Полезные материалы за все 6 курсов / Ответы к занятиям, экзаменам / 4. Введение в вирусологию

ная репликация вирусной ДНК для новых вирусных частиц. Кроме того, на ДНК вируса под действием фермента «ДНК-зависимая РНК-полимераза» запускается синтез м-РНК, которая транслируется на рибосомы клетки-

хозяина для синтеза структурных белков оболочек вируса (рисунок 3).

Рисунок 3 – Процесс внутриклеточного синтеза ДНК-содержащих вирусов

V. Композиция вирусных частиц (сборка). Формирование зрелых вирусов.

VI. Выход вирусов из клетки.

4. Типы вирусной инфекции на уровне клетки.

Продуктивная:

- взрывной механизм: после репродукции вируса из погибающей клетки од-

новременно выходит большое количество вирионов. Такой тип инфекции характерен для простых вирусов;

- почкование: после репродукции вирусного нуклеокапсида происходит его контакт с определенным участком клеточной мембраны, выпячивание и отпочковывание вириона, покрытого мембраной, от клетки. Такой тип ин-

фекции характерен для сложных вирусов. При этом клетка способна дли-

тельно сохранять жизнеспособность. Она становится источником вирусной инфекции для здоровых клеток, постоянно продуцируя вирусные частицы почкованием.

Абортивная: не завершается образованием вирусного потомства и гибе-

лью клетки. Это обусловлено либо дефектностью самого вируса, либо генети-

ческой резистентностью клетки к данному вирусу.

11

Интегративная: не приводит к гибели клеток. При этой форме инфекции

вирусная ДНК встраивается в геном клетки-хозяина и в последующем при де-

лении передается дочерним клеткам.

В зависимости от типа вирусной нуклеиновой кислоты различают два

варианта интегративной инфекции:

для ДНК-содержащих вирусов: происходит интеграция ДНК вируса с ДНК клетки-хозяина;

для РНК-содержащих вирусов: на вирусной РНК под действием фермента

«РНК-зависимая ДНК-полимераза» (обратная транскриптаза или ревертаза)

синтезируется ДНК. Затем образовавшаяся вирусная ДНК интегрируется с ДНК клетки-хозяина.

В результате интегративной инфекции возможно превращение (трансфор-

мация) нормальных клеток в опухолевые. Интегративная инфекция характерна для онкогенных (опухолевых) вирусов и умеренных бактериофагов.

5.Вирусный онкогенез. Механизмы. Основные онкогенные вирусы, вызы-

вающие опухоли у человека.

В 50-х годах XX столетия Л.А. Зильбер сформули-

ровал вирусо-генетическую теорию, согласно кото-

рой вирусная ДНК интегрирует с ДНК клетки-

хозяина, что приводит к трансформации нормаль-

ных клеток в опухолевые.

Л.А. Зильбер (советский иммунолог и вирусолог)

Механизм интегративной инфекции для РНК-содержащих онкогенных ви-

русов был выяснен намного позже, после открытия фермента «обратная транс-

криптаза» (см. выше). Последующие исследования выявили новые данные о

роли ДНК- и РНК-содержащих вирусов в онкогенезе.

12

В геноме нормальных клеток существуют клеточные онкогены (протоон-

когены). Они находятся в неактивном состоянии и кодируют белки, стимули-

рующие размножение клеток во время эмбрионального развития, а также к рост и размножение клеток во взрослом состоянии, когда в этом есть необходи-

мость.

Онкогенез для ДНК-содержащих вирусов

Некоторые ДНК-содержащие вирусы имеют онкогены, сходные с челове-

ческими. Функции вирусных онкогенов разнообразны и при интеграции ДНК вируса в геном клетки человека они могут нарушать синтез нормальных факто-

ров размножения клетки на разных этапах. Итогом таких взаимодействий явля-

ется избыточное размножение клетки и деление ее в незрелом состоянии.

Так формируется опухоль.

Онкогенез для РНК-содержащих вирусов

РНК-содержащие вирусы, способны индуцировать онкогенез, выступая в роли канцерогенных факторов. На вирусной РНК с помощью собственного фермента «РНК-зависимая ДНК-полимераза» (обратная транскриптаза) синте-

зируются ДНК. Затем вирус встраивает в геном клетки свою ДНК-копию рядом с клеточным онкогеном и вызывает повышение его активности. Это

приводит к злокачественной трансформации клетки.

Основные онкогенные вирусы, вызывающие опухоли у человека.

ДНК-содержащие:

-семейство Papillomaviridae: вирусы папилломы человека – вызывают рак кожи, рак шейки матки;

-семейство Herpesviridae: вирус простого герпеса II типа – вызывает рак шейки матки, рак простаты; вирус Эпштейна-Барр – вызывает рак носоглот-

ки (назофарингеальный рак) и лимфому Беркитта (лимфоидную опухоль верхней челюсти); герпесвирус 8 типа – вызывает саркому Капоши;

- семейство Hepadnaviridae: вирус гепатита В – вызывает первичный рак пе-

чени.

13

РНК-содержащие:

-семейство Retroviridae: лимфотропные вирусы – вызывают Т-клеточные лимфомы, Т-клеточный лейкоз и др.;

-вирус гепатита С – вызывает рак печени.

6.Вироиды и инфекционные прионы.

Кроме типичных вирусов, существуют необычные инфекционные агенты:

вироиды и прионы.

Вироиды – в отличие от вирусов, состоят только из молекулы одноцепо-

чечной кольцевой РНК, обладающей инфекционными свойствами. Известно более 10 различных вироидов, вызывающих инфекционные заболевания у рас-

тений.

Инфекционные (патологические) прионы (от англ. рroteinacеous infections particle – белковая инфекционная частица) – белковые инфекционные агенты, приводящие к развитию летальных неврологических заболеваний – губчатых энцефалопатий.

Гайдушек Даниел Карлтон – американский педи-

атр и вирусолог раскрыл инфекционную природу неврологического заболевания куру, лауреат Нобе-

левской премии по физиологии и медицине 1976 г.

«за открытия, касающиеся новых механизмов про-

исхождения и распространения инфекционных за-

болеваний».

Гайдушек Д.К.

У человека и млекопитающих в клетках ЦНС имеются нормальные при-

оновые белки, выполняющие ряд регулирующих функций. Патогенез пораже-

ний обусловлен способностью инфекционного прионового белка при попада-

нии в нейрон образовывать агрегаты с нормальным прионовым белком. В ре-

зультате клеточный прион меняет пространственную конфигурацию молекулы:

14

α-спираль нормального белка заменяется другой изоформой – β-конформацией.

Такой белок не способен выполнять свои функции. Он накапливается в клетках мозга, формируя крупные конгломераты инфекционных прионов, что приводит к губкообразному перерождению серого и белого вещества головного мозга и развитию медленной летальной инфекции.

Прионы высоко резистентны ко многим факторам их инактивации. Явля-

ясь нормальными белками человека, они не вызывают защитных реакций (вос-

паление, выработка антител и др.).

7. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Молекулярно-биологический: обнаружение специфических участков ви-

русной нуклеиновой кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Теоретически данный метод позволяет обнаружить участок одной молекулы вирусной ДНК или РНК в любом образце биологического материала. Принцип ПЦР: многократное образование (гибридизация) копий специфического участка нуклеиновой кислоты вируса с последующей их идентификацией методом электрофореза.

Определение вирусных антигенов (экспресс-диагностика): вирусные антигены определяют в крови и других биологических жидкостях с помощью серологических реакций, чаще это РИФ и ИФА (см. учебно-методическое по-

собие «Учение об инфекции и иммунитете. Основы иммунологии», стр. 27-28).

Вирусологический: заражение исследуемым материалом биологической модели (куриный эмбрион, культура клеток, организм животного) с последую-

щей индикацией, а затем идентификацией обнаруженных вирусов.

Для размножения вирусов в курином эмбрионе исследуемый материал вводят в аллантоисную или амниотическую полость (культивируют вирусы гриппа, эпидемического паротита и др.).

Для размножения вирусов в культуре клеток исследуемым материалом заражают живые клетки различного происхождения: эмбриональные, нормаль-

15

ных тканей, опухолевые (культивируют вирусы полиомиелита, аденовирусы и др.).

Для размножения вирусов в организме лабораторных животных исполь-

зуют белых мышей (культивируют вирусы бешенства, клещевого энцефалита).

Помимо диагностики вирусных инфекций, культивирование вирусов про-

водят с целью получения вакцинных и диагностических препаратов.

Вирусоскопический: обнаружение в исследуемом материале включений,

образующихся в пораженных клетках при вирусной инфекции. Включения представляют собой скопления вирусов и продуктов реакции клетки на вирус-

ную инфекцию. Включения могут располагаться в цитоплазме или в ядре клет-

ки-хозяина. Чаще внутрицитоплазматические включения образуют РНК-

содержащие вирусы (например, включения Бабеша-Негри при бешенстве).

Внутриядерная локализация включений в большей степени характерна для ДНК-содержащих вирусов (например, включения при цитомегаловирусной ин-

фекции). В мазках видны гигантские клетки с внутриядерными включениями вирусов. Такие клетки напоминают «совиный глаз» (рисунок 4).

Рисунок 4 – Клетки «совиный глаз» с гигантскими ядрами при цитомега-

ловирусной инфекции

Серологический: определение противовирусных антител в сыворотке крови больного. Особенностью серологического метода диагностики вирусных инфекций является исследование парных проб сыворотки. Первую пробу сыво-

16

ротки берут у больного в начале заболевания, а вторую – через 10-14 дней. О

наличии вирусной инфекции свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностически значимой является сероконверсия для взрослых в 4 раза, а для детей – в 2 раза.

Практическая работа

1. Изучение под микроскопом готовых препаратов включений Бабеша-

Негри (окраска по Селлерсу). Краситель Селлерса состоит из 2-х частей 1%

раствора метиленовой сини в метиловом спирте и 1 части 1% раствора основ-

ного фуксина в метиловом спирте. Этот краситель наносят на 1-5 секунд на влажный, нефиксированный мазок-отпечаток из ткани мозга, чаще из области гиппокампа (аммонова рога) человека или животного, погибшего от бешенства.

При световой микроскопии с иммерсионной системой на голубом фоне цито-

плазмы нейронов видны розово-красные включения Бабеша-Негри. Включения четко контурированы, имеют овальную или продолговатую форму и зернистую структуру.

2. Вирусологический метод диагностики.

а) культивирование вирусов в курином эмбрионе (схема).

I этап исследования: заражение куриных эмбрионов в аллантоисную по-

лость материалом от больного с подозрением на гриппозную инфекцию.

С помощью овоскопа определяют расположение и границы воздушной ка-

меры (отметить карандашом). Скорлупу яйца в области воздушной камеры об-

рабатывают спиртовым раствором йода. Пробойником делают отверстие в цен-

тре камеры, затем шприцем вводят вируссодержащую жидкость в количестве

0,1-0,2 мл в аллантоисную полость. Отверстие парафинируют. Зараженные эм-

брионы помещают в термостат при 370С на 48 часов.

б) культивирование вирусов в культуре клеток Нер-2 (схема).

I этап исследования: приготовление перевиваемой культуры клеток Нер-2.

Для получения монослоя культуры клеток количество клеток во взвеси подсчитывают в камере Горяева. Взвесь клеток разводят средой 199 до количе-

17

ства 100 тысяч клеток в 1мл. В стерильный пенициллиновый флакон вносят стерильной пипеткой над пламенем спиртовки 1мл взвеси клеток в питательной среде 199, закрывают флакон стерильной резиновой пробкой. На флаконе ка-

рандашом по стеклу проводят продольную черту. Затем помещают флакон в специальный штатив в горизонтальном положении, чертой кверху, и ставят в термостат при 370С на 3-5 дней для получения монослоя клеток на стенке фла-

кона.

II этап исследования:

 микроскопический контроль выросшей культуры клеток Нер-2. Под ма-

лым увеличением микроскопа просматривают культуру клеток. Для заражения отбирают флаконы с полноценным монослоем (видны прозрачные, блестящие клетки, имеющие отростки, прикрепленные к стеклу);

 заражение культуры клеток смывом из носоглотки больного с подозре-

нием на аденовирусную инфекцию. Во флакон с полноценным монослоем кле-

ток над пламенем спиртовки вносят стерильной пипеткой вируссодержащую жидкость в объеме 0,1мл. Затем второй стерильной пипеткой добавляют во флакон 0,9мл среды 199 с бычьей сывороткой. Флаконы с зараженной культу-

рой клеток укладывают в штатив и ставят в термостат при 370С на 48-72 часа.

18

Занятие №2

Тема. Вирусологический метод диагностики. Интерфероны, классификация,

механизм действия, практическое применение. Особенности противовирусного иммунитета.

Цель занятия. Освоить принципы индикации и идентификации вирусов.

Изучить особенности противовирусного иммунитета.

I.Теоретические знания:

1.Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентификации вирусов.

2.Интерфероны, классификация. Механизм действия. Практическое примене-

ние.

3.Особенности противовирусного иммунитета

II.Практические навыки:

1.Изучить методику вскрытия вскрытие куриного эмбриона и взятие вируссо-

держащей аллантоисной жидкости.

2.Учет реакции гемагглютинации и торможения гемагглютинации для индика-

ции и идентификации вируса гриппа по демонстрации.

3.Учет цитопатогенного действия аденовирусов на культуру клеток по демон-

страции.

4.Учет реакции нейтрализации в культуре клеток для идентификации аденови-

русов по демонстрации.

19

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1.Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентифи-

кации вирусов.

Методы индикации вирусов

Индикацию (обнаружение) вирусов в материале от больного проводят

различными способами. Они зависят от метода культивирования вируса:

Если вирус способен размножаться в курином эмбрионе, то для его обна-

ружения используют реакцию гемагглютинации (РГА). Она основана на спо-

собности таких вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты с помощью фермента гемагглютинина, расположенного в суперкапсиде вируса. В результа-

те реакции in vitro наблюдается осадок эритроцитов в виде «перевернутого зон-

тика» – это положительный результат РГА. При отрицательной реакции – вы-

падает осадок эритроцитов с ровными краями. Используют для индикации ви-

русов гриппа.

Индикацию вирусов, культивируемых в культуре клеток, можно прово-

дить по их цитопатогенному действию (ЦПД) на клетки (рисунок 5). Это дей-

ствие выражается в повреждении монослоя зараженной культуры клеток и из-

менении их морфологии: клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость. Эти изменения обозначают термином «дегенерация клеток». В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла – нарушение

монослоя. Используют для индикации аденовирусов. а) б)

Рисунок 5 – Культура клеток: нормальная (а), дегенерированная (б)

20