Методы исследования мембран

Методы исследования мембран

1. Биохимические методы исследования биомембран позволяют выделять в максимально чистом виде отдельные компоненты различных мембран, изучать их физико-химические свойства, способность образовывать надмолекулярные лабильные комплексы, определять время “жизни” отдельных компонентов, путей биосинтеза и распада, влияние на метаболизм различных физико-химических факторов как внутренней, так и внешней среды: ионов, температуры и т.д. 2. Физиологические методы предусматривают исследование различных функций как на естественных, так-и на искусственных мембранах или в модельных опытах на пластинчатых тканях (коже, передней брюшной стенке лягушки, стенке мочевого пузыря мелких животных, стенке кишечника животных, пластинке зеленого листа и др.). Физиологическими методами изучают проницаемость мембран для атомов, ионов, различных молекул; процессы, протекающие в биомембранах при возбуждении, торможении, проведении нервного импульса; поступление, распределение и выведение ионов и молекул из клеток и тканей, влияние физико-химических факторов на состояние мембран и изменение физиологических функций клеток. 3. Генетические методы, основанные на использовании мутантов, дефектных по синтезу определенных мембранных белков, позволяют решать вопросы о роли данных молекул белка в надмолекулярной организации, изменении функций мембран, их самоорганизации. 4. Иммунологические методы предусматривают выделение определенных мембран, использование их как антигенов с целью последующего применения выработанных антигенов для идентификации специфических участков мембран, распределения антигенов на изучаемых участках мембраны, выделения комплексов антиген-антитело с последующим разделением на антиген и антитело. Рассмотрим биофизические методы исследования биологических мембран бактерий, клеток растений, животных, выполняющих различные функции. Биофизические методы исследования биологических мембран К биофизическим подходам для выяснения структуры и функций биологических мембран относят ряд высокоинформативных, хорошо зарекомендовавших себя методов, позволяющих получать достоверные сведения о состоянии молекул, молекулярных комплексов, целой мембраны и изменении их физико-химических параметров в зависимости от функционального состояния мембран. Эти методы используют также для решения биохимических, физиологических, цитологических вопросов. К биофизическим методам относят: - метод электронной микроскопии; - метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и использования спиновых меток; - метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР); - метод флуоресцентной спектроскопии (и использования флуоресцентных зондов); - метод определения дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма; - метод дифференциальной сканирующей калориметрии; - метод рентгеновского рассеяния нейтронов; - метод моделирования; - метод искусственных мембран; - метод радиоактивных изотопов;

Дифракционные методы основаны на взаимодействии электромагнитного излучения различной длина волны или частиц с длиной волны, соизмеримой с межатомным расстоянием и компонентов мембраны. К этим методам относятся рентгеновская дифракция(рентгеноструктурный анализ) и дифракция нейтронов. Их используют для определения геометрических параметров структуры: типа липидной мезофазы и её периодичности, толщины бислоя,среднего расстояния между углеводородными цепями. Однако из-за высокой лабильности и сравнительно малой упорядоченности структуры биомембран этот метод нее позволяет изучить локализацию мембранных белков.

Резонансные методы подразделяют на метод ядерного магнитного резонанса(ЯМР) и электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).

Метод ЯМР основан на явлении резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волной системой атомных ядер, обладающих магнитным моментом, помещенных во внешнее магнитное поле. Магнитным моментом обладают ,например, такие ядра. Как ¹₁H, ¹³C, ³¹Р.

Не обладают магнитным моментом такие ядра, как ⁴He, ¹⁶О,¹²С.В биологических объектах содержится ядер ¹₁H-протонов, что дает возможность применять их для исследования ЯМР.

Метод ЯМР позволяет получить сведения о подвижности молекул, липидов биомембран, об упаковку фосфолипидных молекул в бислое. К недостаткам следует отнести низкую чувствительность (концентрация образца должна быть не менее 10 ^-3 моль/л), а также малую эффективность в изучении крупных молекул, т.е. мембранных белков.

Метод ЭПР основан на введении в липидный бислой парамагнитных меток и зондов. Основу спиновых меток и зондов составляет стабильный свободный иминоксильный (нитроксильный) радикал с неспаренным электроном, локализованный преимущественно у атома азота. Если производное такого радикала присоединяется к белку или липиду ковалентной связью, то такое производное называют спиновой меткой, а если с помощью электростатических сил и гидрофобных взаимодействий-то спиновым зондом. Недостаток метода заключается в том,что введение зонда меняет структуру бислоя и свойства мембраны.

С помощью методов ЯМР и ЭПР удалось изучить такие явления как латеральная диффузия и «флип флоп».

Латеральная диффузия- это хаотическое тепловое перемещение молекул липидов и белков в плоскости мембраны. При латеральной диффузии рядом расположенные молекулы липидов скачком меняются местами и вследствии таких последовательных перескоков из одного места в другое молекула перемещается вдоль поверхности мембраны.

Перемещение молекул по поверхности мембраны клетки за время t определено также методом флюоресцентных меток-флюоресцирующих молекулярных групп. Флюоресцентные метки делают флюоресцирующими молекулами , движение которых по поверхности клетки можно изучать, например, исследуя под микроскопом скорость расплывания по поверхности клетки флюоресцирующего пятна, созданного такими молекулами.

Флип-флоп- это диффузия молекул мембранных фосфолипидов поперек мембраны.

Скорость перескоков молекул с одной поверхности мембраны на другую (флип-флоп) определена методом спиновых меток в опытах на модельных липидных мембранах – липосомах. Часть фосфолипидных молекул, из которых формировались липосомы, метились присоединенными к ним спиновыми метками – молекулярными группами с неспаренными электронами. Липосомы подвергались воздействию аскорбиновой кислоты, вследствие чего неспаренные электроны на молекулах пропадали: парамагнитные молекулы становились диамагнитными, что можно было обнаружить по уменьшению площади под кривой спектра ЭПР. Сначала нейтрализовались неспаренные электроны молекул, расположенных на внешних поверхностях липосом, что приводило к уменьшению числа неспаренных электронов в 2 раза. Электронный парамагнитный резонанс затем определялся спин-метками на внутренних, недоступных действию аскорбиновой кислоты поверхностях фосфолипидных пузырьков – липосом. Однако площадь под спектрами ЭПР продолжала понижаться, следовательно, число неспаренных электронов уменьшалось. Это объяснялось перескоками меченых спин-метками молекул с внутренней поверхности бислойной мембраны липосомы на внешнюю – флип-флопом. По скорости уменьшения интенсивности сигнала ЭПР было установлено, что половина меченых молекул претерпевает флип-флоп примерно за 6.5 часов, поскольку примерно через 6.5 часов площадь под кривой спектра ЭПР (число неспаренных электронов) уменьшалась в два раза.

Таким образом, перескоки молекул с одной поверхности бислоя на другую (флип-флоп) совершаются значительно медленнее, чем перескоки при латеральной диффузии. Среднее время, через которое фосфолипидная молекула совершает флип-флоп ( 1 час) в десятки миллиардов раз больше среднего времени, характеризующего перескоки молекулы из одного места в другое в плоскости мембраны Сочетание быстрой диффузии молекул вдоль мембраны и очень медленной диффузии поперек мембраны имеет большое значение для функционирования мембран, а именно, для матричной функции мембраны. Благодаря затруднённому переходу поперек мембраны поддерживается упорядоченность в молекулярной структуре мембраны, ее анизотропия, асимметрия (относительно плоскости мембраны) расположения липидных и белковых молекул, определенная ориентация белков-ферментов поперек мембраны.