Полезные материалы за все 6 курсов / Ответы к занятиям, экзаменам / 4. Введение в вирусологию

Фазы взаимодействия сложноустроенного вирулентного бактериофага

с клеткой:

Адсорбция (отростковой частью фага) на клеточной стенке бактерий. В эту фазу рецепторы базальной пластинки и нитей прикрепления специфически взаимодействуют с определенными рецепторами клеточной стенки бактерий.

На бактериях, лишенных клеточной стенки (L-формы, микоплазмы), фаги не адсорбируются.

Проникновение нуклеиновой кислоты фага в клетку: происходит сокра-

щение чехла отростка и растворение с помощью фагового лизоцима неболь-

шого участка клеточной стенки бактерии. Затем ДНК из головки бактериофа-

га через канал отростка инъецируется (впрыскивается) в цитоплазму клетки,

при этом оболочка фага остается на поверхности бактериальной клетки.

Синтез фаговых частиц (подобно синтезу вирусов в эукариотической клет-

ке): происходит репликация нуклеиновой кислоты бактериофага с образова-

нием множества копий, а на рибосомах бактериальной клетки – синтез фаго-

вых белков головки и отростка.

Композиция фаговых частиц: происходит сборка белковых оболочек и нуклеиновых кислот и формируются зрелые бактериофаги.

Выход фагов из бактериальной клетки путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется за счет свободного лизоцима, выделяемого множеством фа-

гов, что приводит к гибели бактерий в результате ее осмотического лизиса.

Репродукция вирулентного фага в популяции бактерий, выращенных в жидкой питательной среде (МПБ), сопровождается их лизисом и просветлени-

ем среды (рисунок 8а). В популяции чувствительных бактерий, выращенных сплошным газоном на плотной питательной среде (МПА), фаги образуют зоны очагового лизиса (рисунок 8б), которые называются «негативными колониями» или стерильными бляшками.

31

Рисунок 8 – Результат взаимодействия вирулентного бактериофага с бак-

териальной популяцией на жидкой и плотной питательной среде

Умеренные фаги чаще взаимодействуют с клеткой по типу интегративной вирусной инфекции: ДНК фага интегрируется с ДНК клетки и называется про-

фагом. Став частью хромосомы бактерии, профаг, при ее размножении, пере-

дается бактериальному потомству. Клетка, несущая профаг, называется лизо-

генной. Под влиянием различных факторов (УФ-света, некоторых химических веществ) связь профага с ДНК бактериальной клетки нарушается и профаг пе-

реходит в цитоплазму клетки, где размножается и ведет себя как вирулентный.

Практическое применение бактериофагов

I. Для диагностики инфекционных заболеваний используют метод фа-

готипирования, когда с помощью известного набора фагов определяют фаго-

вариант исследуемых бактерий. Метод основан на высокой специфичности фа-

гов, т.е. способности взаимодействовать только с бактериями, имеющими спе-

цифические рецепторы для адсорбции фага и лизиса этих бактерий. Фаготипи-

рование используют для диагностики брюшного тифа, дизентерии, холеры,

стафилококковых инфекций (рисунок 9).

32

Рисунок 9 – Фаготипирование стафилококков с помощью набора различ-

ных типоспецифических фагов.

Метод фаготипирования имеет важное эпидемиологическое значение, т.к.

позволяет установить связи между источником инфекции и отдельными слу-

чаями заболевания. Выделение бактерий одного фаговарианта от разных боль-

ных указывает на общий источник их заражения.

II.Для лечения.

Однокомпонентные препараты бактериофагов:

-стафилококковый бактериофаг (при гнойно-воспалительных заболева-

ниях, вызванных стафилококками);

-бактериофаг P.aeruginosa (при гнойно-воспалительных заболеваниях,

вызванных синегнойной палочкой);

-клебсиеллезный бактериофаг (при заболеваниях, вызванных клебсиел-

лами).

Комбинированные многокомпонентные препараты бактериофагов:

-коли-протейный бактериофаг (для лечения эшерихиозов и дисбактерио-

зов, вызванных бактериями рода Proteus);

-пиобактериофаг (для лечения стафилококковой, стрептококковой, клеб-

сиеллезной, протейной, синегнойной инфекции и эшерихиозов);

-интести-бактериофаг (для лечения бактериальной дизентерии, сальмо-

неллезов, эшерихиозов, а также протейной, стафилококковой, энтеро-

кокковой и синегнойной инфекций).

33

Бактериофаги применяют местно путем аппликации на раневую или ожо-

говую поверхность, введением в полости (брюшную, плевральную, мочевой пу-

зырь), через рот, а также ректально. Соответственно способу применения пре-

параты бактериофагов выпускают в различных лекарственных формах (жидкая форма, таблетки, мази, свечи, аэрозоли). Перед назначением бактериофага

необходимо поставить пробу на чувствительность к нему выделенной

культуры микроорганизмов.

III.Для профилактики брюшного тифа и дизентерии у людей, контак-

тировавших с больным, используют брюшнотифозный и поливалентный дизен-

терийный бактериофаги.

3. Организация генетического материала бактериальной клетки. Факторы

внехромосомной наследственности.

Генетический материал бактериальной клетки представлен хромосом-

ной ДНК с гаплоидным набором генов. Хромосомная ДНК находится в супер-

спирализованной форме в виде кольца.

В бактериях могут присутствовать внехромосомные молекулы ДНК: плаз-

миды, транспозоны, вставочные последовательности.

Хромосомный и внехромосомный генетический материал свободно распо-

лагается в цитоплазме.

Факторы внехромосомной наследственности

Факторы внехромосомной наследственности (плазмиды, транспозоны,

вставочные последовательности) состоят из молекул ДНК, не являются жиз-

ненно важными для бактерий, но придают им новые свойства.

Плазмиды – кольцевидные молекулы ДНК, способные к саморепликации и несущие от 40 до 50 генов. Они находятся в автономном состоянии в цито-

плазме бактерий и способны к самопереносу из одной клетки в другую при конъюгации. Плазмиды кодируют свойства, дающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования.

34

Плазмиды подразделяют на различные категории в зависимости от свойств, которые они кодируют у бактерий (таблица 7):

Таблица 7 – Классификация плазмид

Подвижные генетические элементы

Транспозоны – подвижные участки ДНК, которые способны перемещать-

ся внутри бактериальной хромосомы или между ДНК бактерий, плазмид и бак-

териофагов («прыгающие гены»). Помимо генов, кодирующих их способность к перемещению по ДНК, транспозоны могут содержать структурные гены,

обеспечивающие бактерию новыми свойствами (устойчивость к антибиотикам,

токсинопродукция и др).

Вставочные последовательности или инсерционные элементы (от англ. insertion sequens – вставочные последовательности) – простейший тип генети-

ческих элементов, мигрирующих между хромосомами, внутри хромосомы, ме-

жду хромосомой и плазмидами. Содержат гены, необходимые для их переме-

щения, новых свойств не кодируют.

35

Подвижные генетические элементы могут:

-распространять новые гены в популяции бактерий;

-координировать взаимодействие плазмид с хромосомой;

-вызывать изменения генов (мутацию, инактивацию) в местах их внедре-

ния в генетический материал.

Таким образом, внехромосомные молекулы ДНК бактериальной клетки способствуют разнообразным изменениям бактериального генома, появлению новых свойств и эволюционным изменениям микробной популяции в целом.

4. Виды генетической изменчивости. Использование генной инженерии в

медицине.

Мутации – это изменения последовательности нуклеотидов в бактериаль-

ной ДНК, которые ведут к изменению или утрате одного или нескольких фено-

типических признаков. Мутации у бактерий происходят с высокой частотой под влиянием очень многих внешних факторов, которые называются мутагена-

ми. Самые частые мутагены: УФ-, γ-лучи (физические), органические и неорга-

нические вещества (химические), транспозоны (биологические). Мутации бы-

вают: точечными (затрагивают один ген) и более протяженными (целый уча-

сток хромосомы). Они могут быть самопроизвольными и вызванными искусст-

венно. Мутации, которые приводят к возникновению новых полезных свойств,

обеспечивают выживаемость бактериальных популяции.

Генетические рекомбинации – это передача новых генов от одной клетки к другой с приобретением новых свойств, закодированных в этих генах. Гене-

тические рекомбинации отличаются друг от друга способом попадания в клетку новых генов.

Виды генетических рекомбинаций: трансформация, конъюгация,

трансдукция, фаговая конверсия.

Трансформация – форма генетической изменчивости, при которой бакте-

рия-реципиент поглощает из внешней среды трофическим путем фрагменты ДНК погибшей бактерии-донора. Это приводит к образованию рекомбинант-

36

ных бактерий, обладающих некоторыми свойствами донорских клеток (рисунок

10).

Рисунок 10 – Трансформация у бактерий (схема)

Впервые феномен трансформации был установлен Ф. Гриффитсом в

1928 г. на модели бескапсульного и капсульного пневмококков (рисунок 11).

Следует напомнить, что капсула пневмококков – мощный фактор патогенности,

способствующий возникновению септического течения инфекции и гибели ла-

бораторного животного. Для проведения опыта в качестве индикатора исполь-

зовали 3 белые мыши. Первую мышь заражали живыми, бескапсульными неви-

рулентными пневмококками. Второй мыши вводили убитую культуру капсуль-

ных вирулентных пневмококков; третьей мыши – смесь живых бескапсульных пневмококков и убитых капсульных пневмококков.

В результате из всех мышей, взятых в опыт, погибала третья мышь, т.к.

живые бескапсульные пневмококки поглощали фрагменты ДНК убитых кап-

сульных, приобретали ген, кодирующий синтез капсулы, превращались в виру-

лентные пневмококки и убивали мышь.

37

Рисунок 11 – Опыт Ф. Гриффитса по трансформации пневмококков

Конъюгация – передача генетического (хромосомного и нехромосомного)

материала от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при их непосредствен-

ном контакте (рисунок 12). Необходимым условием для конъюгации является наличие у бактерии-донора F-плазмиды, которая контролирует синтез половых pili на поверхности клеток-доноров.

Рисунок 12 – Конъюгация у бактерий (а – электронная микроскопия, б – схема)

Процесс конъюгации между бактерией-донором (F+) и бактерией-

реципиентом (F-) имеет следующие стадии:

установление контакта между донором и реципиентом с помощью половых

pili;

38

прохождение генетического материала через канал половой pili от донора к реципиенту;

рекомбинация между донорской и реципиентной ДНК.

F-плазмида может находиться как в автономном состоянии в цитоплазме,

так и в интегрированном с хромосомой клетки. Находясь в автономном состоя-

нии, она контролирует только собственный перенос при конъюгации. В резуль-

тате F- клетка превращается в F+ клетку, содержащую F-плазмиду и способную к конъюгации. Если F-плазмида интегрирована с хромосомой бактерии, то при конъюгации она контролирует не только собственный перенос, но и перенос части хромосомной ДНК в клетку-реципиент. С помощью интегрированной F-

плазмиды частота переноса хромосомных генов между бактериями существен-

но возрастает.

Трансдукция – перенос небольшого фрагмента хромосомной ДНК от клетки-донора к клетке-реципиенту с помощью умеренного бактериофага (ри-

сунок 13). В результате трансдукции бактерия-реципиент приобретает новые фенотипические признаки (ферментативные свойства, устойчивость к антибио-

тикам и др.). При выходе бактериофага из клетки-реципиента, фрагмент донор-

ской трансдуцированной ДНК остается в хромосоме клетки, следовательно, со-

храняются и новые фенотипические признаки. Таким образом, при трансдукции умеренный бактериофаг выполняет только транспортную функцию.

Рисунок 13 – Трансдукция у бактерий

39

Фаговая конверсия (от лат conversion – превращение) – получение бакте-

рией новых свойств в результате использования генов профага, интегрирован-

ного с бактериальной хромосомой. Например, ДНК умеренного дифтерийного фага содержит ген, который кодирует синтез дифтерийного экзотоксина (ген tox). Если ДНК такого умеренного фага интегрируется с ДНК дифтерийной па-

лочки, то она превращается в токсигенную, т.е. продуцирующую дифтерийный экзотоксин. При выходе из клетки умеренного фага дифтерийные бактерии ут-

рачивают ген tox и теряют способность к продукции экзотоксина. Лизогенная конверсия выявлена также у возбудителей ботулизма, холеры и др.

Использование генной инженерии в медицине

Получение живых вакцин. В основе лежит принцип аттенуации, предложен-

ный Л. Пастером. Аттенуация – ослабление вирулентности микробов под действием физических, химических или биологических факторов с сохране-

нием их иммуногенных свойств. Например, вакцинный штамм туберкулез-

ных бактерий (БЦЖ) был получен А.Ш. Кальметом и Ж-М.К. Жереном пу-

тем длительного (13 лет) выращивания возбудителя туберкулеза на пита-

тельной среде с желчью.

Получение генно-инженерных вакцин (рекомбинантная дрожжевая вакцина против вирусного гепатита В содержит протективный HBs-антиген вируса).

Разработка и внедрение в практику молекулярно-биологических методов ди-

агностики инфекционных заболеваний, например, ПЦР.

Получение штаммов бактерий и микроскопических грибов с высокой про-

дукцией антибиотиков.

Получение инсулина, гормонов, интерферона и других биологических ве-

ществ в бактериальных клетках с помощью генно-инженерных методов.

40