Полезные материалы за все 6 курсов / Ответы к занятиям, экзаменам / 4. Введение в вирусологию

Индикацию вирусов, культивируемых в организме лабораторных живот-

ных, проводят по факту гибели животного. Используют для индикации вируса бешенства.

Методы идентификации вирусов

Идентификацию вирусов проводят по антигенным свойствам с помощью серологических реакций со специфическими диагностическими противовирус-

ными сыворотками. Основными реакциями являются: реакция торможения ге-

магглютинации, реакция нейтрализации в культуре клеток или в организме жи-

вотного, реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментный анализ

(ИФА).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА): 2-компонентная, слож-

ная серологическая реакция.

Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типо-

вые противовирусные диагностические сыворотки (Ат).

Индикатор реакции: 1% взвесь эритроцитов.

Постановка реакции: готовят разведения диагностических сывороток в лунках полистироловой пластины. К ним добавляют вируссодержащую жид-

кость и оставляют на 30-40 минут при комнатной температуре. Затем в лунки вносят взвесь эритроцитов. Учет реакции проводят через 1-2 часа.

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Ви-

русный гемагглютинин блокируется антителами сыворотки, поэтому агглюти-

нация эритроцитов отсутствует. Визуально в лунках определяется осадок

эритроцитов с ровными краями, в виде «пуговицы».

Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки. Ви-

русный гемагглютинин склеивает эритроциты. Визуально в лунках определяет-

ся осадок эритроцитов с неровными краями в виде «перевернутого зонти-

ка».

РТГА применяют для идентификации вирусов гриппа и других вирусов,

имеющих в суперкапсидной оболочке фермент гемагглютинин.

21

Реакция нейтрализации (РН) в культуре клеток: 2-компонентная,

сложная серологическая реакция.

Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типо-

вые противовирусные диагностические сыворотки (Ат).

Индикатор реакции: культура клеток.

Постановка реакции: вируссодержащую жидкость смешивают в пробирках со специфическими диагностическими сыворотками. Оставляют на 1 час при комнатной температуре. Затем содержимым пробирок заражают культуры кле-

ток во флаконах.

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Про-

исходит нейтрализация вируса антителами сыворотки и культура клеток оста-

ется нормальной, без изменений.

Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки. Ви-

рус оказывает цитопатогенное действие, что приводит к дегенерации культу-

ры клеток.

РН в культуре клеток применяют для идентификации вирусов полиомие-

лита, аденовирусов и др.

РН можно также использовать для идентификации вирусов, культи-

вируемых в организме лабораторных животных. Компоненты и постановка реакции такие же, как в РН в культуре клеток. Индикатор реакции: лаборатор-

ное животное (в частности, белые мыши).

Положительная реакция: тип вируса соответствует типу диагностической сыворотки, происходит его нейтрализация антителами сыворотки и животное

остается здоровым.

Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки, жи-

вотное погибает.

РН в организме животного используется для идентификации вирусов бе-

шенства.

В таблице 2 представлены обобщенные данные о методах культивирова-

ния, индикации и идентификации вирусов.

22

Таблица 2 – Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов

2. Интерфероны, классификация, механизм действия, практическое при-

менение

Интерфероны – гликопротеины, которые вырабатываются многими клет-

ками организма. Однако эта способность наиболее выражена у лейкоцитов,

фибробластов и лимфоцитов. Интерфероны (ИФ) являются цитокинами, подав-

ляющими размножение вирусов, определенных бактерий и некоторых раковых клеток.

По природе клеток, вырабатывающих ИФ, их делят на три группы: α-ИФ (лейкоцитарный): обладает выраженным противовирусным дейст-

вием;

β-ИФ (фибробластный): обладает противовирусным действием, а также регулирует работу лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (иммуномо-

дулирующее действие);

γ-ИФ (иммунный): продуцируется всеми Т-лимфоцитами, стимулирует активность Т- и В-лимфоцитов, фагоцитов, усиливает синтез молекул MHCI и

MHCII и др. Таким образом, γ-ИФ усиливает активность всех звеньев им-

мунной системы.

Механизм противовирусного действия интерферонов.

Интерфероны ингибируют внутриклеточную репликацию широкого спек-

тра ДНК- и РНК-содержащих вирусов.

В инфицированной вирусом клетке синтезируется ИФ, выходит из нее,

связывается с поверхностью здоровой клетки и индуцирует в ней синтез анти-

вирусных белков. Если в эту клетку проникает вирус, то его репродукция по-

давляется этими белками. Один из них является ферментом рибонуклеазой,

23

которая разрушает мРНК вируса. Второй фермент – протеинкиназа – блокиру-

ет синтез вирусных белков. Репродукция вируса становится невозможной.

Практическое использование интерферона: для лечения и профилакти-

ки вирусных инфекций связано с использованием препаратов на основе генно-

инженерного рекомбинантного α2-ИФ. Его получают в культуре бактерий после встраивания в их геном гена человеческого α-ИФ. Рекомбинантный α2-

ИФ эффективен для лечения хронических гепатитов В и С, герпетической и па-

пилломавирусной инфекции.

3. Особенности противовирусного иммунитета.

Интерфероны (гликопротеины) продуцируются клетками при вирусной ин-

фекции. Являются первой, наиболее ранней линией защиты (через несколько часов после начала размножения вируса).

Основными клетками, осуществляющими в организме противовирусный им-

мунологический надзор, являются ЦТЛ и NK-клетки. Они разрушают инфи-

цированные вирусом клетки с помощью перфоринов и гранзимов.

Т-лимфоциты и интерфероны приводят организм к выздоровлению, но не формируют приобретенного иммунитета.

Противовирусные антитела (секреторные IgA и сывороточные IgM и G) за-

щищают только при внеклеточном расположении вирусов. Связываясь с ви-

рионами, они препятствуют их адсорбции на клетки.

Гуморальное звено защиты (антитела) формирует приобретенный

(постинфекционный) иммунитет за счет клонов клеток памяти из В-

лимфоцитов.

Развитие вирусной инфекции всегда угнетает некоторые защитные механиз-

мы (незавершенность фагоцитоза, подавление синтеза молекул MHC I класса зараженными клетками, подавление активации комплемента по классическо-

му и альтернативному пути и т.д.).

24

Практическая работа

1. Вирусологический метод диагностики (продолжение).

а) индикация и идентификация вируса гриппа в аллантоисной жидкости

куриного эмбриона (схема).

II этап исследования: вскрытие куриных эмбрионов, взятие вируссодер-

жащей аллантоисной жидкости.

Скорлупу над воздушной камерой дезинфицируют, стерильными ножни-

цами срезают ее на 2-3 мм выше границы воздушной камеры. Через прокол в хорионаллантоисной оболочке стерильной пастеровской пипеткой набирают вируссодержащую аллантоисную жидкость в количестве 3-4 мл в стерильную пробирку. Индикацию вируса гриппа в аллантоисной жидкости проводят в ре-

акции гемагглютинации (РГА) (таблица 3).

Таблица 3 – Индикация и определение титра вируса гриппа в РГА

Затем проводят идентификацию вируса гриппа в РТГА (таблица 4).

25

Таблица 4 – Идентификация вируса гриппа в РТГА

Контакт 30-40 минут при комнатной температуре

1% куриные 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

эритроциты (мл)

Как видно из таблицы 4, вначале наливают по 0,25 мл физ. раствора во 2, 3, 4, 5 и 6 лунки полистироловой пластины, а в 8-ю лунку – 0,5 мл. Затем готовят двукратные разведения типовых гриппозных диагностических сывороток до разведения 1/320. К этим разведениям добавляют вируссодержащую жидкость в объеме 0,25 мл и смеси оставляют для контакта на 30-40 минут при комнатной температуре. После этого во все лунки вносят по 0,5мл 1% взвеси куриных эритроцитов.

Контроли реакции: контроль сыворотки (0,5мл сыворотки + 0,5мл эритроцитов) и контроль эритроцитов (0,5мл физ. раствора + 0,5мл эритроцитов).

Учет реакции через 1-2 часа (таблица 5).

Таблица 5 – Схема учета РТГА

Заключение о типе вируса сделайте самостоятельно.

б) индикация и индентификация вирусов, культивируемых в культуре клеток Нер-2.

26

III этап исследования: учет цитопатогенного действия (ЦПД) исследуемого вируса на культуру клеток Нер-2.

Под малым увеличением микроскопа отмечают дегенерацию клеток, свидетельствующую о размножении вирусов. Монослой разрушен, оставшиеся клетки округлые, без отростков, с темной зернистой цитоплазмой.

С целью идентификации вирусов производят постановку реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток с аденовирусными диагностическими сыворотками к вирусам 3, 4 и 7 типов, т.к. они наиболее часто вызывают заболевания у людей.

Для постановки РН в три пробирки стерильной пипеткой вносят аденовирусные диагностические сыворотки 3, 4, 7 типов в объеме 0,2 мл. К каждой из этих сывороток добавляют другой стерильной пипеткой по 0,2 мл исследуемой вируссодержащей жидкости. Смеси оставляют для контакта на 1 час, затем каждой смесью в объеме 0,2 мл заражают флаконы с культурой клеток и добавляют по 0,8 мл среды 199.

Контроли реакции: контроль культуры клеток; контроль сывороток (культура клеток + смесь сывороток 3, 4, 7 типов); контроль вируса (культура клеток + вируссодержащая жидкость). Все флаконы (опытные и контрольные) помещают в термостат при температуре 370С на 48-72 часа.

IV этап исследования: учет РН в культуре клеток (таблица 6).

Таблица 6 – Схема учета РН в культуре клеток

Вконтроле культуры клеток и контроле смеси сывороток – монослой из нормальных клеток, т.е. отсутствует дегенерация.

Вконтроле вируса – дегенерация клеток за счет цитопатогенного действия исследуемого вируса.

Вопытных флаконах монослой из нормальных клеток остается в том флаконе, где произошла нейтрализация вируса, т.е. тип сыворотки совпал с типом инфицирующего агента.

Заключение о типе вируса сделайте самостоятельно.

27

Занятие №3

Тема. Бактериофаги. Генетика и изменчивость бактерий. Антибиотики.

Цель занятия. Изучить свойства бактериофагов, их практическое применение,

генетику и изменчивость бактерий, характеристику и спектр действия антибио-

тиков. Освоить методы определения чувствительности бактерий к антибиоти-

кам.

I.Теоретические знания:

1.Морфология и структура бактериофагов, их классификация.

2.Вирулентные и умеренные бактериофаги. Фазы взаимодействия вирулентно-

го бактериофага с клеткой. Практическое применение бактериофагов.

3.Организация генетического материала бактериальной клетки. Факторы вне-

хромосомной наследственности.

4.Виды генетической изменчивости. Использование генной инженерии в меди-

цине.

5.Антибиотики. Классификация антибиотиков по механизму антимикробного действия.

6.Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Осложне-

ния и последствия антибиотикотерапии.

II.Практические навыки:

1.Изучить методику определения фаготипа бактерий.

2.Изучить методику определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений.

3.Определение чувствительности бактерий к антибиотикам диско-

диффузионным методом (по демонстрации).

28

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1. Морфология и структура бактериофагов, их классификация.

Бактериофаги (от греч. bacterion – бактерии, phagos – пожирающий) –

вирусы бактерий, вызывающие их гибель.

Бактериофаги были открыты в 1917 г. канадским ученым Ф. Д'Эррелем. Исследователь выделил из испражнений больных дизентерией фильтрую-

щийся агент, способный разрушать, лизировать дизентерийные бактерии. Последующие наблю-

дения показали, что бактериофаги встречаются повсеместно, где есть бактерии: в почве, сточных Ф. Д'Эррель водах, кишечном тракте человека и животных, гнойном отделяемом и других субстратах. В ши-

роком смысле слова их часто называют просто фагами.

В зависимости от формы и структурной организации фаги подразделяют на пять морфологических групп (рисунок 6):

I. Фаги I типа – нитевидной формы.

II. Фаги II типа – имеют головку и рудимент отростка.

III. Фаги III типа – имеют головку с коротким отростком.

IV. Фаги IV типа – имеют головку и длинный несокращающийся отросток.

V.Фаги V типа – имеют головку и длинный сокращающийся отросток.

Самое сложное строение у фагов V группы.

Рисунок 6 – Морфологическая классификация бактериофагов

29

Структура сложноустроенного фага (рисунок 7):

-головка, в которой содержится нуклеиновая кислота;

-воротничковая часть;

-отросток, сверху покрытый сократительным чехлом. На конце отростка находятся базальная пластинка и нити прикрепления для адсорбции фага на бактериальной клетке.

Оболочечные структуры фага имеют белковую природу.

воротничковая часть

базальная

пластинка

нити

прикрепления

Рисунок 7 – Структура сложноустроенного фага

2.Вирулентные и умеренные бактериофаги. Фазы взаимодействия виру-

лентного бактериофага с клеткой. Практическое применение бактерио-

фагов.

В зависимости от характера взаимодействия с бактериальной клеткой, раз-

личают вирулентные и умеренные бактериофаги.

Вирулентные фаги способны вызывать взрывную продуктивную инфек-

цию. Проникнув в бактериальные клетки, они размножаются и вызывают лизис бактерий. Умеренные фаги чаще вызывают интегративную вирусную инфек-

цию, которая может переходить в продуктивную.

30