біотехнологія

3. Лабораторні методи діагностики вагітності

Визначення тільності по молоку. В стакан з водою капають краплю до-

сліджуваного молока з висоти 5-6 см. крапля молока від тільної корови час-

тково занурюється в воду, поступово розчиняється, не залишаючи сліду.

Крапля молока від нетільної корови на поверхні води швидко розчиняється і утворює "хмарку". Достовірність методу 50-55%.

У пробірку наливають 5 мл свіжо надоєного молока, потім влива-

ють 5 мл чистого спирту і збовтують. Молоко тільної корови відразу або че-

рез 3-5 хв. зсідається. Молоко від нетільної корови зсідається через 20-40

хвилин. Достовірність методу 70-75%.

Зміна питомої ваги церві кального секрету. Корнцангом через введе-

не піхвове дзеркало біля отвору шийки корів беруть згусток секрету (з куку-

рудзяне зерно). Секрет опускають в пробірку з розчином сульфату міді (пи-

тома маса 1,008). Згусток слизу взятий у тільних корів тоне, в иетільних сп-

ливає. Достовірність методу 80%.

Метод піхвових мазків. Краплю слизу від досліджуваної тварини опу-

скають в пробірку і наливають 2-3 мл 10% розчину їдкого натрію, кип'я-

тять 1-2 хв., слиз розчиняється. Розчин від тільної корови має корич-

невий, або оранжевий колір, від нетільної блідо-жовтий. Достовірність ме-

тоду 60-70 відсотків.

Термін вагітності підраховується у днях. На тривалість вагітності впли-

21

вають умови годівлі, порода, вік. У скороспілих порід роди настають ра-

ніше, ніж у пізньоспілих. Молоді самки схильні переношувати плід.

Таблиця 3 Тривалість вагітності у сільськогосподарських тварин

При розвитку в одно плідних тварин кількох плодів строк вагітнос-

ті скорочується. Розвиток чоловічих особин продовжує його.

Рис.1. Топографія вагітної матки при тільності 1 місяць

1 2

Рис. 2. Матка корови на дев'ятому місяці тільності: 1 - піхва; 2 – тіло матки; 3 - ріг матки (плодовмістилище)

22

4. Облік і звітність

Технік веде облік осіменіння корів і телиць у журналі відповідної форми.

Він записує дати останнього отелення і осіменіння за минулий рік, реєструє дати осіменіння, результати досліджень на тільність, дати отелення самок,

дані про приплід та ін.

Технік реєструє маток після осіменіння на зворотному боці ордера на ві-

дправлення сперми плідника і звітує ним про використання одержаної спер-

ми.

Журнал і ордери зберігаються в господарстві не менше трьох років.

Питання для самоконтролю:

1.Перерахуйте клінічні методи діагностики;

2.Яка методика проведення та підготовки рук і тварин до ректаль-

ного дослідження

3.Які ви знаєте лабораторні методи діагностики вагітності Література: 5; 8.

Тема №4. Трансплантація ембріонів реципієнтам

Завдання: Вивчити науково-теоретичний аспект, прикладне значення та порядок проведення трансплантації ембріонів реципієнтам.

Питання: 1. фізіологічні основи трансплантації ембріонів

2.прикладне значення трансплантації ембріонів;

3.використання трансплантації ембріонів;

4.фактори, що впливають на результат трансплантації;

5.порядок проведення пересаджування ембріонів.

Трансплантація ембріонів - єдиний і незамінний шлях виходу до-

сягнень ембріоінженерії в практику тваринництва Під трансплантацією ембріонів розуміють перенесення запліднених емб-

ріонів з статевого апарату високо цінних тварин–донорів у статевий апарат низько продуктивних тварин-реципієнтів, з подальшим розвитком у останніх вагітності і народженням телят, що несуть генетичний потенціал батьків – донорів

23

Однією з основних задач біотехнології в тваринництві є збільшення швидкості відтворення потрібних генотипів, в першу чергу шляхом отримання плідників від високоцінних в селекційному відношенні бать-

ків.

Так, в скотарстві від однієї корови можна отримати бугая тільки на протязі 2 років. Використовуючи біотехнологічний метод - трансплантація ембріонів: 2-5 голів і більше на рік, а застосувавши мікрохірургічний поділ ембріонів - в півтора рази більше.

Трансплантація ембріонів з успіхом проводиться у більшості лаборатор-

них тварин, приматів, сільськогосподарських тварин. Найбільш широко цей біотехнічний метод використовується в скотарстві і козівництві.

Історія трансплантації ембріонів, як інструментального методу біоло-

гічних досліджень починається з квітня місяця 1890 року. В Кембриджсь-

кому університеті В.Хіпп від крільчихи отримав перших кріль-чат транс-

плантатів. На початку 50 років 20 століття А.В. Квасницький в ВНДІ сви-

нарства отримав перших в світі поросят-трансплантатів. Перше теля після хірургічної трансплантації було отримано в США в 1951 році, а в 1964 не хірургічним.

1. Фізіологічні основи трансплантації ембріонів

На відміну від трансплантації органів і тканин ссавців, що супроводжу-

ється тканинною несумісністю, при пересадці ембріонів від донорів до ре-

ципієнтів таких явищ не виникає. Це пов'язано з тим, що порожнини яй-

цепроводів матки донорів і реципієнтів імунологічно толерантні, і до поча-

тку імплантації (нідації) ембріонів, тобто до безпосереднього контакту хоріона ембріона і слизової оболонки, проходить деякий час (7—16 днів у різних видів тварин).

Реципієнт не впливає на генотип плода. Однак, ”прийомна мати” впливає на процеси розвитку і росту плода, на його масу при народженні, а також на стійкість новонароджених до захворювань.

Цей метод дозволить отримувати більшу кількість однорідного потомства

24

від високопродуктивних тварин і цінних генотипів, швидко і широко розпо-

всюджувати рідкісні і зникаючі породи, прискорено утворювати високопро-

дуктивні селекційні стада, інтенсифікувати розмноження молочного пого-

лів’я шляхом пересадки зародків відомої статі, збільшувати вихід телят шля-

хом пересадки двох ембріонів з метою отримання близнюків, створювати банк ембріонів і накопичувати генетичний матеріал з метою наступного транспортування і трансплантації в запланованих стадах, тощо. Купівля емб-

ріонів чистопорідних тварин дає можливість отримати відносно дешево гене-

тику високого класу, яку неможливо отримати у вигляді живої худоби.

На результат трансплантації ембріонів впливає багато факторів, які так тісно взаємопов'язані між собою, що їх неможливо розділити по значенню.

1.Достовірний вплив має використання технічних прийомів прове-

дення трансплантації (хірургічний, не хірургічний). ч.

2.Вік ембріона.

3.Його розміри.

4.Рівень синхронності статевих циклів.

5.Пора року.

6.Кваліфікація оператора.

7.Місце введення ембріона.

8.Умови та тривалість культивування ембріонів в проміжку між вими-

ванням і пересадкою.

9.Індивідуальність донора.

Воснові технологічних вирішень трансплантації лежать загаль-

нобіологічні відомості щодо нервово-гормональної регуляції статевої фун-

кції, запліднення, внутріутробного розвитку зиготи і ембріонів.

Незважаючи на спосіб трансплантації ембріонів технологія включає:

1.відбір донорів і реципієнті;

2.стимуляція суперовуляції;

3.штучне осіменіння донора;

25

5.оцінка, культивування і зберігання зародків;

6.синхронізація статевих циклів донора та реципієнта;

7.пересадка зародків реципієнту або їх заморожування.

♂

5 суперовуляцій за рік, 30 ембріонів

2,5 роки

4,5 роки

♀45 статевозрілих биків і телиць за 6 років

5,5 років

♂♂ ♀♀

4 статевозрілих бики і телиці за 6 років

Рис. 1. Можливості методу трансплантації ембріонів для прискореного відтворення племінного поголів’я тварин.

В найпростішому виконанні метод трансплантації ембріонів значно пере-

важає поширений нині метод штучного осіменіння тварин і дозволяє в 3-4 і

більше разів прискорити генетичний прогрес в стаді.

Тема №5. Відбір донорів та реципієнтів, стимуляція супе-

ровуляції у донорів

, а також — потенціал фолікулів на різних стадіях зрілості, що в десят-

ки разів перевищує число овуляцій під час спонтанної стадії збудження статевого циклу.

Спрямований вплив на фізіологічну періодичність функції яєчників з до-

помогою гонадотропних гормонів (ФСГ) дозволяє стимулювати фолікуло-

генез — визрівання овоцитів до яйцеклітин і їх овуляцію (суперовуля-

цію).

26

За 3—4 доби ембріони проходять яйцепроводи і виходять в порожнину рогів матки. В цей час і одержують ембріони, оцінюють їх якість і пере-

саджують реципієнтам або ж закладають на зберігання. Реципієнт і донор повинні бути синхронізовані за днями статевого циклу з максимальним відхиленням ± 1 день. Краще якщо початок охоти у донора і реципієнта абсолютно збігається.

Однією із умов ефективного використання методу є організація і добре обладнання центрів і пунктів трансплантації ембріонів.

Центр трансплантації ембріонів відноситься до об'єктів закритого типу.

Територія центру повинна мати чітко відокремлені три зони: «А», «Б», «В». В зоні «А» розміщується лабораторно-технічний бокс з складом емб-

ріонів.

Взоні «Б» знаходяться приміщення для утримання донорів, реципієнтів

інароджених трансплантантів. Зона «В» являється умовно відкритою. Тут розміщуються приміщення господарсько-побутового призначення: адмініс-

тративний корпус, транспортний цех, котельна тощо.

Пункт трансплантації ембріонів в господарстві розташовують поблизу приміщень для утримання тварин, яких використовують як донорів і ре-

ципієнтів, його можна будувати в блоці з тваринницькими приміщеннями.

Лабораторно-технологічне приміщення центру і пункту повинномати окремий вхід для персоналу, манеж для санітарної обробки тварин перед операцією, операційну, передопераційну, стерильний бокс з передбоксником для первинної обробки ембріонів, приміщення для заморожування і збері-

гання ембріонів, комору для зберігання препаратів і реактивів, кімнату для персоналу і санвузол. Пункти трансплантації ембріонів є цехами сільського-

сподарського підприємства і створюються в державних племінних заводах,

племінних радгоспах, племінних фермах, експериментальних дослідних і уч-

бово-дослідних господарствах наказами обласних держплемоб'єднань, де визначаються їх спеціалізація за видами та породами сільськогосподар-

ських тварин, а також зона діяльності цих пунктів.

27

Донорами вважають тих самок, у яких одержують ембріони.

При відборі тварин в донорську групу керуються їх родовбДом", продуктивністю, повноцінністю статевої функції. Зокрема, враховується повноцінність і ритмічність статевих циклів, плодовитість, перебіг вагітності і родів. Виходячи з цього, перевагу віддають самкам середнього віку. Вважається, що донор через ембріони не передає збудників інфекційних та інвазійних захворювань. , Реципієнтами вважають тих самок, яким пересаджують чи підсаджують ембріони. їх частіше відбирають із фізіологічно зрілих молодих самок. Доцільно підбирати реципієнтів серед малопродуктивних, аборигенних тварин. Чим більша різниця в продуктивності донора і реципієнта, тим більший економічний ефект трансплантації. Вважається, що реципієнти не впливають на генотип приплоду, але повноцінне формування організму, несприйнятливість до захворювань приплоду цілком залежить від організму реципієнта.

Реципієнтів, як і донорів, відбирають в благополучних по інфекційних та інвазійних хворобах господарствах після діагностичних досліджень і карантину.

Синхронізація статевої охоти у донорів і реципієнтів — це приведення організмів цих тварин до однакового нервово-гуморального стану відносно дня статевого циклу. Як правило, реципієнтів синхронізують з донорами. Максимальні відхилення синхронізації не повинні перевищувати ± 1 добу. Кращі результати отримують при абсолютному збіганні в часі охоти донора і реципієнтів.

Синсхронізація буває природною і штучною.

Природною синхронізація буде в тому випадку, якщо статева охота і осіменіння у донора зберігається із спонтанною охотою у реципієнта. При штучній синхронізації статева охота реципієнтів викликається введенням простогландинів (естрофан, суперфан ін.) і лізисом жовтого тіла або ж — коітальним провокуванням овуляції (у кролів, тхорів, кішок).

Суперовуляція — множинна овуляція, досягається провокуванням дозрівання багатьох третинних фолікулів і виходом з них яйцеклітин. її використовують лише у корів, овець, кіз. Для су-перовуляції використовують гонадотропні гормони з високим вмістом фолікулостимулюючого гормону (КЖК, СЖК, ФСГ, графолон, фолікотропін і ін.).

Г Осіменіння донорів може проводитись як природно, так і штучно. Плідників відбирають за такими ж вимогами, як донорів і реципієнтів. Природне осіменіння проводиться у відповідності з загальними правилами до припинення охоти. Штучне осіменіння потребує збільшення дози сперми проти загальних правил в три рази і також проводиться до припинення проявів статевої охоти. Вимивання ембріонів проводять хірургічними і нехірургічними методами. Вважається, що хірургічні методи більш ефективні з точки зору абсолютної можливос-

ті одержання ембріонів. В той же час відзначається, що післяопераційні ускладнення — спайки — не дозволяють використо-

вувати донорів і реципієнтів більше трьох раз.

Пошук ембріонів проводиться візуально при допомозі бінокулярної лупи при 15—20- кратному збільшенні. Після нехірургічного вимивання ембріонів рідину з ембріонами заливають в бак і витримують 20 хвилин при і 37 °С. За цей час ембріони осідають на дно. Потім частину рідини відкачують методом сифону, залишаючи 60—100 мл. Залишок переносять на 2—З чашки Петрі, дно яких розкреслене на квадрати ЇХ 1 см. Якщо застосовують хірургічний метод трансплантації, то рідину зразу ж збирають в чашки Петрі.

Якщо в промивальній рідині багато слизу і крові, то до неї додають розчини для вимиваня ембріонів. Після додавання розчину осадок гомогенізується ї його центрифугують на протязі 3—5 хв при 3—5 тис. обертів/хв.

Після дослідження рідини чашки Петрі кілька разів коливають по колу, щоб виявити ембріони, які прилипли до стінок.

Знайдені ембріони піпеткою Пастера переносять на стерильні годинникові скельця або малі чашки Петрі з поживним середовищем для тимчасового зберігання ембріонів (промивальна рідина+ +20 % фетальної сироватки крові теляти або сироватки крові вівці чи оленя).

Якість ембріонів визначають методами: візуальної морфологічної оцінки, прижиттєвим фарбуванням з використанням люмінесцентних фарбників, культивуванням за межами організму на протязі 24—48 год.

Морфологічну оцінку якості ембріонів проводять під мікроскопом або бінокулярною лупою при 100—160-кратному збільшенні. Визначають стадію розвитку ембріонів (незапліднені яйцеклітини, ранні та пізні морули і бластоцити), а також їх якість (відмінні, добрі, задовільні, умовно придатні, непридатні).

Незапліднені яйцеклітини мають правильні сфери, прозорий пе-ривітеліновий простір, гомогенне розміщення цитоплазматичних тілець. Дегенеративні незапліднені яйцеклітини відрізняються деформацією прозорої оболонки; цитоплазма інколи займає весь перивітеліновий простір, відбувається зміщення ядра до одного з полюсів або периферії, нагадуючи ранню 7- денну бластоцисту.

Нормально розвинені ембріони мають рівномірні по ширині опалесцентні оболонки і цитоплазму з бластомерами в стані дроблення відповідно до віку ембріона.

Морула являє собою скупчення бластомерів не завжди однакових за розмірами із-за асинхронного дроблення. Цитоплазма гомогенна, бластомери мають полігональний зв'язок. Перивітеліновий простір вільний від гранул і включень.

28

У ранньої бластоцисти добре видно бластопорожнину, клітини диференційовані на трофобластичні та ембріобластичні. Перивіте-ліновий простір вузький, прозора оболонка, як і в попередніх стадіях, має товщину 15 мк.

Пізня бластоциста відрізняється наявністю великої порожнини, яка займає весь перивітеліновий простір. Клітини трофобласту сплющені, добре диференційовані від ембріобласту. Прозора оболонка сплющена, розтягнута. У бластоцист з 9-го дня відсутня прозора оболонка, добре виражена порожнина.

Т а бл иця 1

Шкала оцінки якості морул і бластоцист

Вперивітеліновому просторі Добре є гранули, включення, бластомери неоднакових розмірів, розміщені несиметрично, дещо стиснуті

Вперивітеліновому простоЗадовільно рі — гранули, включення, незначне стискання бластомерів, руйнування окремих бластомерів (частковий зародок)

Деформація прозорої обоУмовно лонки, часткове руйнування придатні бластомерів, порушення

зв'язків між ними, фрагментація цитоплазми, стискування бластомерів

Невідповідність стадії розНепривитку віку ембріона, дефекдатні ти прозорої оболонки (тріщини, відколки), розпад бластомерів, сильний їх стиск

29