Методы иммобилизации биологического материала

Методы иммобилизации биологического материала

Данная статья посвящена способам закрепления (иммобилизации) распознающего элемента – биологического материала – на трансдьюсере. Основные требования, предъявляемые к методам иммобилизации, состоят в следующием [1]:

1. Закрепленный биологический материал должен сохранять свою активность в течение как можно более продолжительного времени.

2. Перенос молекул аналита к распознающему элементу не должен быть затруднен. Если в распознающем элементе осуществляется каталитическая реакция, отвод ее продуктов также не должен быть затруднен.

3. Метод иммобилизации должен быть применим в достаточно широких диапазонах температур, значений pH и давлений.

4. Метод иммобилизации должен обеспечивать хорошую воспроизводимость при серийном производстве сенсоров.

Основные методы иммобилизации следующие [1-3]:

1. Адсорбция

2. Включение в полимер

3. Сшивка

4. Ковалентное связывание

5. Капсулирование или изоляция с помощью мембран

Обсудим особенности этих методов более подробно.

Адсорбция является наиболее простым методом, она практически не требует подготовки компонент сенсора и использования специальных химических реагентов. При физической адсорбции частицы удерживаются на подложке под действием сил Ван-дер-Ваальса, которые по своей природе делятся на диполь-дипольные, индукционные и дисперсионные взаимодействия, а также под действием водородных и ионных связей. Полученные методом адсорбции элементы обычно характеризуются низкой чувствительностью и существенной зависимостью от температуры и pH. Низкая чувствительность элементов, полученных адсорбцией белков, объясняется тем, что при адсорбции меняется конформация макромолекулы или же блокируются ее активные центры. Кроме того, биологический материал может десорбироваться, уменьшая чувствительность системы и загрязняя раствор. Методом адсорбции пользуются, в основном, на стадии исследований и для производства дешевых одноразовых элементов.

Включение биологического материала в полимерную матрицу является фактически универсальным методом, применимым для разных типов распознающих элементов. Обычно используются такие полимеры, как ПММА, крахмал, нейлон, желатин, коллаген и некоторые другие. Если матрица состоит из синтетического полимера, его получение проводится в присутствии биологического материала, обычно добавляется сшиватель, чтобы отдельные полимерные нити объединились в трехмерную сетку. При этом биологически активные молекулы оказываются захваченными внутрь полимера. Бесспорным достоинством этого метода является его универсальность, однако его недостаток в том, что сетка затрудняет диффузию и мешает проникновению аналита. Кроме того, если включаемые в сетку молекулы не связаны с ней химически, то они могут выходить из нее через поры.

При создании ферментативных электрохимических сенсоров иногда используют метод электрополимеризации. При этом на электроде создается проводящий гель (например, из полипиррола) с включенными в него белками.

Идеологически близким методом является использование углеродной пасты при создании электрохимических сенсоров. Этот метод применим для иммобилизации как отдельных молекул, так и целых клеток. Раствор биологического материала смешивается с углеродной пастой и наносится на поверхность электрода.

В тех случаях, когда молекулы биологического материала связаны между собой или связаны с опорной сеткой, говорят о методе сшивки. Фактически сшитые распознающие молекулы могут использоваться без подложки, если обладают достаточно хорошими механическими характеристиками. Тем не мене, сшивка обычно используется в сочетании с другими методами. Например, она может стабилизировать элементы, полученные адсорбцией. Для сшивки обычно используются бифункциональные агенты, типичным примером сшивателя является глутаровый альдегид.

Метод ковалентного связывания, вероятно, является наиболее распространенным в различных приложениях. Как следует из названия, он предполагает создание ковалентной связи между биоматериалом и подложкой. Выбор химических реагентов для его реализации зависит от типа связываемых молекул и материала подложки. Обычно метод реализуется в три этапа: очистка и модификация поверхности подложки, т.е. формирование на ней слоя из необходимых функциональных групп, затем нанесение биоматериала, и, наконец, смывание слабо закрепленных молекул чистыми растворителями. Очевидно, последовательность химических реакций должна быть выбрана так, чтобы связи, сформированные на ранних этапах, сохранялись на более поздних. Перечислим некоторые подложки, используемые в сенсорах: металлы (обычно золото, серебро или платина), стекло, углерод, полисахариды (например, целлюлоза), нейлон, ПММА и т.д.

Ковалентное связывание белков обычно осуществляется через функциональные группы аминокислот, не влияющих на ферментативную активность. Чтобы защитить активный участок фермента в ходе реакции, ее проводят в присутствии субстрата.

Главные достоинства метода ковалентного связывания состоят в том, что, с одной стороны он обеспечивает надежную связь биоматериала с подложкой и предотвращает его утечку, а с другой позволяет создавать сенсоры с длительным временем жизни [1].

Один из распространенных методов, используемых при создании электрохимических сенсоров, состоит в том, что ферменты размещаются вблизи электрода, отделенные от остального раствора полупроницаемой мембраной, через которую могут проходить молекулы аналита и продукты каталитической реакции. Фактически ферменты находятся в свободном состоянии, однако они локализованы в одной части измерительной ячейки. Этот метод также иногда называется микрокапсулированием. Один из наиболее известных примеров – полимер Nafion, из него изготавливаются отрицательно заряженные мембраны, которые часто используется в сенсорах на глюкозу.

Отдельно следует сказать о методах иммобилизации и детектирования молекул ДНК [4-6]. В ДНК-биосенсорах распознающим элементом обычно являются одноцепочечные ДНК, которые связывают комплементарные цепи. Акт связывания может регистрироваться различными методами: электрохимически, оптически или по изменению массы.

Важный шаг в развитии сенсоров на ДНК связан с созданием биочипов [6,7]. Формально они представляют собой системы различных распознающих элементов, собранные на малой площади; каждый тип распознающих элементов занимает свой участок (сайт). Применительно к ДНК, это означает, что на одной твердой подложке собрано большое количество различных типов одноцепочечных олигонуклеотидов. В процессе анализа каждый из них связывает комплементарный участок молекул из образца. Каждый тип олигонуклеотидов занимает сайт размером ~100 мкм; система считывания обрабатывает сигналы от разных участков и выясняет присутствие различных последовательностей в исследуемом образце. Чтобы проанализировать последовательность нуклеотидов длины n, требуется перебрать 4n зондов, это число всех возможных комбинаций. Преимущество биочипов в том, что они позволяют обрабатывать сигналы от разных типов зондов одновременно.

Для иммобилизации олигонуклеотидов могут применяться различные различные методы, вероятно, наиболее популярным является ковалентное связывание на золотой поверхности [6]. При этом часто используются олигонуклеотиды, на концах которых привиты группы –SH, способные непосредственно связываться с золотом [8]. В некоторых случаях используют более сложные последовательности реакций для подготовки поверхности [9].

Очевидно, при создании биочипов важно не только иммобилизовать биоматериал, но и разместить его на подложке. Наиболее часто это делается тонкими иглами и капиллярами при помощи контактной (pin printing) и бесконтактной (ink-jet printing) микропечати. Малые порции биоматериалов наносятся на определенные точки подложки; при контактном методе острие касается заранее очищенной и модифицированной подложки, при бесконтактном необходимая порция выдавливается на поверхность. Преимущество контактного метода в его простоте и дешевизне, однако, различные бесконтактные методики позволяют с большей надежностью избегать перекрестных загрязнений, т.е. попадания олигонуклеотидов определенного типа на участок, предназначенный для зондов другого типа.

Компания Affymetrix предложила синтез зондов непосредственно на кремниевой подложке с использованием фотолитографии. Подложку освещают светом через маску, в освещенных областях исчезают функциональные группы, закрывающие нуклеотиды. После этого система покрывается нуклеотидами определенного типа, но реакция присоединения идет только в активированных областях. Присоединяемые нуклеотиды несут на себе светозащитные функциональные группы, чтобы повторить цикл с новой маской. Такой метод создания биочипов позволяет достичь разрешения в размещении зондов, сравнимого с длиной световой волны, в этом его несомненное преимущество. Однако его существенный недостаток – отсутствие контроля синтезированных последовательностей.

В обзорах [10,11] обсуждается методы иммобилизации биоматериала с использованием полимерных волокон нанометровой толщины. Метод электроформирования (co-electrospinning) позволяет создавать волокна, которые имеют структуру “ядро-оболочка”, т.е. внутри полимерной нити оказывается захвачен некоторый материал. Это может быть как низкомолекулярное, так и высокомолекулярное соединение, в некоторых приложениях внутреннюю часть удаляют нагревом или селективным растворением, чтобы получить полимерную нанотрубку. Разными научными группами были проведены эксперименты по внедрению биологических агентов внутрь полимерных волокон. Одно из основных требований, возникающих при синтезе таких структур, состоит в том, чтобы используемый биоматериал не деградировал от контакта с растворителем оболочки; в процессе получения волокон такой контакт неизбежен до того, как растворитель испарится. Например [11], был изготовлен сенсор на мочевину, распознающим элементом которого являлся раствор зеленого флуоресцентного белка (GFP), заключенный в поликарбонатную трубку. При помещении такой трубки в раствор мочевины интенсивность флуоресценции быстро снижалась. Хотя полимерные нанотрубки достаточно сложны в получении, они могут сыграть решающую роль в развитии миниатюрных распознающих элементов, предназначенных для внедрения в живые организмы.

Из всех методов иммобилизации наиболее гибким и распространенным, вероятно, является метод ковалентного связывания. В каждом конкретном случае он требует тщательного выбора химических реагентов для модификации поверхности; для многих систем он обеспечивает размещение монослоя биоматериала на подложке. Для крупных распознающих элементов, таких как клетки и ткани, используются методы внедрения в полимерную матрицу или углеродную пасту.

Ссылки:

1. Б. Эггинс, Химические и биологические сенсоры // Москва, Техносфера (2005)

2. É. Lojou, P. Bianko // J. Electroceram., 16, 79-91 (2006)

3. William H. Scouten, John H.T. Loung, R. Stephen Brown // Trends in biotechnology, vol 13, 178-185 (1995)

4. Zhai Junhui, Cui Hong, Yang Ruifu // Biotechnology Advances, 15, 1, 43-58 (1997)

5. T.G. Drummond, M.G. Hill, J.K. Barton // Nature Biotechnology, 21, 10, 1192-1199 (2003)

6. M. Campàs, I. Katakis // Trends Anal Chem, 23, 1, 49-62 (2004)

7. Joerg Albers, Thomas Grunwald, Eric Nebling,,Gundula Piechotta, Rainer Hintsche // Anal Bioanal Chem (2003) 377 : 521–527

8. Adam B. Steel, Tonya M. Herne, Michael J. Tarlov // Anal. Chem. 1998, 70, 4670-4677

9. Jennifer M. Brockman, Anthony G. Frutos, Robert M. Corn // J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 8044-8051

10. A. Greiner . J. H. Wendorff . A. L. Yarin . E. Zussman // Appl Microbiol Biotechnol 71 387–393 (2006)

11. A. L. Yarin, E. Zussman, J. H. Wendorff A. Greiner // Journal of Materials Chemistry 17, 2585–2599 (2007)

12. www.affymetrix.com

Автор: Багров Д.В.

2007