3 курс / Фармакология / Лечение_ВИЧ_инфекции,_К_Хоффман,_Дж_К_Роктрох,_Б_С_Кампс

Лечение ВИЧ-инфекции. 2005 год 235

объясняется тот факт, что в ряде исследований описано снижение концентрации мтДНК при лечении зидовудином.

5.Митохондриальная токсичность тканеспецифична. Это объясняется тем, что захват неактивной формы НИОТ клетками и их митохондриями, а также фосфорилирование с переходом препарата в активную форму в разных типах клеток различается.

6.При комбинировании двух и более НИОТ в их токсическом действии на митохондрии возможен кумулятивный эффект и синергизм.

Клинические проявления

Снижение уровня мтДНК клинически может проявляться поражением одного или нескольких орга- нов-мишеней (рис. 1).

Рисунок 1. Органы, в которых проявляется митохондриальная токсичность.

В печени митохондриальная токсичность сопровождается повышенным отложением липидов, что приводит к мелкоили крупнокапельной жировой дистрофии печени. Иногда этому сопутствует повышение активности аминотрансфераз. В этом случае жировая дистрофия печени может прогрессировать с развитием печеночной недостаточности и лактацидоза — угрожающему жизни, но, к счастью, редкому осложнению. Впервые жировая дистрофия печени и лактацидоз были описаны в начале 90-х гг. у больных, получавших монотерапию диданозином (Lambert, 1990); сегодня печеночная митохондриальная токсичность наблюдается при лечении любыми НИОТ, оказывающими относительно сильное ингибирующее действие на гамма-полимеразу, — особенно так называемыми «Д-препаратами»: зидовудином (ВидексTM), ставудином (ЗеритTM) и зальцитабином (ХивидTM). Показано, что каждый из Д-препаратов у

236 Митохондриальная токсичность аналогов нуклеозидов

ВИЧ-инфицированных приводит к время-зависимому снижению уровня мтДНК в гепатоцитах. При электронной микроскопии обнаруживаются морфологические изменения митохондрий.

Типичное осложнение митохондриальной токсичности — повышение сывороточного уровня лактата. Гиперлактатемия чаще описывалась при длительном лечении ставудином (Saint Marc, 1999; Carr, 2000), особенно в комбинации с диданозином. Токсичность диданозина также повышается в результате взаимодействий с рибавирином и гидроксимочевиной. Значение бессимптомной гиперлактатемии не ясно. Если повышение уровней лактата проявляется клинически, симптомы часто бывают неспецифичными — тошнота, болезненность в правом подреберье, миалгия. В большинстве случаев уровни бикарбоната и анионный интервал (Na+ [HCO3 + Cl]) в норме, но активность печеночных аминотрансфераз в большинстве случаев слегка повышена (Lonergan, 2000a). Поэтому в диагностике приходится полагаться на более трудоемкое определение сывороточного уровня лактата. Чтобы избежать ошибок, венозную кровь следует брать в покое, без наложения жгута. Кровь следует собирать во фторированные пробирки, помещать на лед и сразу доставлять в лабораторию для незамедлительного исследования. В дифференциальной диагностике следует учитывать, что причиной лактацидоза могут быть не только повреждение митохондрий (табл. 1); следует исключать повреждение различных органов.

Таблица 1. Причины гиперлактатемии и лактацидоза

Митохондриальная миопатия у ВИЧ-инфицированных, получающих антиретровирусные препараты, впервые была описана при лечении высокими дозами зидовудина (Arnaudo, 1991). Слабость скелетных мышц может проявляться при динамической или статической нагрузке. Сывороточный уровень КФК часто бывает в норме или немного повышен. Гистологическое исследование биоптатов мышц позволяет отличить эту форму митохондриальной токсичности от ВИЧ-миопатии, которая может развиться одновременно. При митохондриальной миопатии при гистохимическом исследовании мышечных волокон цитохром-c-оксидаза нередко не обнаруживается и выявляются ультраструктурные аномалии митохондрий, а при ВИЧ-миопатии обычно обнаруживается инфильтрация T-лимфоцитами CD8. Исследование при нагрузке позволяет обнаружить низкий лактатный порог и снижение элиминации лактата, однако в клинической практике эти изменения трудно отличить от плохой переносимости аэробной нагрузки (детренированности).

Длительное лечение Д-препаратами также нередко приводит к полинейропатии нижних конечностей (преимущественно симметричной, сенсорной и дистальной) (Simpson, 1995; Moyle, 1998). Повышенный уровень лактата в сыворотке помогает отличить этот вид аксональной нейропатии от его ВИЧ-варианта с такими же клиническими проявлениями. В дифференциальной диагностике помогает также тот факт, что митохондриальная токсичность развивается в большинстве случаев через несколько недель и месяцев после начала лечения Д-препаратами. Напротив, ВИЧ-полинейропатия обычно не прогрессирует и порой даже ослабевает на фоне длительной антиретровирусной терапии.

В узком понимании термин «липодистрофия» применяется для описания перераспределения жировой ткани. У некоторых больных липодистрофия проявляется избыточным накоплением жира в определенных местах (обычно на животе и тыльной стороне шеи), а у других — напротив, уменьшением жировой ткани (на щеках, височной области, подкожной клетчатке конечностей). В некоторых случаях избыточное отложение жира в одних местах сочетается с уменьшением жировой ткани в других. Уменьшение жировой ткани (липоатрофия) частично обратимо и обычно становится заметным спустя год или более после начала антиретровирусной терапии. В пораженной жировой клетчатке выявляются ультраструк-

Лечение ВИЧ-инфекции. 2005 год 237

турные изменения митохондрий и сниженное содержание мтДНК, в особенности у больных, получавших ставудин (Walker, 2002a). Исследования жировых клеток in vitro и in vivo показали сниженное содержание липидов в клетках, уменьшение факторов адипогенной транскрипции (PPAR-гамма и SREBP-1) и повышение индексов апоптоза. НИОТ могут также нарушать некоторые эндокринные функции липоцитов. Например, они способны нарушать секрецию адипонектина и тем самым способствовать развитию инсулинорезистентности. Наибольший риск несет ставудин, однако и другие НИОТ, например, зидовудин, тоже могут оказывать такое действие. Если ставудин заменить другим НИОТ, уровни мтДНК и индексы апоптоза улучшаются, так же как отмечается объективное, хотя и небольшое, увеличение жировой ткани (McComsey, 2004a). Замена ингибиторов протеазы не приводит к уменьшению липоатрофии и апоптоза адипоцитов. Все эти факты указывают на доминирующий эффект митохондриальной токсичности в патогенезе липоатрофии.

Вряде исследований показано влияние НИОТ на уровни мтДНК в крови (Coté, 2003; Miro, 2003). Функциональные последствия митохондриальной токсичности для лимфоцитов пока не известны. В данном случае важно заметить, что при повышении уровней диданозина в плазме (на фоне тенофовира или у больных с низким весом) было отмечено отсроченное снижение числа лимфоцитов CD4 и CD8 (Negredo, 2004). Недавние исследования стимулированных митогенами T-лимфоцитов in vitro показали, что диданозин в концентрации, немного превышающей терапевтическую, вызывал значительное снижение уровня мтДНК и последующее отсроченное снижение пролиферации лимфоцитов и усиление апоптоза (Setzer, 2005a; Setzer, 2005b). Таким образом, митохондриальная токсичность — наиболее вероятное объяснение позднего снижения числа лимфоцитов при лечении диданозином. Данные показывают, что митохондриальная токсичность НИОТ для лимфоцитов оказывает иммуносупрессорное действие.

Вредких случаях на фоне ВААРТ встречается бессимптомное повышение активности сывороточной липазы, однако прогностического значения в отношении развития панкреатита оно не имеет (Maxson, 1992). В целом частота панкреатита оценивается в 0,8 случаев на 100 лет ВААРТ схемами на основе НИОТ. Клинически выраженный панкреатит чаще развивается при лечении диданозином. Повторное назначение диданозина может спровоцировать рецидив панкреатита, поэтому противопоказано. Высказаны предположения, что причиной панкреатита служит митохондриальная токсичность, но пока доказательств этому не найдено.

Вновых исследованиях изучается безопасность зидовудина в профилактике вертикальной передачи ВИЧ. В исследовании у беременных обезьян, получавших комбинацию зидовудина с ламивудином в течение 10 недель до родов, зидовудин был обнаружен в мтДНК. Кроме того, лечение комбинацией НИОТ привело к снижению уровня мтДНК в скелетных мышцах, сердце и головном мозге (Gerschenson, 2004).

Обнаружена повышенная частота митохондриальных симптомов у детей, рожденных женщинами, получавшими НИОТ во время беременности (Blanche, 1999). Нередко обнаруживается гиперлактатемия, иногда она сохраняется в течение нескольких месяцев после рождения (Noguera, 2003). Очень низкие уровни мтДНК обнаружены в плаценте, а также в пуповинной крови новорожденных (Shiramizu, 2003). Другие клинические исследования не выявили повышенного риска при перинатальной профилактике зидовудином, однако ключевые параметры митохондриальной дисфункции в них не оценивались. Необходимо срочно провести анализ отдаленных данных. На сегодняшний день нет сведений, которые бы требовали пересмотра текущей тактики использования зидовудина для профилактики вертикальной передачи ВИЧ.

Значение митохондриальной токсичности для почек спорно. Нуклеотидный ингибитор обратной транскриптазы тенофовир (ВиридTM) в дозах, превышавших терапевтические, вызывает у животных синдром Фанкони со снижением реабсорбции фосфата в почечных канальцах и остеомаляцией (обзор тенофовира, 2001). Реабсорбция тенофовира в почечных канальцах происходит с участием особого анионного переносчика; не исключено, что очень высокая концентрация препарата в клетке может привести к клинически выраженному ингибированию и снижению концентрации мтДНК несмотря на то, что активность тенофовира в повреждении репликации мтДНК низкая. Хотя описано несколько случаев снижения реабсорбции фосфатов почками при лечении тенофовиром, следует заметить, что ни в предварительных клинических испытаниях тенофовира, ни в последующих клинических обзорах не обнаружено митохондриальной токсичности тенофовира для почечных канальцев.

Мониторинг и диагностика

До сих пор не существует надежных методов оценки индивидуального риска митохондриальной токсичности. Рутинный скрининг уровня лактата у всех больных, получающих НИОТ, в отсутствие симптомов не обоснован, поскольку повышенный уровень лактата в отсутствие симптомов не служит прогностическим фактором митохондриальной токсичности (McComsey, 2004 г). У больных с симптомами митохон-

238 Митохондриальная токсичность аналогов нуклеозидов

дриальной токсичности, напротив, к измерению уровня лактата следует отнестись очень внимательно. Определение уровней мтДНК в мононуклеарах крови сопряжено с систематическими ошибками и высокой вариабельностью: международных стандартов этого метода не существует. Эта форма мониторинга инвазивна и с точки зрения клинических исходов в проспективных исследованиях не изучалась.

При установившейся симптоматике в диагностике помогает гистологическое исследование биоптатов. В пользу митохондриальной токсичности свидетельствуют: ультраструктурные изменения митохондрий, сниженная гистохимическая активность цитохром-c-оксидазы, повышенная активность сукцинатдегидрогеназы, внутриклеточная (особенно мелкокапельная) жировая дистрофия печени и так называемые рваные мышечные волокна.

Лечение и профилактика митохондриальной токсичности

Лекарственные взаимодействия могут усиливать проявления митохондриальной токсичности и должны приниматься во внимание. Митохондриальная токсичность диданозина (ВидексTM) например, усиливается в результате лекарственных взаимодействий с рибавирином, гидроксимочевиной и аллопуринолом (Ray, 2004). В случаев комбинирования диданозина с тенофовиром (ВиридTM) дозу диданозина нужно снизить до 250 мг 1 раз в сутки. Нарушение метаболизма митохондрий возможно при сочетании ингибиторов с ибупрофеном, вальпроевой кислотой и аспирином — эти препараты подавляют утилизацию митохондриями жирных кислот. Описаны многочисленные случаи, когда лечение вальпроевой кислотой (у ВИЧ-инфицированных и у лиц с врожденными мутациями мтДНК) спровоцировало угрожающий жизни лактацидоз. Аспирин может повреждать митохондрии печени и приводить к развитию синдрома Рейе. Амиодарон и тамоксифен также подавляют синтез АТФ в митохондриях. Парацетамол и другие препараты нарушают антиоксидантную защиту (глутатион) в митохондриях. Аминогликозидные антибиотики и хлорамфеникол не только подавляют синтез белков бактериями, но и при определенных обстоятельствах могут нарушать транскрипцию пептидов в митохондриях как в бактериоподобных эндосимбионтах. Адефовир и цидофовир тоже подавляют активность гамма-полимеразы. Алкоголь токсичен для митохондрий и поэтому противопоказан.

Самая главная клиническая мера — отмена НИОТ, вызвавших митохондриальную токсичность. Рандомизированные исследования показали, что замена ставудина (ЗеритTM) на менее токсичный препарат приводило к объективному уменьшению липоатрофии с положительной динамикой (Martin, 2004). Напротив, замена ингибиторов протеазы на ННИОТ к уменьшению липоатрофии не приводило. Эти данные подчеркивают важную роль митохондриальной токсичности в патогенезе этого синдрома.

Рисунок 2. Предполагаемый механизм действия Митокнола (НуклеомаксXTM) в профилактике и лечении митохондриальной токсичности.

Лечение ВИЧ-инфекции. 2005 год 239

Препараты уридина — новое, но перспективное направление в лечении. Как уже сказано, любое нарушение в дыхательной цепи приводит к ингибированию ДГОДГ — фермента, необходимого для синтеза уридина и его производных — пиримидинов (рис. 2). Снижение внутриклеточного содержания пиримидина приводит к относительному избытку экзогенных аналогов пиримидина, с которыми они конкурируют за гамма-полимеразу. Порочный круг замыкается и приводит к снижению уровня мтДНК. Профилактическое или терапевтическое использование препаратов уридина может разорвать этот круг и тем самым повысить уровень мтДНК. Уридин устранит в гепатоцитах все последствия снижения уровня мтДНК и приведет к нормализации образования лактата, пролиферации клеток, скорости гибели клеток и внутриклеточного отложения жиров (Walker, 2003). Витамины в данном случае оказались бесполезными. Последние данные показывают, что уридин способен также предотвратить утрату мтДНК и липидов и нарушение функций митохондрий в липоцитах, подвергшихся действию ставудина (Walker, 2004a). Апоптоз липоцитов также предотвратим.

Препараты уридина внутрь в качестве предшественника пиримидина хорошо переносятся, даже в высоких дозах (van Groeningen, 1986; Kelsen, 1997). Отрицательного влияния на эффективность антиретровирусной терапии не описано (Sommadossi, 1988; Koch, 2003). Пищевая добавка Митокнол повышала сывороточный уровень уридина до уровней, оказывавших защитное действие in vitro (Venhoff, 2004). Недавно опубликованы положительные результаты клинических исследований Митокнола (другое название —НуклеомаксXTM). Дополнительную информацию можно найти на сайтах www.mitocnol.com и www.nucleomaxX.com.

При бессимптомной гиперлактатемии > 5 ммоль/л, клинически выраженной гиперлактатемии и, разумеется, лактацидозе все НИОТ нужно сразу отменить (Brinkman, 2000). Рекомендуется назначить витамины, однако их эффективность с точки зрения повышения уровня мтДНК не подтверждена (Walker, 1995; Venhoff, 2002). Спонтанная нормализация уровня лактата иногда занимает несколько недель. Можно назначить менее опасные для митохондрий НИОТ, но при условии тщательного наблюдения за пациентом (Lonergan, 2003). Рекомендации по поддерживающему лечению гиперлактатемии и лактацидоза приведены в табл. 2.

Таблица 2. Поддерживающее лечение гиперлактатемии у ВИЧ-инфицированных небеременных взрослых

Кислород Устранение гипогликемии

Бикарбонат (спорно) - 50-100 ммоль, если pH<7,1 Коэнзим Q10 (100 мг 3 раза в сутки)

Витамин C (1 г 3 раза в сутки) Тиамин (вит. B1, 100 мг 3 раза в сутки)

Рибофлавин (вит. B2, 100 мг 1 раз в сутки)

Пиридоксин (вит. B6, 60 мг 1 раз в сутки)

L-ацетилкарнитин (1 г 3 раза в сутки)

НуклеомаксX (36 г 3 раза в сутки до снижения уровня лактата до < 5 ммоль/л)

Литература

1.Arnaudo E, Dalakas M, Shanske S, Moraes CT, DiMauro S, Schon EA. Depletion of muscle mitochondrial DNA in AIDS patients with zi- dovudine-induced myopathy. Lancet 1991;337:508-510. http://amedeo.com/lit.php?id=1671889

2.Becher F, Pruvost AG, Schlemmer DD et al. Significant levels of intracellular stavudine triphosphate are found in HIV-infected zidovudinetreated patients. AIDS 2003;17:555-561. http://amedeo.com/lit.php?id=12598776

3.Blanche S, Tardieu M, Rustin P et al. Persistent mitochondrial dysfunction and perinatal exposure to antiretroviral nucleoside analogues. Lancet 1999;354:1084-1089. http://amedeo.com/lit.php?id=10509500

4.Bonora S, Boffito M, D'Avolio A et al. Detection of stavudine concentrations in plasma of HIV-infected patients taking zidovudine. AIDS 2004;18:577-578. http://amedeo.com/lit.php?id=15090817

5.Brinkman K, Smeitink JA, Romijn JA, Reiss P. Mitochondrial toxicity induced by nucleoside-analogue reverse-transcriptase inhibitors is a key factor in the pathogenesis of antiretroviral-therapy-related lipodystrophy. Lancet 1999;354:1112-1115. http://amedeo.com/lit.php?id=10509516

240 Митохондриальная токсичность аналогов нуклеозидов

6.Brinkman K, Vrouenraets S, Kauffman R, Weigel H, Frissen J. Treatment of nucleoside reverse transcriptase inhibitor-induced lactic acidosis. AIDS 2000;14:2801-2802. http://amedeo.com/lit.php?id=11125906

7.Carr A, Miller J, Law M, Cooper DA. A syndrome of lipoatrophy, lactic acidaemia and liver dysfunction associated with HIV nucleoside analogue therapy: contribution to protease inhibitor-related lipodystrophy syndrome. AIDS 2000;14:F25-F32. http://amedeo.com/lit.php?id=10716495

8.Carr A, Samaras K, Burton S et al. A syndrome of peripheral lipodystrophy, hyperlipidaemia and insulin resistance in patients receiving HIV protease inhibitors. AIDS 1998;12:F51-F58. http://amedeo.com/lit.php?id=9619798

9.Coté HC, Yip B, Asselin JJ et al. Mitochondrial:nuclear DNA ratios in peripheral blood cells from human immunodeficiency virus (HIV)- infected patients who received selected HIV antiretroviral drug regimens . J Infect Dis 2003;187:1972-1976. http://amedeo.com/lit.php?id=12792876

10.Gerschenson M, Nguyen V, Ewings EL et al. Mitochondrial toxicity in fetal Erythrocebus patas monkeys exposed transplacentally to zidovudine plus lamivudine. AIDS Res Hum Retroviruses 2004;20:91-100. http://amedeo.com/lit.php?id=15000702

11.Kakuda TN. Pharmacology of nucleoside and nucleotide reverse transcriptase inhibitor-induced mitochondrial toxicity. Clin Ther 2000;22:685-708. http://amedeo.com/lit.php?id=10929917

12.Kelsen DP, Martin D, O'Neil J et al. Phase I trial of PN401, an oral prodrug of uridine, to prevent toxicity from fluorouracil in patients with advanced cancer. J Clin Oncol 1997;15:1511-1517. http://amedeo.com/lit.php?id=9193347

13.Koch EC, Schneider J, Weiss R, Penning B, Walker UA. Uridine excess does not interfere with the antiretroviral efficacy of nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors. Antivir Ther 2003;8:485-487. http://amedeo.com/lit.php?id=14640397

14.Lambert JS, Seidlin M, Reichman RC et al. 2',3'-dideoxyinosine (ddI) in patients with the acquired immunodeficiency syndrome or AIDSrelated complex. A phase I trial. N Engl J Med 1990;322:1333-1340. http://amedeo.com/lit.php?id=2139173

15.Lonergan JT, Barber RE, Mathews WC. Safety and efficacy of switching to alternative nucleoside analogues following symptomatic hyperlactatemia and lactic acidosis. AIDS 2003;17:2495-2499. Abstract: http://amedeo.com/lit.php?id=14600521

16.Lonergan JT, Behling C, Pfander H, Hassanein TI, Mathews WC. Hyperlactatemia and hepatic abnormalities in 10 human immunodeficiency virus-infected patients receiving nucleoside analogue combination regimens. Clin Infect Dis 2000a;31:162-166. http://amedeo.com/lit.php?id=10913415

17.Löffler M, Jöckel J, Schuster G, Becker C. Dihydroorotat-ubiquinone oxidoreductase links mitochondria in the biosynthesis of pyrimidine nucleotides. Mol Cell Biochem 1997;174:125-129. http://amedeo.com/lit.php?id=9309676

18.Martin A, Smith DE, Carr A et al. Reversibility of lipoatrophy in HIV-infected patients 2 years after switching from a thymidine analogue to abacavir: the MITOX Extension Study. AIDS 2004;18:1029-1036. http://amedeo.com/lit.php?id=15096806

19.Maxson CJ, Greenfield SM, Turner JL. Acute pancreatitis as a common complication of 2',3'-dideoxyinosine therapy in the acquired immunodeficiency syndrome. Am J Gastroenterol 1992;87:708-713. http://amedeo.com/lit.php?id=1590305

20.McComsey GA, Ward DJ, Hessenthaler SM et al. Improvement in lipoatrophy associated with highly active antiretroviral therapy in human immunodeficiency virus-infected patients switched from stavudine to abacavir or zidovudine: the results of the TARHEEL study. Clin Infect Dis 2004a;38:263-270. http://amedeo.com/lit.php?id=14699460

21.McComsey GA, Yau L. Asymptomatic hyperlactataemia: predictive value, natural history and correlates. Antivir Ther 2004b;9:205-212. http://amedeo.com/lit.php?id=15134182

22.Miro O, Lopez S, Pedrol E et al. Mitochondrial DNA depletion and respiratory chain enzyme deficiencies are present in peripheral blood mononuclear cells of HIV-infected patients with HAART-related lipodystrophy. Antivir Ther 2003;8:333-338. http://amedeo.com/lit.php?id=14526764

23.Moyle GJ, Sadler M. Peripheral neuropathy with nucleoside antiretrovirals: risk factors, incidence and management. Drug Safety 1998;19:481-494. http://amedeo.com/lit.php?id=9880091

24.Negredo E, Moltó J, Burger D et al. Unexpected CD4 cell count decline in patients receiving didanosine and tenofovir-based regimens despite undetectable viral load. AIDS 2004;18:459-463. http://amedeo.com/lit.php?id=15090798

25.Noguera A, Fortuny C, Sanchez E et al. Hyperlactatemia in human immunodeficiency virus-infected children receiving antiretroviral treatment. Pediatr Infect Dis J 2003;22:778-782. http://amedeo.com/lit.php?id=14506367

26.Ray AS, Olson L, Fridland A. Role of purine nucleoside phosphorylase in interactions between 2',3'-dideoxyinosine and allopurinol, ganciclovir, or tenofovir. Antimicrob Agents Chemother 2004;48:1089-1095. http://amedeo.com/lit.php?id=15047506

27.Saint-Marc T, Touraine JL. The effects of discontinuing stavudine therapy on clinical and metabolic abnormalities in patients suffering from lipodystrophy. AIDS 1999;13:2188-2189. http://amedeo.com/lit.php?id=10546885

28.Setzer B, Schlesier M, Thomas AK, Walker UA. Mitochondrial toxicity of nucleoside analogues in primary human lymphocytes. Antivir Ther 2005a; in press.

29.Setzer B, Schlesier M, Walker UA. Functional impairment of NRTI-related mitochondrial DNA-depletion in primary human T-lymphocytes. J Infect Dis 2005b; in press.

30.Shiramizu B, Shikuma KM, Kamemoto L et al. Placenta and cord blood mitochondrial DNA toxicity in HIV-infected women receiving nucleoside reverse transcriptase inhibitors during pregnancy. J Acquir Immune Defic Syndr 2003;32:370-374. http://amedeo.com/lit.php?id=12640193

31.Simpson DM, Tagliati M. Nucleoside analogue-associated peripheral neuropathy in human immunodeficiency virus infection. J Acquir Immune Defic Syndr 1995;9:153-161. http://amedeo.com/lit.php?id=7749792

32.Sommadossi JP, Carlisle R, Schinazi RF, Zhou Z. Uridine reverses the toxicity of 3'-azido-3'-deoxythymidine in normal human granulocytemacrophage progenitor cells in vitro without impairment of antiretroviral activity. Antimicrob Agents Chemother 1988;32:997-1001. http://amedeo.com/lit.php?id=3190201

33.Tenofovir review team. Memorandum. www fda gov 2001. http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/01/slides/3792s1_02_FDA-tenofovir.ppt

34.van Groeningen CJ, Leyva A, Kraal I, Peters GJ, Pinedo HM. Clinical and pharmacokinetic studies of prolonged administration of highdose uridine intended for rescue from 5-FU toxicity. Cancer Treatment Reports 1986;70:745-750. http://amedeo.com/lit.php?id=3731137

35.Venhoff N, Setzer B, Lebrecht D, Walker UA. Dietary supplements in the treatment of NRTI-related mitochondrial toxicity. AIDS 2002;16:800-802. http://amedeo.com/lit.php?id=11964542

36.Venhoff N, Zilly M, Lebrecht D et al. Uridine pharmacokinetics of Mitocnol, a sugar cane extract. Antivir Ther 2004;9:L21-L22.

37.Walker UA, Auclair M, Lebrecht D, Kornprobst M, Capeau J, Caron M. Uridine abrogates the adverse effects of stavudine and zalcitabine on adipose cell functions. Antivir Ther 2004a;9:L21-L22.

Лечение ВИЧ-инфекции. 2005 год 241

38.Walker UA, Bickel M, Lütke Volksbeck SI et al. Evidence of nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor-associated genetic and structural defects of mitochondria in adipose tissue of HIV-infected patients. J Acquir Immune Defic Syndr 2002a;29:117-121. http://amedeo.com/lit.php?id=11832679

39.Walker UA, Byrne E. The therapy of respiratory chain encephalomyopathy: a critical review of the past and current perspective. Acta Neurol Scand 1995;92:273-280. http://amedeo.com/lit.php?id=8848932

40.Walker UA, Langmann P, Miehle N, Zilly M, Klinker H, Petschner F. Beneficial effects of oral uridine in mitochondrial toxicity. AIDS 2004b;18:1085-1086. http://amedeo.com/lit.php?id=15096820

41.Walker UA, Setzer B, Venhoff N. Increased long-term mitochondrial toxicity in combinations of nucleoside analogue reverse-transcriptase inhibitors. AIDS 2002b;16:2165-2173. http://amedeo.com/lit.php?id=12409738

42.Walker UA, Venhoff N, Koch E, Olschweski M, Schneider J, Setzer B. Uridine abrogates mitochondrial toxicity related to nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors in HepG2 cells. Antivir Ther 2003;8:463-470. http://amedeo.com/lit.php?id=14640394

242 Исследование устойчивости ВИЧ

9. Исследование устойчивости ВИЧ

Ева Вольф

Появление устойчивых штаммов ВИЧ — одна из главных причин неэффективности антиретровирусной терапии. Если возникает устойчивость к препаратам сразу нескольких групп, возможности выбора значительно сокращаются, к тому же резервные схемы терапии в этих случаях нередко дают лишь кратковременный эффект.

Быстрое развитие устойчивости обусловлено высокой скоростью репликации ВИЧ (ежедневно образуется почти 10 млн новых вирусных частиц (Perelson, 1996)), а также очень большой частотой ошибок репликации, совершаемых обратной транскриптазой ВИЧ. Это приводит к высокой частоте мутаций и постоянному образованию новых штаммов вируса даже в отсутствие лечения. Под давлением антиретровирусных препаратов происходит селекция устойчивых штаммов, и они начинают преобладать (Drake, 1993).

Методы исследования устойчивости

Для оценки чувствительности ВИЧ к антиретровирусным препаратам (или устойчивости к ним) существует два метода — фенотипирование и генотипирование (Wilson, 2003). В настоящее время выпускаются различные системы для этих исследований, для генотипирования, например: HIV-1 TrueGene™ (изгото-

витель Bayer Healthcare Diagnostics), ViroSeq™ (Celera Diagnostics/Abbott Laboratories), virco®Type HIV-1, (Virco), GenoSure (Plus)™ (LabCorp) и GeneSeq™ (Virologic); для фенотипирования: Antivirogram® (Virco), PhenoSense™ (ViroLogic), Phenoscript™ (VIRalliance).

Стоимость исследования колеблется в зависимости от лаборатории и используемой системы и составляет от 350 до 500 евро для генотипирования и примерно вдвое больше для фенотипирования. Применение обоих методов в некоторой степени ограничено их порогом чувствительности: если вирусная нагрузка составляет менее 500-1000 мл-1, оценить устойчивость вируса зачастую не удается.

Фенотипирование

С помощью фенотипирования можно получить непосредственную количественную оценку чувствительности вируса к препаратам. При этом оценивают репликацию вируса в культурах клеток с возрастающими концентрациями антиретровирусных препаратов и сравнивают с репликацией дикого штамма вируса (контроля).

Чувствительность вируса к препарату оценивают по ПК50 (концентрации препарата, которая подавляет репликацию вируса на 50%). Затем вычисляют отношение ПК50 исследуемого штамма к ПК50 контроля и сопоставляют полученную величину с пороговой. Если полученная величина меньше пороговой, штамм считают чувствительным, больше — устойчивым. Таким образом, знание пороговых величин очень важно для интерпретации результатов.

На сегодня таких пороговых величин три. Техническая пороговая величина предусматривает методологические расхождения исследований и составляет примерно 2,5. Биологическая пороговая величина учитывает индивидуальные различия штаммов у пациентов, ранее не получавших антиретровирусных средств; эта величина немного выше технической, однако предсказать клинический ответ на препарат по ней нельзя. Клиническая пороговая величина отражает диапазон ПК50, при котором возможно подавление репликации вируса.

В отношении ингибиторов протеазы (ИП) следует учитывать, в каких клинических исследованиях получены соответствующие клинические пороговые величины: в исследованиях ИП, усиленных ритонавиром или не усиленных им. При усилении ритонавиром концентрации препарата могут превышать некоторые уровни устойчивости.

Недостатки фенотипирования включают длительность и дороговизну исследования.

Генотипирование

Генотипирование позволяет выявить мутации, которые приводят к устойчивости ВИЧ. Это можно сделать при прямом определении амплифицированной нуклеотидной последовательности ВИЧ или с помощью гибридизации с олигонуклеотидами дикого или мутантного штамма вируса. Генотипирование способно выявить только те мутантные штаммы, которые численность которых составляет не менее 20-30%.

Лечение ВИЧ-инфекции. 2005 год 243

Кроме того, этот метод дает лишь косвенную оценку лекарственной устойчивости. Мутации, снижающие чувствительность вируса, подробно описаны для большинства антиретровирусных препаратов, однако из-за большого разнообразия профилей устойчивости и существования компенсаторных мутаций трактовать степень устойчивости к конкретным препаратам довольно сложно.

Анализ генотипической устойчивости основан на корреляции генотипа и фенотипа. Данные о такой корреляции добываются в исследованиях in vitro, клинических наблюдениях и двойном тестировании (выяснении фенотипической устойчивости у штаммов с выявленными мутациями).

Один из методов определения фенотипа по генотипу — составление так называемого «виртуального фенотипа» (например, с использованием VirtualPhenotype™): интерпретация выявленных мутаций с помощью большой базы данных генотипов и соответствующих им фенотипов. В этой базе данных проводят поиск штаммов с генотипами, соответствующими генотипу выделенного у пациента штамма. Подсчитав среднее значение ПК50 этих штаммов, можно определить вероятный фенотип штамма пациента.

Для интерпретации выявленных при генотипировании мутаций широко используются различные алгоритмы, составленные группами специалистов на основе выявленных в литературе и клинических наблюдениях закономерностей, например, составленные французской группой исследования устойчивости AC11 при Национальном агентстве исследований в области СПИДа (ANRS).

Кроме того, для предсказания фенотипической лекарственной устойчивости используются различные автоматизированные системы, например с использованием дерева решений и поддерживающих векторных машин (например, система «geno2pheno») (Beerenwinkel, 2003).

Некоторые наиболее важные базы данных о профилях устойчивости и интерпретации результатов генотипирования открыты для бесплатного доступа в интернете:

Стэнфордская база данных: http://hiv.net/link.php?id=24 Лос-Аламосская база данных: http://hiv.net/link.php?id=25 База данных «geno2pheno»: http://hiv.net/link.php?id=26

Интерпретация генотипической лекарственной устойчивости ВИЧ-ANRS AC11:http://hiv.net/link.php?id=138

Кроме того, руководства по интерпретации результатов генотипирования выпускают и производители соответствующих систем, например, Virco для систем VirtualPhenotype™ и virco®Type HIV-1, Bayer Healthcare Diagnostics для TruGene™ и Virology Networks для Retrogram™.

Рассматривая генотипическую устойчивость, основное внимание мы уделим мутациям генов обратной транскриптазы и протеазы ВИЧ и гена env, кодирующего gp41, а также соответствующим профилям устойчивости, возникающим в ходе лечения.

Большинство данных получено у пациентов с вирусом подтипа B (им инфицировано 12% ВИЧинфицированных в мире). Однако патогенез и характер устойчивости у разных подтипов вируса могут отличаться. Сегодня устойчивость изучается и у других подтипов вируса (Van de Vijver, 2004).

Основные положения

В нуклеотидной последовательности генома ВИЧ группы из трех нуклеотидов — кодоны — определяют ту или иную аминокислоту в структуре вирусных белков. Мутации обозначают числом, соответствующим порядковому номеру кодона, и двумя буквами. Перед числом ставится буква, соответствующая кодируемой данным кодоном аминокислоте у дикого штамма вируса. Буква после числа соответствует аминокислоте, кодируемой мутантным кодоном.

Механизмы устойчивости

Нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ) становятся биологи-

чески активными только после превращения в трифосфат. Фосфорилирование аналогов нуклеотидов проходит в два этапа вместо трех. Фосфорилированные НИОТ конкурируют с природными дезоксирибонуклеозидтрифосфатами (нуклеозидами). Встраивание фосфорилированных НИОТ в провирусную ДНК обрывает ее дальнейший синтез.

Устойчивость к НИОТ определяется двумя основными механизмами (De Mendoza, 2002). При первом в результате мутации создается стерическое препятствие распознаванию обратной транскриптазой различий между нуклеозидами и их аналогами; в результате вместо НИОТ в вирусную ДНК встраиваются нуклеозиды. Такой механизм имеет место, например, при мутациях M184V, Q151M, L74V и K65R (Naeger, 2001; Clavel, 2004). Второй механизм — фосфоролиз АТФ или пирофосфата, в результате которого

244 Исследование устойчивости ВИЧ

из растущей цепи ДНК элиминируется уже встроенный НИОТ. Этот механизм опосредуется мутациями

M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y и K219Q (Meyer, 2000). Фосфоролиз приводит к перекрестной устой-

чивости к различным НИОТ, причем устойчивость к зидовудину и ставудину больше, чем к абакавиру, к абакавиру больше, чем зальцитабину, а к диданозину больше, чем к ламивудину.

Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ) также ингибируют вирусную об-

ратную транскриптазу (ОТ). ННИОТ — маленькие молекулы, которые связываются с гидрофобным карманом, расположенным рядом с каталитическим доменом обратной транскриптазы. Мутации области связывания снижают аффинность ННИОТ к ОТ и тем самым приводят к неэффективности лечения.

Ингибиторы протеазы (ИП) препятствуют расщеплению протеазой вирусного полипротеина gal-pol (предшественника вирусных белков) и тем самым приводят к образованию незрелых вирусных частиц, не способных инфицировать другие клетки. Устойчивость к ингибиторам протеазы обычно развивается медленно, при накоплении нескольких мутаций — преодолении так называемого генетического барьера. В отношении ингибиторов протеазы различают первичные (большие) и вторичные (малые) мутации. Первичные мутации накапливаются на раннем этапе развития устойчивости к препарату и затрагивают активную область фермента-мишени (протеазы ВИЧ), снижая способность ингибитора протеазы связываться с этим ферментом. Первичные мутации могут также приводить к снижению активности протеазы. Вторичные мутации не затрагивают активную область фермента и обычно возникают позже первичных. Они компенсируют снижение жизнеспособности вируса, вызванное первичными мутациями (Johnson, 2004). Однако разграничение первичных и вторичных мутаций позволяет лишь грубо оценить степень устойчивости вируса.

Ингибиторы слияния отличаются от НИОТ, ННИОТ и ИП тем, что не блокируют репликацию ВИЧ внутри инфицированной клетки, а предотвращают проникновение ВИЧ в клетки-мишени. Первый этап проникновения вируса в клетку начинается, когда гликопротеид внешней оболочки ВИЧ gp120 связывается с рецепторами клетки-мишени: рецептором CD4 и хемокиновым корецептором CCR5 или CXCR4. После связывания gp120 c рецептором CD4 и хемокиновым корецептором происходят конформационные изменения трансмембранного гликопротеида gp41, которые обеспечивают слияние вирусной и клеточной мембран и тем самым позволяют ВИЧ проникнуть в клетку.

Ингибитор слияния T-20 (энфувиртид) — синтетический пептид, который ингибирует конформационные изменения gp41, необходимые для слияния вируса с клетками хозяина. Замена одной аминокислоты в gp41 способна снизить эффективность энфувиртида.

Передача устойчивых штаммов ВИЧ

Распространенность мутаций устойчивости у пациентов, не получавших антиретровирусных препаратов, в разных регионах различается. В европейском кооперированном исследовании, включавшем более 1600 пациентов с впервые диагностированной ВИЧ-инфекцией, распространенность первичных мутаций устойчивости в 1996-2002 гг. составила около 10%. Устойчивость обнаруживалась преимущественно у недавно инфицированных лиц с вирусом подтипа B (Wensing, 2003). Из 371 штамма, выделенного у не получавших антиретровирусных средств пациентов в 40 городах США, хотя бы одна мутация устойчивости была обнаружена у 14% пациентов. (Ross, 2004). В исследованиях, проведенных в Сан-Франциско и Испании, распространенность устойчивости у пациентов с острой или ранней бессимптомной стадиями ин-

фекции была еще выше — 26% и 19% соответственно (Grant, 2003; de Mendoza, 2003).

Клиническое значение первичных мутаций, уже имеющихся к началу лечения, несомненно: эти мутации могут ограничивать выбор терапии. С другой стороны отмечено, что у пациентов, не получавших антиретровирусных средств, они не всегда влияют на результаты лечения (Hicks, 2003; Little, 2002; Hanna, 2001; Balotta, 1999). При тщательном рассмотрении всех исходных мутаций устойчивости первичный успех лечения часто достижим. В ретроспективном исследовании, включавшем 202 пациента, показано, что в тех случаях, когда лечение начинали, не располагая сведениями о лекарственной устойчивости, у пациентов с исходными мутациями ответ на лечение развивался медленнее, а риск неудачи лечения был выше (Little, 2002).

Клинические исследования

Клиническая польза оценки устойчивости до замены схемы терапии была подтверждена в проспективных контролируемых исследованиях — как в отношении фенотипирования (Cohen, 2000), так и генотипирования (Durant, 1999; Baxter, 1999; Tural, 2001). У пациентов, чьи лечащие врачи получили информацию об имеющихся мутациях до смены терапии, удалось добиться большего снижения вирусной нагрузки, чем у пациентов, у которых профиль вирусной устойчивости не был известен.