6 курс / Кардиология / Иммунопрофилактика_пневмококковых_инфекций_Брико_Н_И_ред_,_Симонова

Учебно-методическое пособие для врачей «Иммунопрофилактика пневмококковых инфекций»

к ванкомицину штаммов, которые могут быть ошибочно отнесены к чувствительным из-за неспособности расти в его присутствии.

Для выявления носительства нескольких штаммов пневмококков с разной устойчивостью к антибиотикам тестируют множество колоний из материала носоглотки. Если в материале доминирует какой-либо один устойчивый к антибиотикам вариант, а удельный вес других невелик (например, составляет 1%), число исследуемых колоний, необходимых для их выявления, должно быть велико. В этом случае используют среды с антибиотиками. Обычно сначала образец засевают на агар с кровью и гентамицином, который ингибирует рост грамотрицательных бактерий, а также на среду с антибиотиком, в отношении которого проводится анализ, например, с пенициллином. Используют и подход, совмещающий технику реплик с ДНК-гибридизацией, который позволяет выявлять клетки пневмококков, несущие соответствующие гены устойчивости к антибиотикам. Такой подход показан для выявления генов ermA, tetM, mefE и cat, не выявляемых в чувствительных популяциях пневмококков. Помимо этих методов определения устойчивости пневмококков к антибиотикам разработаны другие, позволяющие одновременно проводить и их идентификацию.

Так, для определения устойчивости к -лактамам и триметоприм/сульфаметоксазолу используют ПЦР, позволяющую одновременно выявить родство у разных устойчивых изолятов. Для идентификации пневмококков и выявления различий среди устойчивых и чувствительных к пенициллину штаммов используют олигонуклеотиды, специфические для чувствительных и нечувствительных к пенициллину штаммов. Эти нуклеотиды являются частью аллелей генов, синтезирующих соответствующие пенициллинсвязывающие белки.

Другой экспресс метод основан на том, что последовательности генов устойчивости к пенициллину и триметоприм/сульфаметоксазолу одинаковы у чувствительных культур, а у резистентных они варьируют. Поэтому генерируемые в ПЦР ампликоны гено-специфической устойчивости в большинстве случаев отличаются по профилю рестрикции от ампликонов из чувствительных штаммов. Фингерпринт генов устойчивости к пенициллину и гена, кодирующего устойчивость к триметоприм/сульфаметоксазолу, в сочетании с пульс-электрофорезом, который характеризует общее геномное сходство изолятов, позволяет быстро провести

41

Учебно-методическое пособие для врачей «Иммунопрофилактика пневмококковых инфекций»

дифференциацию чувствительных и устойчивых штаммов пневмококков. При этом изоляты, идентичные в многолокусном электрофорезе ферментов, пульсэлектрофорезе или многолокусном сиквенс-типировании, и которые имеют один и тот же измененный РВР или dhf-ген, относят к одному клону. В отличие от этого штаммы с генами, имеющими множественные изменения, относят к генетически неродственным культурам, скорее всего, возникшим при горизонтальном переносе РВР или dhf – гена. Подобным образом считают, что штаммы разных серотипов, неотличимые по генам устойчивости и данным пульс-электрофореза, возникли в результате горизонтального переноса генов, кодирующих антиген капсулы. Поскольку этот метод предназначен для анализа мозаичных генов, возникающих при трансформации, он не выявляет штаммы с точечной мутацией.

Таким образом, ПЦР анализ, основанный на использовании специфичных праймеров, пригоден как для выявления пневмококков в клиническом материале, так и для оценки устойчивости пневмококков к триметоприм/сульфаметоксазолу и

-лактамам. Поскольку методы, основанные на определении чувствительности в ПЦР, не позволяют дать количественную оценку МПК, «золотым» стандартом остается определение МПК антибиотиков для чистых культур с помощью серийных разведений.

ПЦР или методы, основанные на гибридизации, могут быть использованы и для определения устойчивости пневмококков к тетрациклину, эритромицину, канамицину и хлорамфениколу, так как выявление ответственных за устойчивость последовательностей генов всегда или почти всегда коррелирует с устойчивостью фенотипа. Из-за широкого распространения этих детерминант устойчивости у многих видов бактерий требуется чистая культура. Устойчивость к тетрациклину определяют с помощью tetM- и tetO – зондов или праймеров, а к эритромицину – ermAM – или mefE зондами (первый из которых используется для предсказания устойчивости к клиндамицину и стрептограмину В). Выявление устойчивости к хлорамфениколу и канамицину основано на зондах cat и apha или праймерах. Альтернативно, Tn1545- и Tn5253 специфические последовательности обычно выявляют специфические профили устойчивости. Поэтому одна гибридизация со специфическим зондом или праймером может помочь установить происхождение множественной устойчивости.

42

Учебно-методическое пособие для врачей «Иммунопрофилактика пневмококковых инфекций»

В России степень чувствительности пневмококков к антибиотикам проводят согласно методическим указаниям по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам [2004], которые принципиально сходны со стандартами NCCLS (национального комитета по клиническим лабораторным стандартам, США) [NCCLS, 1998]. В методических указаниях, разработанных российскими специалистами, приведены критерии чувствительности S. pneumoniae к различным антибиотикам ( -лактамам,

макролидам, линкозамидам и другим).

В последние годы специалисты NCCLS регулярно пересматривали критерии чувствительности (устойчивости) пневмококков к антибиотикам,. Это связано с тем, что изначально критерии были предложены с учетом данных, полученных при лечении менингита, но не отита, синусита или пневмонии, а -лактамы оставались эффективными при лечении инфекций дыхательных путей, вызванных безусловно устойчивыми к ним пневмококками. Поэтому был изменен критерий чувствительности к амоксициллину, но это полностью проблему не решило, поскольку по данным антибиотикограммы создавалось впечатление, что амоксициллин значительно эффективнее пенициллина или цефалоспоринов третьего поколения. В последующем при оценке эффективности лечения антибиотиками и степени устойчивости к ним стали учитывать данные фармакокинетики и фармакодинамики. Такой подход позволил предсказывать клиническую эффективность антибиотиков, пересмотреть критерии чувствительности к ним и скорректировать тактику лечения пневмококковых инфекций верхних дыхательных путей. В конечном счете, в 2000-2001 гг. специалисты NCCLS, основываясь на данных фармакокинетики и клинических наблюдений, в очередной раз пересмотрели критерии чувствительности пневмококков к некоторым -лактамам при лечении пневмонии, которые учтены при составлении МУ 4.2. 1890-04.

Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения чувствительности S. pneumoniae из различных локусов организма представлен в таблице 2.

43

Учебно-методическое пособие для врачей «Иммунопрофилактика пневмококковых инфекций»

Таблица 2. Рекомендуемый перечень АБП для определения чувствительности S. pneumoniae

Примечание: * - используется только метод серийных разведений в бульоне.

При пересмотре критериев интерпретации результатов определения чувствительности S. pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам проведено

44

Учебно-методическое пособие для врачей «Иммунопрофилактика пневмококковых инфекций»

подразделение штаммов по источникам выделения (инфекции дыхательных путей, ликвор) и пересмотрены критерии оценки чувствительности к амоксициллину, цефотаксиму и цефтриаксону. Критерии интерпретации результатов определения чувствительности к пенициллину не пересмотрены.

Следует обратить внимание на следующие важные особенности определения чувствительности S. pneumoniae:

1.невозможность определения чувствительности к бета-лактамным антибиотикам (пенициллину, аминопенициллинам, цефалоспоринам, карбапенемам) при использовании ДДМ;

2.невозможность определения чувствительности S. pneumoniae к антибактериальным препаратам (АБП) методом разведений в агаре.

Поэтому определение чувствительности пневмококков к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам подразумевает последовательное (при выделении

S. pneumoniae из нестерильных локусов) или одновременное (при тяжелых инфекциях, выделении пневмококков из крови и ликвора) выполнение двух исследований.

1.Скрининг с диском, содержащим 1,0 мкг оксациллина, с целью выявления возможной устойчивости к пенициллину, что позволяет разделить микроорганизмы на группу чувствительных штаммов и группу, в которую входят часть чувствительных, а также умеренно-резистентные и резистентные штаммы пневмококков.

2.Определение МПК пенициллина и других бета-лактамных антибиотиков методом разведений в бульоне или с помощью Е-тестов у штаммов, отнесенных по результатам скрининга ко второй группе.

Скрининг на чувствительность к пенициллину. Методика не отличается от обычной процедуры определения чувствительности пневмококков к АБП ДДМ. При диаметре зоны подавления роста пневмококков вокруг диска с 1 мкг оксациллина >20 мм S. pneumoniae расценивается как чувствительный ко всем бета-лактамным антибиотикам.

При диаметре зоны подавления роста <20 мм необходимо определение МПК всех бета-лактамных антибиотиков (пенициллина, аминопенициллинов, цефалоспоринов II-IV поколений, карбапенемов) методами серийных разведений в бульоне или с помощью Е-тестов.

45

Учебно-методическое пособие для врачей «Иммунопрофилактика пневмококковых инфекций»

Макролиды и линкозамиды. Оценка чувствительности S. pneumoniae возможна как диско-диффузионным методом, так и методом серийных разведений. В связи с разнообразием механизмов устойчивости S. pneumoniae к макролидам в повседневной практике могут встречаться различные варианты перекрестной резистентности к АБП этой группы.

Однако в практических целях для характеристики чувствительности S. pneumoniae к макролидам и линкозамидам достаточно оценить чувствительность к эритромицину и клиндамицину, что позволяет дифференцировать два основных фенотипа:

MLSB – перекрестная устойчивость ко всем макролидам, линкозамидам и стрептограминам В, обусловленная метилированием мишени действия препаратов.

М – устойчивость к 14-ти и 15-членным макролидам (сохранение чувствительности к 16-ти членным макролидам, линкозамидам и стрептограминам), обусловленная активным выведением АБП.

Фторхинолоны. Пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин и ломефлоксацин не эффективны при лечении пневмококковых инфекций. Поэтому оценивать чувствительность к ним нецелесообразно. В последние годы в лечении пневмококковых инфекций важное место заняли фторхинолоны (левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин и гатифлоксацин). Частота устойчивости к этим препаратам минимальна, однако поскольку полная перекрестная резистентность между ними не наблюдаются, необходимо включение в исследование всей группы.

АБП других групп. Из антибиотиков других групп для лечения пневмококковых инфекций применяют ко-тримоксазол, хлорамфеникол, тетрациклины. Однако роль этих препаратов в последние годы снижается в связи с нарастанием устойчивости, меньшей клинической эффективностью в сравнении с беталактамами, макролидами и антипневмококковыми фторхинолонами, а также значительным числом нежелательных эффектов.

Для лечения тяжелых пневмококковых инфекций, вызванных штаммами с высоким уровнем устойчивости к антибактериальным препаратам других групп, рекомендуется ванкомицин.

46

Учебно-методическое пособие для врачей «Иммунопрофилактика пневмококковых инфекций»

.Допустимые диапазоны значений МПК и диаметров зон подавления роста для S. pneumoniae ATCC 49619 представлены в таблицах 3-5.

Таблица 3. Допустимые диапазоны значений МПК (мг/л) контрольных штаммов стрептококков для метода серийных микроразведений в бульоне

47

48

Учебно-методическое пособие для врачей «Иммунопрофилактика пневмококковых инфекций»

*Примечание: по данным CLSI.

Таблица 4. Допустимые диапазоны значений диаметров зон подавления роста (мм) контрольного штамма S. pneumoniae ATCC 49619

49

Учебно-методическое пособие для врачей «Иммунопрофилактика пневмококковых инфекций»

50