Концепция Quality by Design. Определение, основные черты и элементы.
QbD(качество на этапе разработки) – научно обоснованный и риск-ориентированный подход к разработке и производству [биологических лекарственных средств], применимый ко всем стадиям жизненного цикла продукта. Инициатива по внедрению подхода QbD в биофармацевтику была впервые выдвинута в 2002 году американской FDA.
Основные черты QbD:
Глубокое понимание продукта
Глубокое понимание процесса
Научно обоснованные решения
Управление рисками по качеству
Концепция:
QbD имеет 4 важнейших элемента:
Идентификация критических показателей качества (CQA)
Идентификация критических параметров процесса (CPP)
Установление связи между CQA и CPP
Установление соответствующей контрольной стратегии
Основные понятия QbD:
QTPP (quality target product profile=профиль целевого продукта по качеству) – набор ожидаемых показателей качества лекарственного препарата, который в идеале должен быть достигнут для обеспечения требуемого качества, принимая во внимание безопасность и эффективность ЛП. (Пример: Показатель-Дозировка; Целевое значение- 1000 мг на флакон, 40 мл с концентрацией 25 мг/мл)
CQA (critical quality attribute=критический показатель качества) – физическое, химическое, биологическое или микробиологическое свойство или характеристика продукта, которая должна находиться в определённом диапазоне для обеспечения желаемого качества продукта.
CPP (critical process parameter=критический параметр процесса), CMA (critical material attribute=критический показатель сырья) – параметр процесса или свойство сырья, вариабельность которых может воздействовать на CQA. Такой параметр должен мониторироваться или контролироваться для того, чтобы процесс производства обеспечивал надлежащее качество продукта (Идентификации риска Причинно-следственная диаграмма или диаграмма Исикавы (cause-and-effect diagram; fishbone diagram) )
Контрольная стратегия – набор контрольных установок, выведенных из текущего понимания продукта и процесса, обеспечивающий надлежащее протекание процесса и получение качественного продукта.
Контрольная стратегия включает:
Тестирование сырья и материалов
Параметры процесса производства
Внутрипроизводственный контроль
Тестирование фармацевтической субстанции и лекарственного препарата согласно утверждённой спецификации с помощью валидированных методов
Хроматография и масштабирование
История открытия жидкостной хроматографии. Понятие жидкостной хроматографии, принципы разделения, режимы процесса. Объекты хроматографической очистки в биотехнологии.
(Ебать мой хуй, спасибо, время охуительных историй об открытии хроматографии, впервые “ученый” нассал на песок и увидел фильтрацию, дальше стали мочить ткань, чтоб распределить по ней цвет)
Метод впервые использовался для разделения смеси пигментов растений (хлорофиллы, каротиноиды и ксантофиллы) с использованием колонки, наполненной адсорбентом (карбонатом кальция) и жидкого растворителя в 1903 г. русским ученым Михаилом Семеновичем Цветом.
Хроматография (от греч. chroma, родительный падеж chromatos— цвет, краска) – это физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении компонентов смеси между двумя фазами — неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную фазу, т.е. основу метода составляют процессы сорбции и десорбции.
ПО ОФС: Хроматографией называется метод разделения смесей веществ, основанный на их многократном перераспределении между двумя контактирующими фазами, одна из которых неподвижна, а другая имеет постоянное направление движения.
Неподвижная фаза может быть твёрдым веществом, жидкостью, нанесённой на твёрдый носитель или гелем. Неподвижная фаза может помещаться в колонку или наноситься в виде тонкого слоя или плёнки и т.п. Подвижная фаза может быть газом (ГХ), жидкостью (ЖХ) или сверхкритическим флюидом.
Подвижная фаза - поток жидкости, сверхкритического флюида или газа, перемещающий компоненты разделяемой смеси вдоль неподвижной фазы.
Неподвижная фаза - твёрдый сорбент или несмешивающаяся с подвижной фазой жидкость, на которых осуществляется дифференцированное удерживание и разделение компонентов смеси.
Адсорбент - твёрдый сорбент, концентрирующий на своей поверхности газы, пары или растворенные вещества.
Абсорбент - твёрдый или жидкий сорбент, растворяющий в своем объёме газы, пары или компоненты жидких смесей.
Сорбент - твёрдое вещество, жидкость или их смесь, способные поглощать или удерживать растворенные вещества.
Сорбат - вещество, удерживаемое сорбентом (в хроматографии - компонент разделяемой смеси).
Аналит - компонент, искомый или определяемый в пробе вещества или материала объекта аналитического контроля.
Хроматограмма - кривая, изображающая зависимость концентрации соединений, выходящих из колонки с потоком подвижной фазы, от времени с момента начала разделения.
Элюент - жидкость используемая в качестве подвижной фазы.
Элюат - подвижная фаза выходящая из колонки
Изократический режим - способ разделения, при котором состав элюента не изменяется
Градиентный режим - способ разделения, при котором состав элюента изменяется по определённой программе, увеличивая «силу» растворителя за счет изменения полярности, pH или ионной силы. Используется в случае необходимости разделения веществ, которые сильно отличаются по степени связывания с сорбентом
Система – в зависимости от контекста – сам жидкостной хроматограф («Система Аджилент с УФ-детектором»). – элюент («Приготовить систему вода – ацетонитрил, 60:40 (v/v)») – элюент вместе с конкретной колонкой («Получилась селективная система»)
Сорбция (от лат. sorbeo — поглощаю) — поглощение твёрдым телом либо жидкостью различных веществ из окружающей среды. Поглощаемое вещество, находящееся в среде, называют сорбатом, поглощающее твёрдое тело или жидкость — сорбентом. По характеру поглощения сорбата сорбционные явления делятся на два типа: адсорбцию — концентрирование сорбата на поверхности раздела фаз или его поглощение поверхностным слоем сорбента и абсорбцию — объёмное поглощение, при котором сорбат распределяется по всему объёму сорбента.
Адсорбция (лат. ad — на, при, в; sorbeo — поглощаю) —процесс увеличения концентрации растворённого вещества у поверхности раздела двух фаз
Абсо́рбция (лат. absorptio от absorbere — поглощать) — поглощение сорбата всем объёмом сорбента.
Нормально-фазовая хроматография
§ Жидко-твердофазная хроматография
§ Механизмы: и адсорбция и распределение
§ Сорбенты: § силикагель с диольными группами § силикагель с аминными группами § силикагель с нитрильными группами § силикагель (редко)
§ Сорбент всегда полярнее чем элюент
§ Разделяет низко- и среднеполярные вещества без заряда
§ Порядок выхода аналитов – сначала неполярные
§ Не разделяет неполярные (например, алканы)
Адсорбционная хроматография
§ Жидко-твердофазная хроматография
§ Аналит адсорбируется на поверхности сорбента
§ Взаимодействие слабое – силы Ван-дер-Ваальса, водородные связи, π- π взаимодействия
§ Сорбенты – силикагель, окись алюминия, силикат магния, модифицированные силикагели, полиамид, целлюлоза и т.д.
§ Порядок выхода аналитов – сначала неполярные
§ Сорбент полярный, элюент не полярный
§ Разделяет низко- и среднеполярные вещества без заряда § Не разделяет неполярные (например алканы)
С этого вида хроматографии все и начиналось. Были изучены разнообразные полярные органические и неорганические соединения. В результате из неорганики в жидкостной хроматографии (низкого давления) остался силикагель, окись алюминия и флоризил (Florisil – силикат магния). В ВЭЖХ –остался, по сути, только силикагель. При этом адсорбционная хроматография на не модифицированном силикагеле почти не применяется – плохо воспроизводится, могут быть «хвосты» и т.д.
Распределительная хроматография
§ Жидко-жидкофазная хроматография
§ Аналит распределяется между подвижной и неподвижной жидкими фазами
§ Сорбенты – вода на поверхности силикагеля, окиси алюминия, силиката магния, модифицированные силикагели, полиамиды, целлюлоза и т.д.
§ Сорбент полярный, элюент не полярный
§ Разделяет полярные соединения
§ Порядок выхода аналитов – сначала неполярные
§ Не разделяет неполярные соединения
§ В классическом варианте – тройные системы типа H2O – iPrOH – гексан H2O – MeOH – CHCl3
Обращённо-фазовая хроматография
§ Жидко-твердофазная хроматография
§ Механизмы: гидрофобные взаимодействия, адсорбция и распределение
§ Сорбенты: § силикагель с алкильными группами (С2, С4, С8, С18...) § силикагель с другими гидрофобными группами § силикагель с нитрильными группами
§ Сорбент всегда менее полярен чем элюент
§ Порядок выхода аналитов – сначала полярные
§ Разделяет почти все классы соединений, кроме очень полярных (углеводы)
§ Хуже чем НФ разделяет изомеры
Ионообменная хроматография
§ Жидко-твердофазная хроматография
§ Механизмы: кулоновские взаимодействия
§ Сорбенты: § полимерные катионо и анионообменники § силикагели с кислотными и основными группами
§ Разделяет заряженные соединения, растворимые в воде (или водно-органических смесях) по количеству и виду ионогенных групп
§ Использует водные буферные растворы (сорбент не полярный, элюент полярный)
§ Часто требует градиентных режимов
§ Сначала выходят полярные
Эксклюзионная хроматография
§ Жидко-жидкофазная хроматография
§ Механизм: разделение по размерам
§ Сорбенты: § твердые пористые полимеры § модифицированные силикагели § стекла
§ Элюенты – любые растворители
§ Сорбент не должен взаимодействовать с веществом
§ Заканчивается там, где начинаются другие виды хроматографии
§ Низкая пиковая емкость
§ Желательно увеличение длины колонок
HILIC(гидрофильная жидкостная) хроматография
§ Жидко- жидкофазная хроматография
§ Механизм: распределение и адсорбция
§ Сорбенты: § как для НФ хроматографии § силикагель, диол, амин, нитрил
§ Элюенты – как в ОФ. Смеси воды и CH3CN, часто добавляют соли типа AcONH4 (сорбент полярный, элюент полярный)
§ Порядок выхода аналитов – как в НФ (сначала неполярные)
§ Позволяет разделять сильно полярные и заряженные соединения
Аппаратурное оформление ВЭЖХ
узел подготовки подвижной фазы, включая ёмкость с подвижной фазой (или ёмкости с отдельными растворителями, входящими в состав подвижной фазы) и систему дегазации подвижной фазы ;
насосная система;
смеситель подвижной фазы (при необходимости);
система ввода пробы (инжектор) , может быть ручным или автоматическим ( автосамплер );
хроматографическая колонка (может быть установлена в термостате) ;
детектор (один или несколько с разными способами детектирования);
система управления хроматографом, сбора и обработки данных.
Помимо этого в состав хроматографа могут входить: система пробоподготовки и предколоночный реактор, система переключения колонок, постколоночный реактор и другое оборудование.
Адсорбционная - разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности сорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля.
Распределительная - разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной (как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и подвижной фазами.
Ионообменная - молекулы веществ смеси, диссоциированные в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через сорбент (катионит или анионит) за счет различной силы взаимодействия определяемых ионов с ионными группами сорбента.
Эксклюзионная (ситовая, гель-проникающая, гель-фильтрационная) - молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы.
Хиральная – разделение на отдельные энантиомеры, которое может осуществляется на хиральных неподвижных фазах или на ахиральных неподвижных фазах с использованием хиральных подвижных фаз.
Существуют и другие варианты ВЭЖХ.
Принцип действия жидкостного хроматографа заключается в следующем: раствор разделяемой смеси с помощью клапана ввода пробы вводится в верхнюю часть хроматографической колонки. С помощью насоса смесь исходных соединений прокачивается элюентом через хроматографическую колонку, в которой происходит разделение анализируемой смеси на отдельные вещества (компоненты). Вытекающий из колонки элюат, содержащий отдельные компоненты анализируемой смеси, анализируется при помощи UV-детектора.
Аффинная хроматография. Разделяет белки на основе высокоспецифичного взаимодействия, например, между антигеном и антителом, ферментом и субстратом, рецептором и лигандом.
Ионообменная хроматография. В этом виде хроматографии белки разделяются по заряду или полярности. Смесь, содержащую один или несколько представляющих интерес белков, растворяют в буфере А и закачивают в колонку. Представляющие интерес белки связываются с сорбентом, в то время как другие компоненты переносятся в буфер. Разделяют компоненты образца на основе силы притяжения между молекулами и заряженной стационарной фазой, по поверхностным зарядам.
Хроматография гидрофобных взаимодействий (HIC). С её помощью разделяют белки с разной степенью поверхностной гидрофобности. Белки связываются с гидрофобным лигандом на смоле HIC в связывающем буфере с высокой концентрацией соли (cульфат аммония).
HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography): Основана на гидрофильных (водных) взаимодействиях между молекулами и гидрофильной поверхностью неподвижной фазы. Неподвижная фаза обычно покрыта полярными группами (например, амидные или диоловые группы), которые взаимодействуют с гидрофильными участками молекул в смеси. Подвижная фаза состоит в основном из смеси воды и органического растворителя (например, акрилонитрила), где содержание воды обычно невелико, что способствует образованию водных слоев на поверхности неподвижной фазы, усиливающих гидрофильные взаимодействия.
Мультимодальная хроматография — это хроматографические методы, которые используют более одной формы взаимодействия между неподвижной фазой и анализируемыми веществами для достижения их разделения.
В такой хроматографии лиганды, иммобилизованные на смоле, взаимодействуют с целевой белковой молекулой через несколько типов взаимодействий, среди которых наиболее важными являются исключение по размеру, ионное и гидрофобное взаимодействие. Мультимодальная хроматография используется для очистки белков и других биомолекул, в том числе тех, которые трудно разделить другими методами хроматографии.
Гель-фильтрация(эксклюзионная). Молекулы разделяются по размеру при прохождении через колонку. В этом случае комбинацию молекул помещают в хроматографическую колонку после растворения в подвижной фазе. Большие молекулы элюируются или удаляются из колонки, а маленькие на мгновение задерживаются матрицей, которая выполняет функцию фильтра.
Режимы хроматографии:
• режим протока (flow-through), без связывания образца с сорбентом - уравновешивание колонны, загрузка материала на колонну, элюция и сбор целевых фракций осуществляется при подаче одного и того же элюента;
• режим связывания и элюции (bind-in-elute), связывание образца с сорбентом и последующая элюция при изменении свойств буфера - загрузка материала на колонну и элюция материала с колонны осуществляются с использованием буферов, имеющих разные химические свойства (рН, УЭП).
Тип элюирования - изократический или градиентный, параметры градиента (длительность, исходный и конечный % градиентного буфера). В случае постоянного состава подвижной фазы процесс называют изократическим, а во втором (меняющимся во время анализа) - градиентным .