Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

•Каждый образец от конкретного донора обозначается номером, следующим за его личным кодом. Так, например, восьмой образец, собранный донором BT, обозначается BT-8.

•Буквенный код и номер образца должны быть написаны на каждой соломине или пробирке черным несмываемым маркером. В качестве альтернативы используйте напечатанные этикетки с указанием имени, фамилии и даты рождения пациента и даты криоконсервации. Такие этикетки должны быть предназначены для использования в жидком азоте. Должное внимание следует уделять тому, чтобы выбранные этикетки не могли быть повреждены со временем.

•Минибокалы (или альтернативные сосуды), в которых хранятся соломины, должны также иметь наклейки с четкой маркировкой, содержащей код и номер образца, и в них должны содержаться только образцы, полученные от данного пациента в данном случае.

•Для быстрой идентификации может быть также полезна цветовая маркировка более крупных бокалов, содержащих многочисленные образцы, и минибокалов.

•По мере использования хранящихся сперматозоидов количество соломин или пробирок корректируется в базе данных.

Примечание. Все процедуры, связанные с идентификацией образцов доноров или пациентов, включая получение образцов, подготовку и маркировку соломин, помещение в контейнеры и размораживание соломин для использования или удаления, должны быть дважды проверены более чем одним сотрудником, и сведения об этой проверке должны быть зафиксированы в лабораторных записях. В идеале в любой момент времени лаборант должен обрабатывать только один образец эякулята.

Все образцы должны иметь код, позволяющий идентифицировать их во время хранения и транспортировки из банка спермы в принимающий центр.

6.5 Витрификация

Появляются данные, свидетельствующие о том, что витрификация может быть ценным методом криоконсервации эякулированных сперматозоидов (404). Принцип метода заключается в сверхбыстром замораживании небольшого объема образца при непосредственном контакте с жидким азотом, не содержащим загрязнений, что должно предотвратить образование льда и уменьшить осмотическое повреждение. Возможна также витрификация в соломинах (асептическая витрификация), при которой используется закрытая система и не требуется стерильный жидкий азот. Витрификация может быть проведена для цельной спермы или отдельных сперматозоидов с использованием как проникающих, так и непроникающих разбавителей и может быть использована для криоконсервации одного или небольшого числа сперматозоидов (405). Вместе с тем на данный момент получено ограниченное количество данных об улучшении параметров сперматозоидов после их размораживания после витрификации по сравнению с традиционными методами (406), и поэтому витрификацию сперматозоидов следует рассматривать как экспериментальную процедуру.

208

Глава 6. Криоконсервация сперматозоидов

6.5.1.1 Протокол прямой витрификации

При витрификации в сочетании с использованием так называемых «открытых» устройств требуется прямое воздействие жидкого азота на образец, а такое воздействие создает дополнительные риски контаминации. Рекомендуется всегда использовать стерильный жидкий азот. Кроме того, эта процедура может быть опасной для лаборанта, который всегда должен использовать соответствующие средства защиты.

Материалы

•криопротекторы;

•стерильный жидкий азот;

•бокс для жидкого азота;

•небольшое ситечко для сбора витрифицированных сфер;

•криопробирки.

Метод (из документа Исаченко и др. (404))

1.После разведения равным объемом разбавителя10 эякулят, капля за каплей, непосредственно погружают в свободный от загрязнений жидкий азот, используя одноразовый контейнер.

2.Затем полученные сферы помещают в криопробирки, которые незамедлительно погружают в жидкий азот и хранят в нем.

6.5.1.2 Протокол витрификации в соломинах

При витрификации в соломинах (асептическая витрификация) используется закрытая асептическая система в виде двойных (одна внутри другой) полностью запечатанных соломин без прямого контакта с жидким азотом, и этот метод позволяет витрифицировать больший объем образца (100 мл) с большим количеством сперматозоидов (404, 407, 408). Эта процедура менее опасна для лаборанта.

Материалы

•соломины объемом 0,5 мл и 0,25 мл;

•среда для витрификации;

•бокс для жидкого азота;

•конические пробирки объемом 10 мл;

•среда для подогревания.

Метод 1. Приготовьте 1 мл витрификационной среды:

10 Тип разбавителя, температура криопротектора и время воздействия криопротектора на клетки имеют решающее значение и могут повлиять на эффективность процесса.

209

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

•0,5 М сахарозы, растворенной в воде (например MP Biomedicals, Cat. 152584): 0,495 мл;

•Dextran Serum Supplement (e.g. IrvineScientific, Cat. 9301): 0,010 мл.

2.Используйте сперматозоиды (свободные от семенной плазмы), отобранные методом всплытия или путем центрифугирования в градиенте плотности в соответствии с параметрами сперматозоидов и протоколами местной лаборатории.

3.После извлечения отобранных сперматозоидов произведите подсчет сперматозоидов, сконцентрируйте их центрифугированием (8–10 минут при 300g), полностью удалите супернатант и добавьте соответствующее количество витрификационной среды для ресуспендирования осадка (рассчитывается следующим образом):

•объем суспензии для витрификации на соломину (объемом 0,25 мл): 100 мкл

•концентрация эякулята на соломину: 0,1–3,0 x106 сперматозоидов

Пример:

Всего извлечено 15 x106 сперматозоидов

Целевое количество для консервации: 3 x106 сперматозоидов/100 мкл (объем на соломину)

1 мл = 30 x106 сперматозоидов

X vol = 15 x106 извлеченных сперматозоидов

Следовательно,X=0,5млвитрификационнойсреды(0,5млвитрификационной среды позволит получить 5 x 100 мкл соломин, каждая из которых содержит

3 x106 сперматозоидов).

4.Смешайте осадок сперматозоидов с витрификационной средой непосредственно перед витрификацией (при комнатной температуре). Не рекомендуется подвергать клетки воздействию витрификационной среды в течение длительного времени.

5.Соломина объемом 0,25 мл должна быть обрезана на две трети своей первоначальной длины. Затем она располагается горизонтально, и в открытый конец с помощью пипетки набирается аликвота объемом 100 мкл. На всех последующих стадиях необходимо сохранять горизонтальное положение соломины, чтобы не потерять аликвоту.

6.Затем эта соломина вставляется в соломину объемом 0,5 мл, которая термозапечатывается с обоих концов. Соломину следует незамедлительно погрузить в жидкий азот на 5 секунд в горизонтальном положении с помощью пинцета и затем хранить в жидком азоте.

Процедура подогревания после витрификации

1.Приготовьте среду для подогревания.

2.Разморозьте содержимое соломин/криопробирок в среде, предварительно подогретой до 42–43°C.

210