adyrbaikyzy_bioinjeneriya_umk_kz

Алғашқы плазмидалар бактериялардан шығарылған, соңында оларды гендік инженерия əдістерімен құрастыра бастады.

Клондау үшін жиі қолданылатын плазмидті векторларғаE.coli (pBR322, pBR325, pACYC117, pACYC 184) жəне де плазмида негізінде құрастырылған CoIEI жатады, ол арнайы құрал жабдықтарды қажет етпейді. Хлорамфениколы бар, хромосоманың бөлінуіне байланысты емес, қазіргі плазмидті векторлар репликациялануға қабілеті бар. Бұл кезде плазмидалар копиясының саны бір клеткада 1–2.103 дейін өсуі мүмкін.

Өсімдіктер мен жоғары жануарлардың гендер кітапханасын алғанда жиі шешімді рөльді векторлар атқарады. Бұл кезде вектор ретінде λ фагын қолданады. Арнайы əдістер көмегімен тікелей фагка рДНҚ енгізеді. Өте көп сыйымдылығы плазмида-космидтерде болады, оларда λ фаг геномыныңcosфрагменті ДНҚ-ның орамасына қатысады.

Реципиент-ағза жасушасына гендерді тасымалдау. Рекомбинантты

əдістеме арнайы вирусты векторлардың қатысуымен жануарлар мен өсімдіктер жасушасына қолданылады.

Негізгі əдебиеттер : 4[8-89], 5[204-246,306-369], 9[149-219]

Қосымша əдебиеттер : 2[157-159] Бақылау сұрақтары:

1.ДНҚ-дан генді шығару əдісі қалай жүреді?

2.Химиялы-ферментті синтез.

3.«Гендер банкі» деген не?

4.Рекомбинантты технологияларға не жатады?

5.Рекомбинантты ДНҚ-ны құрастыру əдісі.

6.Реципиент-ағза жасушасына гендерді тасымалдау қалай жүреді?

51

10-дəрістің тақырыбы: Генді алу жолдары. (2-бөлім).

қажетті ақуызды кодтайтын ДНҚ тізбегінің көшірмесін синтездеу керек. Ең оңай тəсіл – қажетті геннен матрицалық РНҚ (мРНҚ) алу. Біз білетіндей, матрицалық РНҚ – бұл берілген ақуыздың ақпараты жазылған ДНҚ генетикалық кодты танитын молекула. Матрицалық РНҚ кодты жазып алады да оны ядродан тыс, ақуыздар синтезделетін, рибосомаларға жеткізеді. Осындай хат тасушыны «ұрлап», қажетті кодты алуға болады.

Бұдан да басқа, мРНҚ ядродан шыққанда, эукариот жасушасында бұл кезде ол енді айқынды түрде кесіледі де артық генетикалық материалдардан– кодталмайтын бөліктерден немесе интрондардан құтылады. РНҚның айқын учаскелерін кесу процесі сплайсинг деп аталады. Егер сіз, ДНҚ өзінен емес,

мРНҚ бастасаңыз, онда ДНҚ транскрипциясымен жəне сплайсингтің түрлі нұсқаларымен байланысқан қиындықтан құтыласыз.

Айтарлықтай, осы ақуыз үшін көптеген мРНҚ көшірмесін алатын ДНҚ кодының учаскесі матрицаға ұқсас, ол қайта, қайта пайдалануы мүмкін. Айқын ақуызды белсенді синтездейтін жасушада өте көп осы ақуыздың цитоплазмадағы мРНҚ көшірмесі болады. Сонымен, мРНҚ пайда болуы қалай болмасада генді күшейтеді. Бұл бактерия жасушасынан адам ақуызын алу процесіндегі алғашқы қадам.

Дұрыс мРНҚ алу үшін жасуша қажет, ол шамамен ағзада берілген ақуыздың көзі. Мысалы, бізге инсулин қажет. Ағзада инсулиннің көзі болып ұйқы безінің аралдық жасушалары саналады. Бұл жасушалар инсулинді өндіру фабрикасы. Инсулинді кодтайтын мРНҚ молекулалары онда көп мөлшерде өндірілуі қажет. Сонымен, цитоплазмадағы мРНҚ көп бөлігі инсулин үшін осындай жасушаның мРНҚ болады. Егер аралдық жасушалардан мРНҚ алып тастаса, онда инсулинді кодтайтын мРНҚ жоғары пайызын сеніммен алуға болады. Аралдық жасушасының массасынан мРНҚ қалай алуға болады? Біз мРНҚ алып тастай аламыз, өйткені олардың құрылысында белгілі бір сипаты

Осы poly(А)-«құйрықты» табатын химиялық əдістер бар. Олар мРНҚ химиялық əдіспен шығару негізінде жатыр.

мРНҚ бұл генетикалық код емес, ол инвертацияланған көшірме, өйткені онда ДНҚ молекуласындағы негіздерге комплементарлы азот негіздері болады екенін еске алайық. Мəселен, біздер білетіндей, ДНҚ-да аденин болса, мРНҚ-да урацил болады. Бақытына қарай, табиғатта ақпаратты мРНҚ-дан қайта ДНҚ-ға аударатын ферменттер болады. Олар кері транскриптазалар деп аталады. ДНҚның комплементарлы тізбегінің синтезі үшін мРНҚ матрица сияқты кері транскриптаза пайдаланады. мРНҚ түсіп қалған соң, кері транскриптазамен құрастырылған біртізбекті ДНҚ азот негіздерінің комплементарлық принципі бойынша өзіне екінші тізбегін құрастырады. Бұл ДНҚ-полимераза көмегімен өтеді. Нəтижесінде жаңа екітізбекті, белгілі комплементарлы ДНҚ сияқты

52

немесе кДНҚ пайда болады (1-сурет).

Бактерия ДНҚ-на адам генін құрастыру. Біз бактерияға инсулин генін

·жасушаға ДНҚ-ны енгізу күрделі. Жасушаға ДНҚ-ны тасымалдау үшін вектор қажет;

·адам ДНҚ-сы жасушаға енген соң бактерия оны бөтенсірейді. Өйткені бактерия ДНҚ-сы сақина тəрізді, ал адамдікі – ұзын сызықша болып келеді. Бактерия бөтен ДНҚ-ны жойып жібереді. Сондықтан адамның ДНҚ-сы сақина түрінде енгізілуі қажет.

мРНК

Пентоза (рибоза)

1-сурет. Комплементарлы ДНҚ-ны жасау.

Көптеген бактерияларға бір сақиналы хромосома т.əнБақытынай қарай, оларда плазмида деп аталатын, азғантай қосымша ДНҚ-ның кесіндісі болады. 2- суретте көрсетілгендей, плазмидалар – бұл кішкене сақиналы құрылым, олар бактерияның басымды хромосомасынан тəуелсіз тіршілік етеді. Əдетте оларда 5% ғана ақпарат болады жəне жасушаның өмір сүруіне , олардақажет тіршілікке маңызды ақпарат болмайды. Ортаның экстремалды жағдайында өмір сүруіне жауапты плазмидаларда бірнеше гендер болады. Бұның бəрі біздің мақсатымызға өте жақсы келеді. Өйткені плазмидалар вектор болуы мүмкін.

Плазмидаларды рестриктаза ферменттері көмегімен кесуге болады да сызықты ДНҚ-ны алуға болады. Бактерия жасушасында болатын, кері транскриптазаның ашылуымен бірге рестриктазаның ашылуы да гендік инженерияның дамуына маңызды болды. 1968 жылы Г.О.Смит, К.Уилкокс жəне Дж.Келли бактериядан алғашқы рестриктазаны алған жəне сипаттаған.

Рестрикция тоқтату деген мағнаны білдіреді. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылына биохимиялық əрекет жасап, оның жасушада

53

Бактерияға вирус ДНҚ-сы енгенде, ол рестриктазамен жойылады. Жұп азот негізіндегі бірегей метил тобы бактерия ДНҚ-сын рестриктазадан қорғайды. Осы метил топтары рестриктазамен өзара əсерлесуінен қорғайды. Қазіргі кезде олардың 900 астамы бар. Əрбір ферментте өзінің арнайы белсенді орталығы болады. Əртүрлі рестриктазалармен танымалы 200-дей ДНҚ бірігей жүйелілігі белгілі. Он жұп негіздерінен тұратын ДНҚ жүйелілігіне рестриктазалар ерекше болып келеді. Мəселен, 3-суретте көрсетілгендей, рекстриктазалар ДНҚ-ны Г - Ц, Т - А жұп негіздер арасында кеседі.

Бактерия хромосомасы (1000-5000 гендер)

Плазмидалар

(50-250 гендер)

Бактерия жасушасы

2-сурет. Плазмидалар.

Біз плазмиданы өз қалағанымыздай кесе аламыз. Ол үшін таңдап алған жүйелілік негіздері бойынша плазмида ДНҚсын кесеміз. Бұдан басқа, сіздер білетіндей, егер ДНҚны рекстриктазалар көмегімен кесіп алсаңыз, онда шет-

болмайды, бірақ оларда ДНҚ-ның біртізбекті қысқа фрагменттері болады. Осы фрагменттер, негіздерінде комплементарлық жүйелілігі бар, жаңа ДНҚ-ға оңай қосылады. 10.3-суретте «жабысқақ ұштары» бір жағында Г - А – Т - Т жəне басқа жағында Ц - Т – А – А фрагменттерінен тұрады. Осы ұштары Ц - Т – А – А жəне Г - А – Т – Т сəйкес фрагменттеріне «жабысады». «Жабысқақ ұштар» арасына негіздер жұбын қосымша қосуға болады. Бактерия плазмидасын тесіп,

қосыла алатын, керек геннің «жабысқақ ұштары» сəйкес келмесе ше?

54

Бактерия плазмидасы

а). ДНҚ-ны кесіп, рестриктаза тістелген шет қалдырады ,

б). Түзілген біртізбекті жіпшелер комплементарлық негіздермен қосылу үшін ыңғайлы, яғни олар «жабысқақ»

3-сурет. Рестриктазалар

Биотехнология индустриясы сіздің мақсатыңызды болжап қойып, ДНҚның азғана кесіндісінің жиынтығын , құрды«жабысқақ ұштарымен» комплементарлық байланысуға келетін, оларда əртүрлі жүйеліліктер болады. ДНҚ-лигаза ферментін қолданып, оларды генге қосуға болады.

Енді плазмидаға генді енгізіп, қолдан жасалған рекомбинантты ДНҚ-ны құрастыруға болады (4-суретте көрсетілгендей). Еске алсақ, біз аралдық жасушаның мРНҚ-нан бастағанбыз, өйткені олар инсулиннің көп мөлшерін түзейді, ал біз инсулин генін алуға тырыстық. Алдында алынған мРНҚ негізінде құрастырылған гендердің көп пайызы, инсулинді кодтайтын, нағыз гендер. Плазмидалардың кейбіреуне инсулин гені құрастырылады.

Рекомбинантты ДНҚ — плазмидаға

құрастырылған бөгде ДНК

(10.3 сур.көрсетілген)

4-сурет. ДНҚ-ны бактерия плазмидасына құрастыру немесе рекомбинантты ДНҚ-ны жасау.

Соған қарамастан, аралдық жасушалар басқа да ақуыз қатарын синтездейді

55

қызықтыратын ген болады. Кальций хлоридінің ерітіндісі көмегімен өңделген бактериялар белгілі стимуляциядан өтеді, бұл плазмидалардың ішіне өтуіне мүмкіндік береді. Мұндай процесс трансформация деп аталады.

Негізг əдебиеттері: 1 [415-435], 3 [280-568], 4 [122-129, 207-209], 5 [29-176, 373-515], 6 [15-200], 7 [5-100], 8 [30-250], 9 [19-24, 39-74].

Қосымша əдебиеттер: 2 [145-173]. Бақылау сұрақтары:

1.Генді алу жолдарына сипаттама беріңіз.

2.Генді шығарудың жолын таңдау неге негізделген?

3.ДНҚ-дан генді қандай қосындылар көмегімен шығарады?

4.Бактерия ДНҚ-на адам генін қалай құрастыруға болады?

5.Кері транскриптазалар, плазмида, рестриктаза терминдеріне түсініктеме беріңіз.

6.Генетикалық материалмен алмасу тəсілдері.

11-дəрістің тақырыбы: Генді алу жолдары. (3-бөлім).

Трансформацияланған бактерияларды сұрыптау. Енді бактериялардың

Оларды плазмидада болатын, генсіз өмір сүре алмайтын ортада өсіруге болады. Еске алсақ, плазмидаларда жиі ортаның экстремалды жағдайында өмір сүруге

сезімтал бактерияларды таңдай аласыздар, жəне ампициллинге тұрақтылығын қамтамасыз ететін, бактерия гені бар, плазмидаларды енгізе аласыз. Егер

56

алуға болады. Өйткені сіздер нуклеотидтер жүйелілігін білесіз жəне белгілі орында плазмиданы кесе алатын рестриктазаны таңдадыңыз. Сіздер геном жүйелілігін тоқтату үшін тəсілді таңдай аласыз. Жиі қолданылатын жүйе– бета-галактозидаза. Бұл фермент Х-gal (5-бром-4-хлороиндолилгалактозид) деп аталатын затпен өзара байланысады, нəтижесінде көк түс пайда болады. Бетагалактозидаза генін репортерлы деп атайды, өйткені ол плазмидалы ДНҚ-ның жағдайын «хабарлайды». Бактериялар Х-gal бар агарда өсіріледі. Бетагалактозидаза гені бар колониялар агарды көк түске бояйды (1-сурет).

Жаңа генетикалық материалы бар плазмидалар енгізілген соң, бактерия популяциясы үлгіге дейін тарытылады. Алғашқы мақсатымыз адам инсулинін түзейтін бактериялар популяциясын алу.

Плазмидалар енгізілген бактериялар

пластинкадағы олардың ориентациясын бұзбай, лизиске ұшыратып, стандартты əдістерді қолдануға болады. Осы лизиске ұшыраған жасушаларды моноклонды антиденелермен инкубирлеп, қандай колониялар инсулинді шығаратынын анықтауға болады.

Рекомбинантты жасушалардың скринингі

Құрастырылған ДНҚ тасымалдаудан кейін реципиентті

57

жасушаларды идентифицирлейді жəне таңдап алады. Сұрыптауды генетикалық маркермен жүргізеді, олар вектормен таңбаланған. Маркерлер болып антибиотиктерге тұрақты гендер саналады. Сондықтан нақты антибиотигі бар ортаға жасушаларды егу арқылы сұрыптауды жүргізеді. Еккеннен кейін осы ортада тек вектор құрамында антибиотикке тұрақты гендері бар жасушалар

қосындылардың жаңа продуценттерін беруден басқа, дəстүрлі пайдаланатын ағзалардың бағалы қасиеттерінің тиімділігін жақсартады. Пайдалы өнімнің шығуын жоғарлататын кеңінен таралған əдіс болыпамплификация – гендердің көшірмелер санының көбеюісаналады. Көптеген мақсатты түрдегі өнімдердің (аминқышқылдардың, дəру-дəрмектердің, антибиотиктердің жəне басқалардың)

58

пайда болуы синтездің ұзын биохимиялық жолымен сипатталады. Ол бір емес

береді, яғни бактериялық колония түзіледі. Енді гендер жинағынан, яғни əр түрлі клондар (бір жасушадан немесе молекуладан пайда болған бірнеше жасушалар немесе молекулалар: бастапқы жалғыз жасушадан, молекуладан

59

ағзаны алуға болады. Бұндай ағзаны трансгендік немесе трансформацияланған (бір ағзаның өзгеріп, басқа қасиетке ие болуы) ағза деп атайды.

Гендік инженерияның жетістіктері:

·рестриктазалар мен лигазалардың ашылуы;

·генді химиялық жəне ферменттерді қолдану арқылы синтездеу əдістері;

·бөтен генді тасымалдаушы векторларды пайдалану;

·бөтен генге ие болған жасушаларды таңдап, бөліп алу жолдарының ашылуы;

Гендік инженерияның қиыншылықтары:

·өсімдіктер геномының едəуір күрделілігі; оның құрамына 150 мыңнан аса

санбин (геномында бұршақтың ақуызы фазеолинді кодтайтын гендері бар

Қорыта келгенде, гендік инженерияның кезеңдері мыналардан тұрады:

·басқа ағзаға көшірілетін құрылымдық генді алу;

·оны вектордың құрамына енгізу, яғни рДНҚ-ны жасау;

60