Полезные материалы за все 6 курсов / Ответы к занятиям, экзаменам / 3_Микробный_фактор_и_инфекционный_процесс

По направленности действия различают следующие антитела:

-противогрибковые;

3.Серологические реакции. Классификация серологических реакций (табл.2).

Основой серологических (serum (лат.) – сыворотка крови, logos (лат.) – учение) реакций являются особенности взаимодействия антител с антигеном в присутствии физиологического раствора (0,85% NaCl).

Назначение серологических реакций:

проведение серологического метода диагностики – определение в сыворотке крови больного антител к конкретному возбудителю инфекционного заболевания с помощью известного антигена. Результаты такой диагностики выражаются в виде концентрации антител – титра реакции. Титром серологической реакции называется наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдается положительный результат;

идентификация возбудителя по его антигенам с помощью известных антител – иммунных диагностических сывороток.

Все диагностические реакции характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью.

Таблица 2 – Классификация серологических реакций

Примечание: Простые 2- и 3-компонентные реакции – это реакции, для реализации и визуального учета которых достаточно 2 или 3 иммунологических компонентов. Сложные 2- и 3-компонентные реакции – это реакции, для реализации которых достаточно 2 или 3 иммунологических компонентов, а для визуального учѐта необходима индикаторная система.

Реакция агглютинации («agglutinatiо» (лат.) – склеивание): 2-

компонентная простая серологическая реакция (рис. 3). Компоненты реакции агглютинации (РА): корпускулярный антиген (бактериальные клетки) и антитела. В результате реакции образуется агглютинат (комплекс [Аг+Ат]).

21

Антитела «склеивают» бактерии и препятствуют их размножению.

Рисунок 3 – Схема РА с IgM-антителами (а) и IgG-антителами (б)

РА используется:

1.Для идентификации микробов (определение вида возбудителя, выделенного от больного) с помощью известных антител (диагностическая сыворотка). Этот вариант реакции агглютинации выполняется в 2-х технических модификациях: ориентировочная (на предметном стекле); развернутая (в пробирках) – для окончательной идентификации исследуемой культуры (см. практическую работу). Используется для диагностики брюшного тифа, дизентерии, холеры и др. заболеваний.

2.Для определения титра антител в сыворотке крови обследуемого с помощью известных антигенов (диагностикумы). Технически всегда выполняется в виде развернутой РА. Используется для диагностики брюшного тифа, бруцеллеза и др. заболеваний.

Чтобы подтвердить клинический диагноз, титр антител, обнаруженных в сыворотке больного, сравнивают с диагностическим титром для данного заболевания.

Диагностический титр – это минимальное содержание антител в сыворотке крови больного, позволяющее установить диагноз инфекционного заболевания. Например, при брюшном тифе и бруцеллѐзе диагностический титр РА для взрослых – 1/200, для детей – 1/100.

Если титр реакции совпадает с диагностическим титром, значит, пациент болен.

Каждая серологическая реакция, в том числе РА, сопровождается постановкой контролей:

контроль сыворотки: сыворотка + физиологический раствор. Контроль должен быть прозрачным;

22

контроль антигена: взвесь микробов + физиологический раствор. Контроль должен быть равномерно мутным.

Учѐт результатов РА производят визуально.

При положительной реакции на предметном стекле или в пробирках образуется хлопьевидный осадок. При отрицательной реакции жидкость остается равномерно мутной, как в контроле антигена.

Реакция преципитации («praеcipito» (лат.) – осаждать): двухкомпонентная простая реакция. Компоненты реакции преципитации (РП): растворимый антиген (например, бактериальный токсин) и антитела. В результате реакции образуется преципитат (комплекс [Аг+Ат]) в виде помутнения.

Одним из технических вариантов РП является реакция преципитации в геле для определения токсигенности возбудителя дифтерии: на сывороточный МПА в чашке Петри накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную противодифтерийной антитоксической сывороткой. На расстоянии 0,5-1 см от полоски бумаги делают посев бляшками дифтерийных культур, а также заведомо токсигенной контрольной культуры. Антитела сыворотки диффундируют от фильтровальной бумаги в агар и в том месте, где они встречаются с дифтерийным экзотоксином, образуются линии преципитации (рис.4).

Рисунок 4 – Реакция преципитации в геле

Реакция нейтрализации: двухкомпонентная сложная реакция, основана на способности Ат нейтрализовать биологическую активность возбудителя или его экзотоксина. Используется для определения типа ботулинового экзотоксина в исследуемом материале. Компоненты реакции: диагностические противоботулинические антитоксические сыворотки типов A, B, E, F; исследуемый материал от больного, в котором содержится предполагаемый ботулиновый экзотоксин (кровь или промывные воды желудка). В качестве индикаторной системы используют белых мышей.

Постановка реакции: в 5 пробирок помещают исследуемый материал, в четыре из них добавляют соответствующие противоботулинические антитоксические сыворотки А, В, Е, F. 5-я пробирка – «контроль» – содержит исследуемый материал и физиологический раствор. Смеси оставляют для контакта на 30 минут. Затем 5 мышам вводят по 1,0 мл каждой смеси внутрибрюшинно. Учѐт ре-

23

зультатов проводят в течение 4-х суток (ежедневно). При наличии экзотоксина в исследуемом материале контрольная мышь погибает обязательно. Из мышей, взятых в опыт, выживает только одна мышь, которой была введена нейтральная смесь т.к. тип экзотоксина совпал с типом сыворотки и произошла его нейтрализация.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА): двухкомпонентная слож-

ная реакция, используется в 2 модификациях (рис.5): а) по Рыцаю:

Эритроциты в РНГА выполняют роль индикаторной системы, что позволяет визуально обнаружить результат реакции.

Учѐт РНГА: при положительной реакции происходит образование иммунных комплексов [Аг+Ат], которые вызывают склеивание эритроцитов с формированием осадка с неровными краями в виде «перевернутого зонтика». При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговицы».

Реакция иммуногемолиза. В ней участвуют три иммунологических компонента: эритроциты барана (Аг); гемолитическая сыворотка (Ат), полученная путем иммунизации кролика эритроцитами барана; комплемент.

Механизм реакции: при взаимодействии антител гемолитической сыворотки с эритроцитами барана (Аг) образуется иммунный комплекс [Аг+Ат] к которому присоединяется комплемент. В результате происходит лизис эритроцитов (гемолиз).

24

Реакция иммуногемолиза не имеет самостоятельного значения, т.к. все компоненты в ней известны. Они используются в качестве индикаторной системы в реакции связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная трехкомпонентная реакция. Компоненты: исследуемая сыворотка пациента; диагностикум; комплемент. Индикаторная (гемолитическая) система – гемолитическая сыворотка + эритроциты барана.

Постановка реакции (рис.6): в опытную пробирку помещают исследуемую сыворотку пациента (Ат), диагностикум (известный Аг) и комплемент; оставляют пробирку на 1 час в термостате (370С) для контакта. В другой пробирке готовят индикаторную систему (гемолитическая сыворотка + взвесь эритроцитов барана). Через 1 час инкубации в опытную пробирку добавляют индикаторную систему. Учет реакции производят через 16-18 часов.

а)

б)

Рисунок 6 – Схема положительной (а) и отрицательной (б) РСК

Механизм: при положительной реакции в сыворотке больного присутствуют антитела, образуется комплекс Аг+Ати комплемент адсорбируется на этом комплексе. Поэтому, когда в пробирку добавляют индикаторную (гемолитическую) систему, в отсутствии комплемента не происходит реакции иммуногемолиза, и эритроциты выпадают в осадок. При отрицательной реакции (от-

25

сутствие соответствующих антител в сыворотке обследуемого) не образуется комплекс [Аг+Ат], поэтому комплемент остается свободным и связывается с гемолитической системой, что приводит к гемолизу (лизису эритроцитов). РСК используется для диагностики бактериальных (сифилис) и вирусных инфекций.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) прямая (рис.7): двухкомпонент-

ная сложная серологическая реакция. Компоненты: диагностическая антимикробная сыворотка (Ат), меченная флюорохромом (изотиоцианат флюоресцеина); исследуемый антиген (бактерии или клетки организма, пораженные виру-

сами) – Аг. Индикатором реакции является флюорохром (*), который светится в УФ-лучах.

Рисунок 7 – Схема реакции иммунофлюоресценции (прямой метод)

Постановка реакции: на фиксированный мазок материала, в котором находится возбудитель (Аг), наносят люминесцирующую диагностическую сыворотку на 10-15 минут, затем сыворотку сливают, препарат промывают водой и микроскопируют в люминесцентном микроскопе. Если исследуемый антиген соответствует антителам сыворотки, антитела адсорбируются на поверхности антигена, и наблюдается яркое зеленое свечение бактерий или клеток макроорганизма, пораженных вирусом. РИФ используется для экспресс-диагностики холеры, сибирской язвы, вирусных инфекций.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) непрямая (рис.8): трехкомпо-

нентная сложная серологическая реакция. Компоненты: диагностическая антимикробная сыворотка (Ат), полученная путем иммунизации кроликов конкретным антигеном; исследуемый антиген (бактерии или клетки, пораженные вирусом) – Аг; антиглобулиновая (антикроличья) сыворотка (АГС), меченная флюорохромом. Содержит антитела против кроличьих иммуноглобулинов. Индика-

тором реакции является флюорохром (*).

Рисунок 8 – Схема реакции иммунофлюоресценции (непрямой метод)

Постановка реакции: на фиксированный мазок из исследуемого материала наносят диагностическую антимикробную сыворотку на 10-15 минут. Затем сыворотку сливают, препарат промывают водой и наносят антиглобулиновую

26

(антикроличью) сыворотку, меченную флюорохромом, и повторно промывают. При положительной реакции (если в мазке есть возбудитель) образуется комплекс микроб + антимикробные (кроличьи) антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. При микроскопии в люминесцентном микроскопе наблюдается яркое зеленое свечение бактерий или клеток макроорганизма, пораженных вирусом. Реакция используется для экспресс-диагностики бактериальных и вирусных инфекций.

Иммуноферментный анализ (ИФА): сложная трехкомпонентная серологическая реакция, используется как для определения исследуемого антигена, так и для определения антител в сыворотке больного.

Компоненты реакции для определения антител в сыворотке больного: известный антиген (диагностикум), сорбированный на твердом носителе (в лунках пластин из полистирола); сыворотка больного (Ат); антиглобулиновая сыворотка против Ig человека, меченная ферментом. Индикатором реакции для визуального наблюдения является пероксидаза – фермент, который действует на субстрат (Н2О2), соединенный с хромогеном.

Техника постановки реакции: в лунки полистироловой пластины с сорбированным диагностикумом последовательно добавляют сыворотку больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, а затем субстрат (H2O2) с хромогеном. Каждый раз после добавления очередного компонента реакции, лунки пластины промывают для удаления не связавшихся реагентов.

При положительной реакции (наличие антител к данному антигену) образуется комплекс [Аг+Ат], к которому присоединяется антиглобулиновая сыворотка, меченная ферментом. Фермент пероксидаза расщепляет субстрат (перекись водорода), и среда в лунках окрашивается в желто-коричневый цвет за счет хромогена. Интенсивность окраски зависит от количества антигенов и антител, вступивших в реакцию. Реакция используется для диагностики вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции и др.

Практическая работа

1. Схема постановки и учета РА.

Схема постановки и учѐта РА на предметном стекле.

На чистое обезжиренное предметное стекло наносят с помощью пипетки каплю агглютинирующей коли-сыворотки и рядом (другой пипеткой) – каплю физиологического раствора. Затем в каплю физ. раствора (контроль антигена) и в каплю агглютинирующей сыворотки стерильной петлѐй вносят исследуемую культуру E.coli, снятую с поверхности скошенного МПА. Внесѐнную культуру тщательно перемешивают петлѐй, чтобы капля жидкости сделалась равномерно мутной. Чтобы ускорить наступление реакции агглютинации, предметное стекло слегка покачивают. При положительной реакции в капле с сывороткой на-

27

блюдается образование взвешенных хлопьев и просветление жидкости. В контрольной капле – равномерное помутнение (рис.9).

Рисунок 9 – Схема постановки и учет реакции агглютинации на предметном стекле.

Схема постановки и учѐта развѐрнутой РА (на примере реакции Райта с бруцеллѐзным диагностикумом). Для постановки реакции используют следующие ингредиенты: 1) физ. раствор; 2) сыворотка крови обследуемого; 3) бруцеллѐзный диагностикум. Постановка реакции (табл.3): в штативе устанавливают 7 пробирок. Во все пробирки, за исключением первой и предпоследней (контроль сыворотки), наливают градуированной стерильной пипеткой по 1 мл физ. раствора. Затем из пробирки с основным разведением сыворотки 1/50 берут 3 мл и наливают по 1 мл в 1-ю, 2-ю и в предпоследнюю пробирку.

После этого готовят разведения сыворотки. Для этого 1 мл содержимого 2- ой пробирки переносят в 3-ю, из 3-й пробирки такое же количество в 4-ю, из 4- ой в 5-ю. Из 5-ой пробирки (последней опытной) для сохранения одинакового объѐма (1 мл) во всех пробирках 1 мл содержимого вместе с пипеткой помещают в дезинфицирующий раствор.

Таким образом, разведение сыворотки в первой пробирке соответствует основному еѐ разведению (1/50), а в последующих пробирках получается ряд последовательных двукратных разведений 1:100, 1:200, 1:400, 1:800. Затем во все пробирки, за исключением контроля сыворотки (КС), вносят по 2 капли бруцеллѐзного диагностикума. Последняя пробирка является контролем антигена (КА). Штатив с пробирками встряхивают, ставят на 2 часа в термостат при 37оС, а затем на 18-20 часов при комнатной температуре.

Учѐт результатов реакции начинают с контролей. Реакция может учитываться дальше лишь в том случае, если в пробирках с контролями жидкость остаѐтся совершенно однородной: в контроле антигена – слегка мутной, в контроле сыворотки – прозрачной.

28

Таблица 3 – Схема постановки реакции агглютинации (развернутая).

1,0 в дез. раствор 2 часа при 370С , затем 18-20 часов при комнатной температуре.

Учет:

2.Учѐт реакции преципитации в геле для определения токсигенности дифтерийной культуры.

3.Учет РНГА для диагностики брюшного тифа (по демонстрации).

4.Учет РСК (табл.4) с сывороткой крови двух пациентов при подозрении на сифилис (по демонстрации).

Таблица 4 – Схема учета РСК при подозрении на сифилис

29

Занятие № 3

Тема. Иммунная система организма. Специфическая иммунопрофилактика и иммунотерапия.

Цель занятия. Изучить роль иммунной системы организма в создании проти-

воинфекционного иммунитета. Изучить механизм развития аллергической ре-

акции анафилаксии. Изучить основные препараты для специфической профи-

лактики и специфического лечения инфекционных заболеваний.

I.Теоретические знания:

1.Иммунная система организма человека и ее основные функции. Роль АПК, Т-

и В-лимфоцитов.

2. Иммунный ответ по гуморальному и клеточному типу. Иммунологическая память.

3. Аллергия. Классификация аллергических реакций по времени проявления симптомов.

4. Анафилаксия. Анафилактический шок. Методы десенсибилизации организ-

ма.

5. Инфекционная аллергия. Практическое применение кожных аллергических проб для диагностики инфекционных заболеваний.

6. Иммунопрофилактика и иммунотерапия инфекционных заболеваний. Препа-

раты для активной иммунизации. Виды вакцин.

7. Серотерапия и серопрофилактика инфекционных заболеваний. Виды сыворо-

точных препаратов.

II.Практические навыки:

1.Характеристика препаратов для специфической профилактики и специфиче-

ского лечения инфекционных заболеваний.

30