии.

Есть липополисахариды – значит здесь есть бактерии, нужно защищаться. У клеток организма есть довольно сложные биохимические цепочки реакций на появление ЛПС в крови, или полостных жидкостях. Эти реакции развиваются очень быстро и выражаются в возникновении лихорадочного состояния пациента, которому ввели загрязненный эндотоксинами (ЛПС) препарат. Такие лихорадочные состояния выражаются в резком подъеме температуры тела, учащении пульса, увеличении потоотделения, и т.д. Происходит ишемические повреждения и отказ органов. Эти состояния называются септическим шоком, или заражением крови.

Единица эндотоксина EU (ЕЭ)

Определяется как количество химически чистого эндотоксина, вызывающего определенный биологический эффект ´ Например выделенные чистые препараты эндотоксинов имеют разные эффекты: 1 EЭ это для чистых препаратов EC-5 = 100 пг EC-2 = 200 пг EC-O111B4 = 120 пг ´ Для удобства принято, что 1 ЕЭ равна 100 пг эндотоксина 1 пг = 1 Х 10-12 (одна триллионная часть грамма) ´ Это количество эндотоксинов (1EU) содержится примерно в 110 клетках грамотрицательных бактерий

Количественные и дозовые эффекты

Бактериальные эндотоксины являются исключительно активными (сильными) пирогенами. Для развития лихорадочного приступа достаточно присутствия бактериальных эндотоксинов в инфузионном растворе в концентрации 1 нг/мл (около 10 ЕЭ/мл) (1000 пг/мл) 1 нг = 10-9 г (одна миллиардная часть грамма) ´ Пороговой дозой эндотоксинов при применении инфузионных растворов, установленной многими фармакопеями считается 5 ЕЭ на 1 кг веса тела в час ´ Другие пирогены менее активны, и для развития пирогенного ответа их концентрация должна быть в 100-1000 раз больше

Нормы содержания эндотоксинов

На западных предприятиях, как правило, существуют внутренние границы уровня пирогенности, максимальное допустимое содержание в ВДИ по гель-тромб тесту (LAL) 0,25 Ед/мл. ´ Уровень тревоги ≥0,03 Ед/мл в ВДИ (детектируемый) ´ Уровень немедленных корректирующих действий ≥0,125 Ед/мл

Такие исключительно высокие по эффективности биологические реакции, вызываемые такими малыми дозами бактериальных ЛПС, очень редкий случай в биохимии. К сожалению, настолько чувствительных химических экспресс- методов обнаружения и измерения концентрации ЛПС на сегодняшний день нет. Поэтому в фармпромышленности широко применяется биологический тест.

Случайно было обнаружено, что лизат амебоцитов (клеток крови) реликтового ракообразного тропических морей мечехвоста Limulus polyphemus при контакте с ЛПС образует плотный гелеобразный сгусток. Чувствительность этой реакции поразила исследователей. Эта реакция надежно выявляла присутствие эндотоксинов (ЛПС) при их концентрации до 0,03 Ед/экв на 1 мл. Поэтому сейчас метод обнаружения ЛПС с использованием реактивов на основе лимфоплазмы мечехвостов является основным и называется ЛАЛ тест (LAL) от Limulus Amoebocytes Lysate.

Общие свойства бактериальных эндотоксинов – липополисахаридов:

-высокомолекулярные соединения,

-широкий спектр молекулярной массы от 2,5 до 1000 кДа,

-термоустойчивы, выдерживают многочасовое кипячение,

-проходят через мембраны с размерами пор 0,005 до 0,001 мкм,

-не теряют, а только увеличивают пирогенный эффект при гибели бактериальной клетки,

- молекулы полярны, способны к агрегации.

Химическая природа эндотоксинов: Эндотоксины состоят из трех частей:

* Липид А: Гидрофобная часть молекулы, отвечающая за токсичность.

* Олигосахарид: Соединяет липид А с полисахаридом.

* Полисахарид (О-антиген): Гидрофильная часть молекулы, определяющая иммуногенность.

* Длинный полисахаридный «хвост», экспонируемый в окружающую среду бактериальной клетки, определяющий химическую специфику данного класса ЛПС (специфическая цепь).

Общий для множества ЛПС полисахаридный кор, липид А с остатками жирных кислот. Именно липид А определяет полярную природу таких молекул, в структуре которого присутствуют фосфатные группы с выраженным отрицательным зарядом.

Что надо делать, чтобы не допустить появления пирогенов в препарате

Технологические подходы

Ø Максимально сократить время технологического цикла

ØИсключить хранение препарата и вспомогательных растворов и жидкостей при температуре, допускающей рост м/о

ØОрганизовывать глубокую обеспложивающую/стерилизующую фильтрацию препарата, или полупродукта при невозможности избежать такого хранения

ØОбеспечить эффективную фильтрацию, регулярное обслуживание и тестирование целостности фильтров на линии компрессорного сжатого воздуха

ØРегулярная стерилизация и проверка на целостность фильтров на вентиляции емкостей (дыхательных фильтров)

Инженерные мероприятия на оборудовании

Ø Регулярная инспекция технологических линий на предмет возможного образования застойных зон (Закон 3-х Øхуй забей)

ØИнспекция типов соединений на технологических линиях (резьбы в контакте с продуктом не допустимы!)

ØИнспекция технологического оборудования на наличие зон, не доступных физической очистке (щеткой, губкой, ершиком).

ØКонтроль точечной коррозии трубопроводов и емкостного оборудования, сварных швов. Регулярная реставрация и полировка всех поверхностей, контактирующих с препаратом надлежащими полировальным и материалами

Ø Ремонт сколов поверхностей эмалированных емкостей

Ø Использование только мембранных клапанов на линиях

ØИспользование только манометров с мембранными разделителями

При фильтрации растворов, содержащих эндотоксины, зная свойства этих молекул, можно контролировать их концентрацию, применяя фильтрационные материалы с положительным зарядом, или имеющие липофильные добавки. Положительные результаты дает фильтрация на материалах, содержащих активированные угли. Применяется и хроматографический контроль эндотоксинов.

Методы борьбы с эндотоксинами в растворах:

* Инактивация:

* Нагревание в сухом состоянии: Эффективно для термостабильных материалов и оборудования.

* Обработка щелочью: Эффективно, но может повредить некоторые вещества.

* Окисление: Например, пероксидом водорода.

* Удаление:

* Ультрафильтрация: Используются специальные ультрафильтрационные мембраны с размером пор, позволяющим задерживать эндотоксины.

* Адсорбция: На активированном угле, специальных смолах или других адсорбентах.

* Анионообменная хроматография: Эндотоксины имеют отрицательный заряд и могут быть удалены с помощью анионообменных смол.

63. Требования к фильтрации инъекционных и инфузионных препаратов. Технология стерильной фильтрации термостабильных и термолабильных препаратов.

Требования к фильтрации:

* Стерильность: Полное удаление микроорганизмов, включая бактерии, грибы и вирусы.

* Апирогенность: Удаление пирогенов, в частности эндотоксинов.

* Сохранение свойств препарата: Фильтр не должен взаимодействовать с препаратом и изменять его состав или активность.

* Отсутствие волокон и частиц: Фильтр не должен выделять в раствор частицы фильтрующего материала.

Инъекционные (SVP) и инфузионные (LVP) препараты

Инъекционные производятся в форме доз < 100 мл - флаконы, ампулы, пpенаполненные шприцы, стеклянные флаконы, или пластиковые емкости ´Инфузионные производятся в форме доз > 100 мл - флаконы, пластиковые емкости или пластиковые пакеты

Финальная фильтрация инъекционных и инфузионных препаратов

´ Выбор уровня фильтрации зависит от применяемого метода стерилизации препарата

´ В мировой практике при финальной термической стерилизации упаковки препарата при финальной фильтрации допустимо фильтровать на мембранных фильтрах 0,45 мкм или обеспложивающих фильтрах 0.2 мкм

´ При асептическом розливе и финальной стерилизующей фильтрации без термической стерилизации используются только валидированные для финальной стерилизующей фильтрации фильтры 0,2 микрона

Стерилизующая фильтрация – технология, которая широко применяется в биофармацевтических производствах, продукты которых часто термолабильны (не выдерживают термической стерилизации). Она применяется практически на всех производствах инъекционных и инфузионных препаратов, офтальмологических и назальных препаратов. В широком смысле, для всех препаратов, вводимых во авнутренние полости организма (парентерально). Микропористые мембраны (ММ), разработанные для финальной стерилизующей фильтрации, должны обладать рядом специальных свойств, о которых пойдет речь в этом разделе. “Подходящий фильтр стерилизующей квалификации – это фильтр, который воспроизводимо удаляет все микроорганизмы из технологического потока, производя стерильный фильтрат”.

Это означает, что ответственность за возможное количество бактерий лежит на технологе производства. Применение стерилизующих микропористых мембран:

- Финальная фильтрация инфузионных и инъекционных препаратов перед наполнением первичной упаковки.

- Стерилизация промежуточных продуктов производства перед хранением.

Основные осложнения:

´ Термическая стерилизация является предпочтительным методом по сравнению со стерилизующей фильтрацией

´ Фильтры используются в составе стерильной системы ´ Фильтры должны быть отвалидированными на этой позиции

´ Фильтры необходимо тестировать на целостность

Технология стерильной фильтрации:

Термостабильные препараты:

* Могут быть стерилизованы термически (автоклавирование) до или после фильтрации.

* Фильтрация обычно проводится через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм.

Термолабильные препараты:

* Не могут быть стерилизованы термически.

* Стерилизация достигается путем асептической фильтрации через стерильные мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм или 0,1 мкм.

* Весь процесс фильтрации должен проводиться в асептических условиях для предотвращения контаминации.

* Валидация процесса стерильной фильтрации является обязательной для обеспечения его надежности.

Общие этапы стерильной фильтрации:

* Подготовка раствора: Раствор должен быть осветлен и очищен от крупных частиц перед стерильной фильтрацией.

* Стерилизация фильтра: Фильтр стерилизуют автоклавированием, гамма-облучением или другими методами.

* Фильтрация: Раствор пропускают через фильтр под давлением

. * Контроль стерильности: Проводятся тесты на стерильность фильтрата.

* Хранение: Стерильный фильтрат хранится в стерильных условиях.

63. Стерилизующий фильтр. Определение. Послойная организация стерилизующего фильтра. Основные параметры эффективности стерилизующего фильтра. Факторы, влияющие на эффективность задержания микроорганизмов.

Подходящий фильтр стерилизующей квалификации – это фильтр, который воспроизводимо удаляет все микроорганизмы из технологического потока, производя стерильный фильтрат

Стерилизующий фильтр — это фильтр, предназначенный для удаления или уничтожения микроорганизмов из жидкости или газа в процессе их фильтрации.

Послойная организация стерилизующего фильтра

Стерилизующие фильтры состоят из нескольких слоев материалов, каждый из которых выполняет определенную функцию по задержанию микроорганизмов. Основная структура включает:

1. Мембранный слой — основной слой, который непосредственно отвечает за фильтрацию и стерилизацию. Это может быть пористая мембрана с очень мелкими порами, способными задерживать даже самые мелкие микроорганизмы, такие как бактерии и вирусы.

2. Предфильтр — дополнительный слой, который задерживает крупные частицы (мембрана 0,45 мкм), тем самым предотвращая забивание мембраны и увеличивая срок службы основного фильтрующего элемента.

3. Абсолютный предфильтр - (1,0 – 1,2 мкм) разгрузка фильтра 0,45 мкм

Основные параметры эффективности стерилизующего фильтра

Не совсем понятен вопрос… Сформулирован через жопу, а в лекциях и методичке ровно 0 информации

Можно трактовать в следующем ключе, тк основная движущая сила - перепад давления, а он зависит:

От размера пор фильтропатрона

От пористости фильтропатрона

От толщины фильтрационного материала

От площади фильтрации фильтропатрона

От способа укладки материала в патроне

От потока, который подают на фильтр

От вязкости фильтруемого продукта

Или если опираться на другие данные и несколько слайдов про эффективность удаления мех примесей (на слайде КОЕ, а речь идет относительно бактериальных частиц, значит подходит)

Показатели эффективности работы фильтров для контроля мехпримесей (частиц) (КОЕ – колониеобразующая единица)

Бета-соотношение: количество частиц на входе в фильтр, отнесенное с их числом на выходе (в расчете на единицу объема).

Номинальный фильтр β ratio < 1000

Абсолютный фильтр β ratio > 1000

Основные параметры, которые влияют на эффективность стерилизующего фильтра:

1. Размер пор — критически важен для того, чтобы фильтр мог задерживать определенные микроорганизмы. Стандартно стерилизующие фильтры имеют поры размером от 0,1 до 0,3 мкм, что достаточно для задержания большинства бактерий.

2. Производительность фильтра — это скорость, с которой жидкость или газ могут проходить через фильтр. Производительность зависит от диаметра пор и площади фильтра.

3. Процесс разрушения микроорганизмов — для некоторых фильтров важно не только механически задерживать микроорганизмы, но и уничтожать их, что требует наличия дополнительных антимикробных свойств материала (или их использование совместно с термической стерилизацией) .

4. Совместимость с обрабатываемой средой — материал фильтра должен быть химически инертным по отношению к веществам, через которые происходит фильтрация (например, растворителям или биологическим жидкостям).

5. Долговечность и стабильность фильтра — фильтр должен сохранять свою эффективность на протяжении всего срока службы, не теряя свои фильтрующие свойства.

Факторы, влияющие на эффективность задержания микроорганизмов

Эффективность задержания микроорганизмов мембраной зависит от следующих факторов:

1. Толщина мембраны

Толщина мембраны влияет на путь, который должны преодолеть микроорганизмы для прохождения через нее.

• Более толстые мембраны обеспечивают более высокий уровень задержания, так как увеличивается вероятность столкновения микроорганизмов с барьером.

• Более тонкие мембраны могут быть менее эффективными, но их сопротивление потоку жидкости ниже, что важно для производительности.

2. Геометрия пор

• Размер пор: Чем меньше размер пор, тем эффективнее мембрана задерживает микроорганизмы. Если размер пор меньше размера микроорганизмов, они не могут пройти через мембрану.

• Форма пор: Неправильная форма или извилистая структура пор увеличивает вероятность задержания частиц за счет механического захвата.

• Распределение пор: Равномерность пор обеспечивает предсказуемую фильтрацию. Наличие больших пор может снизить эффективность.

3. Заряд поверхности пор

• Заряд поверхности мембраны влияет на взаимодействие с микроорганизмами, которые также могут иметь заряд.

  • Электростатическое отталкивание: Если заряд мембраны и микроорганизмов одинаков (например, оба отрицательные), это препятствует прохождению частиц через поры.

  • Электростатическое притяжение: Если заряды противоположны, микроорганизмы могут осаждаться на поверхности мембраны, что увеличивает эффективность задержания.

• Химическая модификация мембран позволяет регулировать заряд поверхности для повышения селективности.

72. Требования gmp к организации стерилизующей фильтрации в фармпроизводстве при асептическом наполнении.

Опять же ответ кайф да и только, по GMP в оригинале, фильтрация не сдалась никому

Предфильтрация должна обеспечивать поступление на стерилизующий фильтр продукта с обсемененностью менее 10 КФЕ/100 мл. (КФЕ =КОЕ)

Только тогда стерилизующие свойства финальной мембраны будут реализованы в полной мере

Средний по рынку патрон 10” (0,7 м² ) обязан выдерживать нагрузку 7 х 10 ¹⁰ клеток. Если такую обсемененность соблюдать это 7 х 10 ⁸ л 10 000 куб м.

1. Подбор стерилизующих фильтров

• Размер пор фильтра должен быть подходящим для задержания микроорганизмов, что обычно предполагает поры диаметром 0,2 мкм или меньше для обеспечения стерильности. Это гарантирует, что фильтр будет эффективно задерживать бактерии и другие микроорганизмы, которые могут загрязнить препарат.

• Материал фильтра должен быть химически инертным, не вступать в реакции с продуктом и не выделять токсичные вещества в процессе эксплуатации. Обычно используются фильтры, изготовленные из полиэфирных или полиамидных материалов.

2. Процесс стерилизации фильтров

• Предстерилизация фильтров: Перед использованием фильтры должны быть стерилизованы, обычно методом автоклавирования или с применением стерилизации газом (например, оксидом этилена), в зависимости от характеристик материала фильтра.

• Подтверждение стерильности: Прежде чем фильтры используются в процессе, их стерильность должна быть проверена с помощью микробиологического тестирования (например, метода контроля стерильности фильтра).

3. Условия эксплуатации фильтров

• Проверка целостности фильтров перед и после использования (например, с помощью теста на интегритет, такого как тест диффузии или тест давления). Это позволяет убедиться, что фильтры не повреждены и не пропускают микроорганизмы.

• Использование фильтров в процессе асептического наполнения должно происходить в условиях чистых помещений (clean rooms), где поддерживается необходимый уровень чистоты и стерильности. Стерилизация и фильтрация должны выполняться в строго контролируемых условиях.

4. Мониторинг и контроль процесса

• Регулярное мониторирование фильтрации и условий, в которых она осуществляется (например, давление, температура, скорость потока). Эти параметры должны быть записаны и проверены для подтверждения соответствия стандартам.

• Запись параметров: Вся информация о процессе стерилизации фильтров, их проверке на целостность и испытаниях должна быть документирована и сохраняться для подтверждения соответствия требованиям GMP.

5. Риск-ориентированный подход и документация

• Весь процесс должен быть документирован, с подробным описанием этапов, начиная от выбора фильтра и его стерилизации, до тестирования и эксплуатации. Документация должна быть доступна для проверок и аудитов.

• Риск-ориентированный подход в плане оценки потенциальных рисков на каждом этапе процесса, включая возможное загрязнение фильтров и их неэффективность. Это требует тщательного контроля и тестирования каждого этапа, чтобы избежать риска микробного загрязнения.

6. Технические требования к оборудованию

• Оборудование для фильтрации должно быть сертифицировано и проверено на соответствие стандартам GMP. Также важно, чтобы оно было удобным для обслуживания, что включает в себя возможность легкой очистки и замены фильтров.

73. Материалы мембран стерилизующих фильтров. Сравнение. Общие принципы выбора мембранного материала.

Трековые •Поликарбонатные •Полиэфирные

Нанесенные •Ацетат целлюлозы •Нейлон (полиамид) •Поливинилиденфторид •Полиэфирсульфон •Полиакрилонитрил

Растянутые •Фторопласт

1. Полиэфирсульфон (pes)

   • Преимущества: Высокая химическая инертность, устойчивость к большинству растворителей и агрессивных химических веществ, хорошая термостойкость, высокая механическая прочность.

   • Недостатки: Может быть менее устойчив к длительному воздействию ультрафиолетового излучения и сильных окислителей.

   • Области применения: Часто используется в фильтрации воды, биологических жидкостей и фармацевтических растворов.

2. Полиамид (Нейлон)

   • Преимущества: Хорошая механическая прочность, высокая термостойкость и стойкость к растворителям, подходит для большинства стерилизационных процедур.

   • Недостатки: Может быть чувствителен к кислотам и щелочам, что ограничивает его применение в некоторых химически агрессивных средах.

   • Области применения: Подходит для фильтрации в фармацевтической и биотехнологической промышленности, в частности для фильтрации растворов и суспензий.

3. Полиэтилен (pe)

   • Преимущества: Высокая стойкость к химическим веществам, долговечность, устойчивость к воздействию растворителей.

   • Недостатки: Меньшая термостойкость по сравнению с другими материалами, может быть чувствителен к высокой температуре.

   • Области применения: Используется в фильтрации газа и жидкостей, которые не требуют высокой термостойкости.

4. Полипропилен (pp)

   • Преимущества: Высокая химическая стойкость, устойчивость к большинству кислот, щелочей, и растворителей, а также к температурным воздействиям до 80-90°C.

   • Недостатки: Низкая механическая прочность по сравнению с некоторыми другими материалами, может быть склонен к ползучести.

   • Области применения: Часто используется в фармацевтической и пищевой промышленности для фильтрации воды и других жидкостей.

5. Политетрафторэтилен (ptfe)

   • Преимущества: Исключительная химическая стойкость, устойчивость к высокими температурам и агрессивным химическим веществам, высокой механической прочности.

   • Недостатки: Высокая стоимость, ограниченная производительность, что делает его менее экономичным вариантом для некоторых применений.

   • Области применения: Используется в критичных процессах, где требуется максимальная стойкость к химическим и термическим воздействиям.

6. Целлюлоза (целлюлозные мембраны)

   • Преимущества: Недорогие, хорошо подходят для фильтрации водных растворов, легко поддаются стерилизации.

   • Недостатки: Чувствительны к воздействию органических растворителей и сильных щелочей, могут быть менее долговечными по сравнению с синтетическими мембранами.

   • Области применения: Чаще всего используются в биотехнологии, медицинских применениях и в фармацевтике для обработки водных растворов и некоторых жидкостей.

Сравнение материалов мембран стерилизующих фильтров

Общие принципы выбора мембранного материала

1. Состав и химическая среда фильтруемого вещества:

   • Если фильтруемая жидкость или газ содержит агрессивные химические вещества, предпочтение следует отдать мембранам из PTFE, PES или PP, которые обладают высокой химической стойкостью.

2. Температура процесса:

   • Для высокотемпературных процессов, таких как стерилизация, рекомендуется использовать материалы с высокой термостойкостью, например PES, PTFE или полиамид.

3. Требования к механической прочности:

   • Если процесс предполагает высокое давление или интенсивное механическое воздействие, следует выбрать мембраны с высокой механической прочностью, такие как полиамид или PTFE.

4. Тип микроорганизмов и эффективность стерилизации:

   • Мембраны, используемые для стерилизации жидкостей, должны иметь поры размером 0,2 мкм или меньше, чтобы эффективно задерживать бактерии и вирусы.

5. Стоимость материала:

   • Для менее требовательных процессов или больших объемов продукции можно использовать более дешевые материалы, такие как целлюлоза или полиэтилен.

6. Совместимость с процессом стерилизации:

   • Выбранный материал должен хорошо переносить процесс стерилизации (например, автоклавирование, радиационная стерилизация, стерилизация газами).

74. Тест бактериальной нагрузки.

Из лк прекрасная одна фраза.

Тест бактериальной нагрузки (Разрушающий тест) (ASTM F838-83) B.d. 10⁷ кл/см²

ASTM F838-83 — это стандарт, определяющий метод тестирования для оценки бактерицидной активности различных материалов и продукции. В контексте бактериальной нагрузки этот стандарт часто используется для:

1. Определения бактериальной нагрузки в образцах, включая медицинские изделия, хирургические инструменты, упаковку и другие стерильные материалы.

2. Оценки воздействия различных стерилизационных методов, таких как паровая стерилизация или облучение, на способность материала предотвращать рост бактерий.

B.d. (Bacterial Density) — бактериальная плотность или концентрация бактерий в образце.

10⁷ кл/см² — указывает, что на каждом квадратном сантиметре тестируемого материала должно быть присутствовать не менее 107 колониеобразующих единиц (CFU) бактерий, что соответствует высокому уровню загрязнения.

Тест бактериальной нагрузки — это лабораторное исследование, направленное на определение количества бактерий в образце. Этот тест необходим для оценки микробной чистоты и определения, соответствует ли объект стандартам безопасности, например.

Основные этапы проведения теста бактериальной нагрузки:

1. Подготовка образца: В случае жидкостей чаще всего используется метод фильтрации для отделения бактерий от жидкости.

2. Фильтрация

   • Применяется фильтр с порой определенного размера (например, 0,45 мкм или 0,2 мкм), который задерживает бактерии.

   • После фильтрации фильтр с бактериями помещается на питательную среду, где колонии бактерий могут развиваться.

3. Инкубация: Питательные среды с бактериями инкубируются в соответствующих условиях, чаще всего при температуре 37°C, чтобы стимулировать рост бактерий.

4. Подсчет колоний: После инкубации на питательной среде появляется множество бактериальных колоний, каждая из которых происходит от одной бактерии. Подсчет этих колоний позволяет оценить бактериальную нагрузку.

5. Результаты: Результаты могут быть представлены как общее количество бактерий на определенный объем (например, колонии на 1 мл образца) или как концентрация бактерий в других единицах измерения (например, CFU — колониеобразующие единицы).

75. Глубинная фильтрация.

Глубинная фильтрация — это процесс, используемый для удаления клеточной массы, микроорганизмов и других загрязнителей из жидкостей, таких как культуральные среды после ферментации, растворы и биопрепараты. Этот метод широко используется в биотехнологической промышленности для очищения жидкости от клеток, клеточных остатков и других твердых частиц, что имеет важное значение в производстве таких биопродуктов, как рекомбинантные белки, вакцины и ферменты.

Принцип работы глубинной фильтрации

В отличие от поверхностной фильтрации, при которой загрязняющие вещества задерживаются только на поверхности фильтра, глубинная фильтрация использует многослойную пористую структуру фильтра. Загрязнители захватываются не только на поверхности, но и внутри фильтра, что позволяет задерживать широкий диапазон частиц, включая мелкие, такие как микроорганизмы. Применяется при низких и средних уровнях дисперсности.

Глубинные фильтры могут использовать разные типы фильтрующих материалов, включая волокна, которые могут образовывать фильтрующие слои различными способами:

• Иглопробивка волокнистого мата (например, фильтры в виде мешков).

• Намотка волокнистого мата или тесьмы.

• Горячая навивка (melt-blown), при которой волокна формируются с помощью расплава материала.

• Импрегнирование (пропитка), когда фильтрующий материал пропитывается специальными веществами для повышения эффективности.

• Экструзия, при которой материал фильтра формируется через экструдер.

• Спекание волокна или частиц, когда материалы подвергаются нагреванию для создания плотной структуры.

Кроме того, для улучшения фильтрации и предотвращения проскока микроорганизмов рекомендуется использовать фильтры с модифицированным положительным зарядом и оптимизированным дзета-потенциалом, поскольку многие микроорганизмы и частицы имеют отрицательный заряд. Это позволяет фильтру «притягивать» частицы, улучшая эффективность его работы.

Преимущества глубинной фильтрации в биотехнологии

1. Высокая степень захвата загрязнителей: Глубинные фильтры могут улавливать широкий спектр загрязняющих частиц — от крупных клеток до мелких микроорганизмов, включая бактерии и вирусы.

2. Простота эксплуатации: Глубинные фильтры относительно просты в эксплуатации и могут работать при различных уровнях дисперсности.

3. Продолжительная работа без частой замены фильтра: За счет многоуровневой структуры фильтра, частицы задерживаются не только на поверхности, но и внутри структуры, что позволяет фильтру работать дольше без забивания.

Ограничения глубинной фильтрации при удалении клеток

1. Необходимость в больших площадях фильтрации при больших объемах ферментации:

   • При ферментации больших объемов (более 5 кубометров) возникает потребность в установке очень больших фильтрующих систем, что приводит к сложности проектирования и установке громоздкого оборудования.

2. Риск разрушения клеток на поздних стадиях фильтрации:

   • В процессе фильтрации, особенно на поздних стадиях, когда фильтрующий материал начинает забиваться, может возникнуть перепад давления, который может привести к разрушению клеток. Это особенно важно при удалении клеток из культуральных жидкостей в процессе их очистки.

3. Проскок загрязнителей из-за гидроударов:

   • При слишком высоком перепаде давления или гидроударах может произойти прорыв фильтра, что приведет к выходу загрязняющих частиц в фильтрат. Это важно учитывать, чтобы обеспечить постоянное качество продукции.

4. Необходимость постоянного мониторинга:

   • Для обеспечения надежности процесса необходимо следить за перепадом давления на фильтре и регулярно контролировать качество фильтрата. Это требует дополнительных усилий и системы контроля.

5. Подбор плотности фильтрационного материала:

   • Для эффективного удаления клеток и других частиц важно правильно подобрать плотность фильтрующего материала, чтобы минимизировать повреждение клеток при их отделении. Неправильно подобранные фильтры могут привести к механическому разрушению клеток или неэффективному удалению загрязнителей.

Рекомендации для оптимизации глубинной фильтрации в биотехнологии

• Использование фильтров с зарядом: Для повышения эффективности фильтрации рекомендуется использовать материалы с положительным зарядом, что улучшает удержание отрицательно заряженных частиц, таких как клеточные остатки и микроорганизмы.

• Контроль за перепадом давления: Важно регулярно мониторить перепад давления в системе, чтобы избежать повреждения клеток или фильтрации загрязняющих веществ.

• Использование фильтров с многоуровневыми структурами: Это позволяет эффективно захватывать более широкий диапазон частиц, минимизируя вероятность пропуска загрязнителей.

• Частая замена или очистка фильтров: В случае больших объемов ферментации, важно обеспечить регулярную очистку или замену фильтров для предотвращения их забивания и обеспечения стабильности процесса.

76. Применение мембранной фильтрации в процессах очистки продукта.

Кайф, после конкретных вопросов пошли общие… Тут что писать, ну всю перзу чисто… Применение мембранной фильтрации (гофрированных фильтров) в процессах дальнейшей очистки продукта (down-stream)

В биотехнологии мембранная фильтрация, включая использование гофрированных фильтров, играет важную роль в процессах очистки продукта, особенно на стадии downstream processing (дальнейшая очистка и обработка после основной биологической активности). Этот этап включает в себя очистку, концентрирование и подготовку конечных продуктов, таких как ферменты, белки, антитела, биомолекулы, а также других ценнейших компонентов, полученных в ходе биотехнологического производства.

Основные виды мембранной фильтрации, применяемые в биотехнологии:

1. Микрофильтрация (mf):

   • Применение: Для удаления крупных частиц, клеток, частиц или взвешенных твердых веществ из жидких биопродуктов.

   • Процесс: Часто используется для отделения клеток или крупных твердых частиц после процесса ферментации или культуры клеток.

   • Преимущества: Высокая производительность при относительно низких затратах энергии и химических реагентов.

2. Ультрафильтрация (uf):

   • Применение: Для удаления макромолекул, таких как белки, вирусы, и растворенных веществ среднего размера (например, молекулы с молекулярной массой 10–1000 кДа).

   • Процесс: Применяется для очистки культурных сред, разделения белков, концентрации биологически активных веществ и очистки от примесей (например, избыточных клеток или остаточных продуктов ферментации).

   • Преимущества: Обеспечивает высокую степень очистки, что особенно важно в биотехнологических процессах, где требуется максимальная чистота продуктов.

3. Нанофильтрация (nf):

   • Применение: Используется для удаления небольших растворенных молекул, таких как соли, органические соединения и мелкие молекулы, с молекулярной массой до 500–1000 Да.

   • Процесс: Это более специфичная технология фильтрации, которая применяется для удаления низкомолекулярных загрязнителей и улучшения качества продукта, например, в производстве биофармацевтических препаратов.

4. Обратный осмос (ro):

   • Применение: Для удаление растворенных солей и микроорганизмов с молекулярной массой выше 1 кДа.

   • Процесс: В биотехнологии обратный осмос часто используется в процессах очистки воды, которая используется для промышленных нужд или в качестве сырья для биопродуктов.

Применение мембранной фильтрации в биотехнологии (downstream processing):

1. Удаление клеток и клеточных остатков: На стадии дальнейшей очистки после ферментации мембранная фильтрация используется для отделения клеток и их остатков из культуральных жидкостей. Микрофильтрация или ультрафильтрация эффективно удаляют клетки, которые могут мешать последующим процессам очистки и концентрации биопродуктов.

2. Концентрация биопродуктов: Для концентрации белков, ферментов и других биомолекул, мембранная фильтрация позволяет концентрировать ценные компоненты, удаляя воду и другие растворенные вещества. Это особенно важно в биотехнологии, где стоимость конечных продуктов высока, и требуется увеличение концентрации активных веществ без их потерь.

3. Удаление нежелательных молекул: Ультрафильтрация и нанофильтрация позволяют удалить низкомолекулярные примеси, такие как соли, низкомолекулярные загрязнители или побочные продукты ферментации, которые могут снижать качество конечного продукта. Это улучшает чистоту и активность биологически активных веществ.

4. Точечная очистка белков и биомолекул: Мембранная фильтрация позволяет эффективно разделять белки, ферменты и антитела по размеру и молекулярной массе, что важно для получения чистых биофармацевтических продуктов. Например, на этапе очистки антител и других биопрепаратов мембранные технологии могут использоваться для удаления загрязняющих агентов, таких как эндотоксины, вирусы и другие микробные загрязнители.

Гофрированные фильтры: Гофрированные фильтры имеют уникальную структуру с увеличенной площадью фильтрации, что позволяет достигать более высокой пропускной способности при меньших гидравлических потерях. Это особенно важно для масштабных процессов очистки, где требуются большие объемы обработки при ограниченных энергозатратах. Они часто используются для финальной фильтрации и стерилизации продуктов. Такие фильтры представлены в виде патронов с несколькими фильтрами в патроне.

· Механическое гофрирование: Выполняется на специальных машинах путем продавливания материала между валами с определенным профилем. Этот способ позволяет создавать гофры различной формы и размера. Наиболее распространены гофры треугольной, трапециевидной и синусоидальной формы.

· Ультразвуковое гофрирование: Использует ультразвуковые колебания для создания гофр. Этот способ позволяет получить более точные и равномерные гофры, особенно на тонких материалах.

· Термическое гофрирование: Применяется для термопластичных материалов. Материал нагревается и деформируется с помощью нагретых валов или пуансонов.

77. Перепад давления на фильтре. Для чего необходимо и как его контролировать?

Перепад давления на фильтре — это разница между давлением на входе и выходе фильтрующего элемента. Он является важным показателем, который характеризует работу фильтрационной системы и помогает в мониторинге и управлении процессом фильтрации.

Давление (источники) Насосы - диафрагменные - поршневые - перистальтические - центробежные - шнековые - роторные - шестеренчатые

Напорные емкости

Гидростатическое давление

Зачем необходим перепад давления на фильтре:

1. Показатель состояния фильтра: Перепад давления является индикатором состояния фильтрующего элемента. Когда фильтры загрязняются или забиваются, сопротивление потоку жидкости или газа возрастает, что приводит к увеличению перепада давления. Это позволяет оперативно выявлять проблемы с фильтрацией, такие как:

   • Засорение фильтрующего материала.

   • Уменьшение эффективности фильтрации.

   • Потенциальная утечка загрязнителей через фильтр.

2. Оценка производительности фильтра: Поддержание оптимального перепада давления важно для обеспечения стабильной работы фильтра и оптимальной производительности системы. Слишком высокое или слишком низкое давление может указывать на ненормальные условия работы или на необходимость технического обслуживания фильтра.

3. Прогнозирование срока службы фильтра: Измерение перепада давления позволяет прогнозировать, когда фильтр будет нуждаться в замене или промывке. Увеличение перепада давления — это сигнал о том, что фильтр заполнился загрязнителями, и его необходимо очистить или заменить.

4. Контроль процессов фильтрации: В процессе фильтрации перепад давления позволяет контролировать, насколько эффективно происходит отделение твердых частиц или других загрязнителей. Например, в процессе мембранной фильтрации перепад давления напрямую связан с проходимостью и чистотой фильтруемой среды.

Как контролировать перепад давления:

1. Установка манометров: Для контроля перепада давления устанавливаются манометры на входе и выходе фильтра. Манометры измеряют давление в точках установки, и разница между показаниями этих манометров дает величину перепада давления.

2. Автоматизированные системы мониторинга: В современных системах фильтрации часто используются автоматизированные устройства для контроля перепада давления. Такие системы могут быть оснащены датчиками давления, которые передают данные в центральную систему управления. При достижении определенного порога перепада давления система может автоматически уведомить оператора о необходимости проведения обслуживания фильтра.

3. Регулировка потока: Некоторые системы могут регулировать поток через фильтр для поддержания оптимального перепада давления. Если перепад давления слишком велик, это может свидетельствовать о чрезмерном загрязнении фильтра, и поток можно уменьшить для предотвращения повреждения системы.

4. Чистка и обслуживание фильтров: Регулярный контроль перепада давления помогает определить, когда фильтры нуждаются в промывке, замене или техническом обслуживании. Если перепад давления достигает критического значения, это сигнализирует о том, что фильтр необходимо очистить или заменить.

5. Использование фильтров с различными характеристиками: В некоторых системах для контроля перепада давления выбираются фильтры с определенными характеристиками, которые подходят для конкретных условий работы. Например, в случае использования мембранных фильтров важно учитывать их проходимость, пористость и степень загрязнения.

Нормирование перепада давления:

1. Определение нормального диапазона: Для каждого типа фильтра и среды фильтрации существует определенный диапазон перепада давления, который является нормальным. Например, для гофрированных фильтров или мембранных фильтров перепад давления может варьироваться в зависимости от типа жидкости или газа, которая фильтруется, а также от размера пор и плотности материала.

2. Контроль в реальном времени: В некоторых случаях перепад давления контролируется в реальном времени для своевременного реагирования. Например, если перепад давления увеличивается сверх допустимого значения, система может автоматически прекратить фильтрацию или инициировать процесс очистки фильтра.

Причины изменения перепада давления:

• Засорение фильтра: Со временем фильтрующий материал забивается твердыми частицами, что увеличивает сопротивление потоку и вызывает рост перепада давления.

• Фильтрация высоковязких жидкостей: Вязкие жидкости требуют больших усилий для прохождения через фильтр, что может привести к увеличению перепада давления.

• Нарушение потока: Если фильтр работает при нестандартном или слишком высоком потоке, это может вызвать увеличенный перепад давления.

• Износ или повреждение фильтра: Поврежденный фильтр может привести к нерегулярному перепаду давления.

78. Моделирование производственной тупиковой фильтрации в лаборатории. Важные параметры для организации и масштабирования.

Моделирование производственной тупиковой фильтрации в лаборатории — это важный процесс для анализа и оптимизации работы фильтрационных систем на стадии разработки и масштабирования в промышленное производство. Лабораторное моделирование позволяет исследовать поведение фильтрационных процессов при различных условиях и определить ключевые параметры, которые должны быть учтены при организации и масштабировании производства.

Весь поток проходит через фильтр, попадая как бы в тупик

´ Чтобы увеличить площадь фильтрации можно : ✓ увеличить сечение трубы, ✓ изменить геометрию перегородки.

•В любой промышленной фильтрационной системе прибегают, как правило, к обеим возможностям

1. Перепад давления (δp):

   • Значение: Это разница в давлении между входом и выходом фильтра, которая является ключевым показателем эффективности фильтрации и состояния фильтрующего материала.

   • Контроль: Для лабораторного моделирования важно точно измерять перепад давления на каждом этапе фильтрации. Увеличение перепада давления сигнализирует о забивании фильтра, что помогает определить момент, когда требуется очистка или замена фильтрующего материала.

   • Масштабирование: В промышленном масштабе перепад давления будет влиять на выбор подходящего фильтра и параметров его работы, таких как скорость потока, пористость материала и плотность.

2. Скорость потока (q):

   • Значение: Это объем жидкости, который проходит через фильтр за единицу времени (например, литры в минуту или кубические метры в час). Скорость потока напрямую влияет на эффективность фильтрации.

   • Контроль: В лаборатории скорость потока регулируется с помощью насосов, и важно проверять, как изменение потока влияет на фильтрацию, скорость забивания фильтра и перепад давления.

   • Масштабирование: На производственном уровне необходимо учитывать, как скорость потока влияет на эффективность фильтрации и на размер фильтра, поскольку для больших объемов потока потребуется увеличенная площадь фильтрующей поверхности.

3. Температура и вязкость жидкости:

   • Значение: Температура жидкости и ее вязкость существенно влияют на скорость фильтрации и эффективность отделения частиц. Вязкие жидкости, такие как масла или суспензии, требуют большего усилия для прохождения через фильтр.

   • Контроль: Лабораторные эксперименты проводят при различных температурах и вязкостях, чтобы выяснить, как эти параметры изменяют эффективность фильтрации и перепад давления.

   • Масштабирование: В промышленности важно предусматривать эти параметры при проектировании фильтрационных систем для различных типов жидкостей.

4. Тип и характеристики фильтрующего материала:

   • Значение: Выбор фильтрующего материала (например, мембраны, тканевые фильтры, угольные фильтры и т. д.) зависит от характеристик фильтруемой жидкости и требуемой степени очистки.

   • Контроль: Лабораторное моделирование позволяет исследовать влияние различных фильтрующих материалов на эффективность процесса фильтрации, скорость забивания и перепад давления.

   • Масштабирование: При масштабировании важно учитывать, как выбранный фильтрующий материал будет работать на больших объемах жидкости, а также его долговечность и устойчивость к загрязнителям.

5. Размер частиц и концентрация загрязнителей:

   • Значение: Важным параметром является размер частиц, которые необходимо удалить, а также их концентрация в фильтруемой жидкости. Фильтрация твердых частиц требует особых условий и типов фильтров.

   • Контроль: В лаборатории важно исследовать влияние концентрации загрязняющих частиц на процесс фильтрации и эффективность удаления частиц из потока.

   • Масштабирование: При масштабировании системы важно учесть, как высокие концентрации загрязняющих частиц могут повлиять на срок службы фильтра и на интенсивность загрязнения.

6. Время фильтрации и накопление загрязнителей:

   • Значение: Время фильтрации влияет на объем обработанной жидкости и на интенсивность забивания фильтра. Чем дольше работает фильтр, тем выше вероятность накопления загрязнителей.

   • Контроль: В лабораторных экспериментах важно фиксировать время работы фильтра, перепад давления и степень очистки жидкости на разных этапах процесса.

   • Масштабирование: Для промышленного масштаба время фильтрации будет зависеть от желаемой степени очистки и производительности, что важно для оптимизации работы фильтрационной установки.

7. Скорость фильтрации (j):

   • Значение: Это скорость, с которой фильтруемая жидкость проходит через единицу площади фильтрующего материала. Для тупиковой фильтрации важно поддерживать оптимальную скорость, чтобы предотвратить слишком быстрое забивание фильтра.

   • Контроль: В лаборатории скорость фильтрации можно изменять, контролируя давление и поток. Это помогает определить оптимальные условия для фильтрации.

   • Масштабирование: В промышленном масштабе важна оптимизация скорости фильтрации для обеспечения максимальной эффективности при минимальных затратах энергии.

8. Объем фильтрационной установки (V):

   • Значение: Объем фильтрационной установки влияет на способность системы обрабатывать большое количество жидкости. Это также определяет выбор масштаба фильтра.

   • Контроль: В лабораторных моделях можно экспериментировать с различными объемами фильтрационных колонок, чтобы оптимизировать параметры.

   • Масштабирование: Для промышленного применения необходимо точно определить размер фильтра и его пропускную способность, что зависит от объема жидкости и требуемой скорости фильтрации.

Процесс моделирования в лаборатории:

1. Подготовка фильтрационной системы: В лабораторных условиях создается модель фильтрационного процесса с использованием небольших фильтров, манометров, насосов и других устройств для контроля параметров.

2. Проведение экспериментов: В рамках экспериментов проводят тесты на фильтрацию жидкости, меняя параметры, такие как давление, скорость потока, температура, вязкость, тип фильтра и концентрация загрязняющих веществ.

3. Анализ данных: Полученные данные (перепад давления, время фильтрации, степень очистки и другие параметры) анализируются для оптимизации работы фильтрационной системы.

4. Моделирование масштабирования: Полученные результаты могут быть использованы для разработки расчетных моделей для масштабирования процесса фильтрации в промышленных масштабах.

79.Основные элементы фильтрационной системы и их назначение.

Основные элементы фильтрационной системы и их назначение:

1. Насос:

   • Назначение: Насос создает движущую силу для процесса фильтрации. Он создает разницу давления до и после фильтра, что позволяет фильтруемой среде двигаться через фильтрующий элемент. Насос может быть центробежным, мембранным или поршневым, в зависимости от требуемых характеристик потока и давления.

2. Корпус фильтра:

   • Назначение: Корпус фильтра представляет собой контейнер, в котором размещается фильтрующий элемент. Он обеспечивает дополнительный объем по сравнению с трубопроводом, что позволяет устанавливать фильтрующий элемент с большой рабочей поверхностью. Также корпус фильтра служит для надежного уплотнения фильтрующего элемента, предотвращая проскок потока мимо него и обеспечивая максимальную эффективность фильтрации.

3. Фильтрующий элемент (фильтр ёпта):

   • Назначение: Фильтрующий элемент является основным компонентом системы, обеспечивающим физическое разделение частиц и жидкости. Он состоит из пористого материала, такого как ткань, мембрана, уголь или другие фильтрующие материалы, с заранее заданными характеристиками (размер пор, пористость, площадь фильтрации). Этот элемент задерживает загрязняющие частицы, обеспечивая чистоту отфильтрованной жидкости. Фильтрующий элемент может быть одноразовым или многоразовым в зависимости от типа материала и процесса.

4. Питающая емкость:

   • Назначение: Питающая емкость предназначена для хранения и подачи нефильтрованной жидкости или суспензии в систему фильтрации. Это резервуар, из которого насос забирает жидкость и направляет её в фильтрующую установку. Важно, чтобы емкость была герметичной, предотвращая загрязнение среды.

5. Приемная емкость:

   • Назначение: Приемная емкость служит для сбора отфильтрованной жидкости после прохождения через фильтр. Это может быть накопительный бак, который собирает очищенную жидкость, готовую к дальнейшей обработке или использованию. Размер емкости зависит от объемов потока и необходимой скорости фильтрации.

6. Трубопроводы:

   • Назначение: Трубопроводы соединяют все элементы фильтрационной системы (питающую и приемную емкости, насос, фильтры и клапаны). Они обеспечивают поток жидкости через систему, направляя её к фильтру, отфильтрованную жидкость к приемной емкости, а также позволяют проводить обратные потоки для промывки фильтров. Трубопроводы могут быть оснащены дополнительными функциями для управления потоком, такими как регулирующие клапаны или вентили.

7. Клапаны:

   • Назначение: Клапаны, такие как краны и вентили, позволяют управлять потоком жидкости в различных частях фильтрационной системы. Они могут быть использованы для регулировки потока, направления жидкости, изменения давления, а также для остановки процесса фильтрации или переключения между различными режимами работы. Клапаны обеспечивают возможность чистки фильтра, работы в обход или изменения параметров процесса.

8. Контрольно-измерительные приборы:

   • Назначение: Эти приборы предназначены для мониторинга различных параметров в процессе фильтрации, таких как давление, температура, турбулентность и другие. Манометры измеряют давление в разных точках системы, термометры — температуру, а такие приборы как турбидиметры и UV-анализаторы — могут использоваться для контроля качества отфильтрованной жидкости (например, измерение мутности или содержания органических веществ). Контролирующие приборы позволяют оперативно корректировать процесс фильтрации для достижения оптимальных результатов.

80. Методы удаления частиц из суспензии.

Великий вопрос, щикарный….

Основные методы удаления частиц из суспензий в промышленной биотехнологии:

1. Мембранная фильтрация (ультрафильтрация, микрофильтрация, нанофильтрация, обратный осмос):

   • Принцип: Мембранная фильтрация использует мембраны с пористостью, которая позволяет разделять частицы по размеру. Мембраны могут быть с различными размерами пор, в зависимости от задачи: от микрофильтрации для удаления крупных частиц до нанофильтрации и обратного осмоса для более мелких частиц и молекул.

   • Применение: Ультрафильтрация и микрофильтрация широко используются для отделения клеток, макромолекул, белков и других крупных частиц из культур микроорганизмов или клеток. Обратный осмос применяется для удаления растворенных веществ, таких как соли и органические молекулы.

   • Преимущества: Высокая точность отделения, возможность работы с большими объемами, хорошая производительность.

   • Недостатки: Может потребоваться регулярная очистка мембран, что требует дополнительных затрат.

2. Центрифугирование:

   • Принцип: Центрифугирование использует центробежную силу для разделения частиц в суспензии в зависимости от их плотности. Часть частиц осаждается на дне в виде осадка, а другая часть (например, сверхтонкие частицы или раствор) остается в растворе.

   • Применение: Этот метод широко используется в биотехнологических процессах для удаления клеток (например, в производстве биопрепаратов) или для очистки от субмикронных частиц. Применяется для выделения клеток и биомасс из жидких сред, а также для удаления органических или неорганических загрязняющих веществ.

   • Преимущества: Высокая скорость обработки и хорошая эффективность для широкого диапазона частиц по размеру.

   • Недостатки: Требует высококачественного оборудования и определенных энергетических затрат.

3. Флотация:

   • Принцип: В этом процессе используется пузырьковый газ (обычно воздух), который прикрепляется к частицам в суспензии, в результате чего они поднимаются на поверхность и могут быть удалены.

   • Применение: Этот метод используется для удаления частиц с низкой плотностью, таких как клеточные оболочки, масла, жиры или угольные частицы. Он также эффективен для очистки воды или суспензий с органическими загрязняющими веществами.

   • Преимущества: Меньшие затраты энергии по сравнению с центрифугированием, простота в использовании.

   • Недостатки: Ограничена по эффективности для частиц с высокой плотностью или тех, которые плохо прилипают к пузырькам газа.

4. Фильтрация (глубокая фильтрация, гофрированные фильтры, фильтрация с применением активированного угля):

   • Принцип: Фильтрация состоит в прохождении суспензии через пористые материалы (фильтры), которые задерживают частицы на своей поверхности или внутри структуры.

   • Применение: В биотехнологии фильтрация используется для очистки жидкостей от клеток, биомассы, частиц и других загрязняющих веществ. Гофрированные фильтры и фильтры с активированным углем могут использоваться для очистки жидкости от мелких частиц и органических загрязнителей.

   • Преимущества: Простота и доступность технологии, возможность применения на различных стадиях процесса.

   • Недостатки: Может потребоваться частая замена фильтров, особенно при высокой нагрузке частиц.

5. Осаждение (гравитационное и химическое):

   • Принцип: Этот метод использует гравитацию для осаждения твердых частиц в суспензии, а также химические реагенты для ускорения процесса осаждения (например, флокулянты и коагулянты).

   • Применение: Осаждение часто используется для удаления крупных частиц или сгустков (например, в процессе очистки воды или в препаративной биотехнологии), а также в производстве биомасс или химических веществ.

   • Преимущества: Простой метод, часто используется для предварительной очистки перед другими более сложными методами.

   • Недостатки: Не всегда эффективен для мелких частиц, требует времени для осаждения.

6. Электрофильтрация:

   • Принцип: Этот метод использует электрическое поле для перемещения заряженных частиц в жидкой среде. Частицы с противоположным зарядом притягиваются к электродам, а частицы с одинаковым зарядом отталкиваются.

   • Применение: Применяется для удаления частиц из жидкостей в биотехнологии, особенно если частицы могут быть заряжены (например, вирусы, клетки или другие биологические частицы).

   • Преимущества: Эффективен для удаления мелких частиц, вирусов, биомолекул и клеток.

   • Недостатки: Высокие затраты на оборудование и сложность процесса.

7. Скрубберы и абсорбенты:

   • Принцип: Скрубберы (или абсорбенты) используют твердые или жидкие вещества для захвата и удаления частиц из газа или жидкости.

   • Применение: В биотехнологии может применяться для очистки газа, например, в процессе ферментации или для удаления летучих органических веществ.

   • Преимущества: Простой и эффективный способ очистки газов и жидкостей от загрязняющих веществ.

   • Недостатки: Требуют регулярной замены абсорбентов и могут быть менее эффективными для сложных смесей.

Выбор метода удаления частиц зависит от:

• Размер частиц и их распределение. Например, для крупных частиц может использоваться осаждение или гравитационная фильтрация, для мелких — мембранная фильтрация или центрифугирование.

• Концентрация частиц в суспензии. Высокая концентрация требует использования методов, которые могут эффективно обрабатывать большие объемы, например, мембранную фильтрацию или центрифугирование.

• Химическая природа частиц. Для удаления органических загрязнителей или биологических частиц могут использоваться методы, такие как флотация или абсорбция.

• Требования к чистоте конечного продукта. Для биотехнологических процессов, где необходима высокая степень очистки, применяются мембранные технологии и центрифугирование.