V_N_Kovalev_Praktikum_po_farmakognozii

Т а б л и ц а 8

Термины, используемые для обозначения растворимости вещества (ГФУ, раздел 1.4)

Используют следующие описательные термины для характеристики герметичности упаковки:

хорошо закрытая упаковка (тара, контейнер) должна защищать содержимое от внешних факторов и от потери сырья при обычных условиях обращения, перевозки и хранения;

плотно укупоренная упаковка должна защищать содержимое от внешних факторов, от потери сырья, выцветания, поглощения влаги, испарения при обычных условиях обращения, перевозки и хранения. Эта тара допускает повторную плотную упаковку. Если необходимо открыть упаковку, то после этого следует снова обеспечить герметичность тары.

Защита от действия света. Растительное сырье требуется хранить в защищенном от света месте. Это достигается использованием упаковки (контейнера), устойчивой к свету, защищающей содержимое от влияния света либо за счет свойств материала тары, либо благодаря специальному покрытию тары. Кроме того, упаковку можно поместить во внешний контейнер, что обеспечивает такую защиту.

Единицы измерения. Во всех методах используется метрическая система и символы единиц измерения Международной системы единиц (СИ) — Systeme international d’Unites.

Используются следующие множительные приставки, которые указывают

Использование этих приставок показано на примере следующих единиц:

собой воду, находящуюся в волокнах хроматографической бумаги. Перед хроматографированием растворы анализируемых веществ наносят на бумагу.

Принципы и применение методов тонкослойной, газовой и жидкостной хроматографии в фармацевтическом анализе описаны в Государственной фармакопее Украины.

Тонкослойная хроматография (ТСХ). В тонкослойной хроматографии адсорбентом служит тонкий, равномерный слой (обычно толщиной около 0,24 мм) сухого мелкоизмельченного материала, нанесенного на стеклянную пластинку, алюминиевую фольгу или пластмассовую пленку. Подвижная фаза движется по поверхности пластинки под действием капиллярных сил. Хроматографический процесс зависит от адсорбента, его обработки и природы используемых растворителей. Во время хроматографирования пластинка находится в хроматографической камере (чаще всего изготовленной из стекла, чтобы можно было наблюдать движение подвижной фазы по пластинке), которая обычно насыщена парами растворителя. В качестве твердого носителя используют силикагель, кизельгур, окись алюминия, целлюлозу или ионообменную смолу. Тонкий слой можно пропитать буферными материалами, чтобы получить кислый, нейтральный или основный слой. Перед использованием пластинки могут быть активированы посредством нагревания в термостате при температуре от 100 до 105 °С в течение 1 ч. Методика вертикального и горизонтального элюирования изложены в ГФУ (раздел 2.2.27)

Широкий диапазон различных слоев в сочетании с многообразием систем растворителей дает почти неограниченную возможность изменять силу разделения веществ. Это делает тонкослойную хроматографию незаменимой в анализе растительного сырья и препаратов из него. Метод ТСХ эффективен, легок в исполнении и не требует дорогостоящего оборудования.

В испытаниях на подлинность ТСХ служит для сравнения поведения природных соединений в анализируемом ЛРС и стандартного образца, обычно аутентичного одному из действующих веществ в экстракте. Если оба вещества продвигаются во время хроматографического процесса на одинаковое расстояние и если оба вещества, смешанные и подвергнутые хроматографированию, движутся как единое вещество, можно предположить, что эти вещества идентичны. Это предположение может быть подтверждено повторением той же процедуры с использованием другой хроматографической системы. Если два вещества ведут себя идентично в трех совершенно различных системах, предположение об их идентичности вполне обосновано.

Величина удерживания Rf является основной характеристикой разделения веществ, которая используется для установления подлинности. Она показывает положение зоны вещества на хроматографической пластинке (рис. 2).

На полученной хроматограмме отношение расстояния, пройденного на адсорбенте данным веществом, к расстоянию, пройденному передним краем («фронтом») подвижной фазы, есть величина Rf, характерная для данного вещества в данной хроматографической системе. Отношение расстояний, пройденных испытуемым веществом и стандартным образцом, принимают за величину Rr.

Величину удерживания Rf рассчитывают по следующей формуле:

b Rf = —a ,

где a — расстояние от линии старта до линии фронта, пройденного системой растворителей, мм;

b — расстояние от линии старта до верхнего края пятна, мм;

вания (хроматограмме дают высохнуть, поворачивают под прямым углом и вновь хроматографируют, часто в иной системе растворителей, чем первоначально).

Проявляющие, или хромогенные реактивы. Для определения положения неокрашенного вещества на полученной хроматограмме обычно необходимо обрабатывать хроматограмму реактивом, который либо обугливает разделенные вещества, либо переводит их в окрашенные или флуоресцирующие производные. Проявляющие реактивы для обнаружения разделенных веществ наносят на пластинку посредством опрыскивания, обработки парами или погружения. Часто применяют и другой удобный метод: проводят хроматографию на пластинке, пропитанной веществом, сильно флуоресцирующим под воздействием коротковолнового ультрафиолетового света. Площади на пластинке, занятые веществами, поглощающими при той же длине волны, выглядят как темные пятна на флуоресцирующем фоне.

Хроматографическая камера представляет собой емкость с пришлифованной крышкой для обеспечения герметичности и с плоским дном или дном с двумя желобами из инертного прозрачного материала, соответствующими по размеру используемым полоскам бумаги или пластинкам. Для горизонтального элюирования хроматографическая камера имеет желоб для подвижной фазы и дополнительно содержит устройство для подачи подвижной фазы к неподвижной фазе.

Если нет других указаний, работу проводят в насыщенной камере. Для достижения таких условий стенки камеры выстилают фильтровальной бума-

гой и вливают количество подвижной фазы, достаточное для насыщения фильтровальной бумаги и образования слоя глубиной около 5 мм. Закрывают камеру и оставляют стоять не менее чем 1 ч при комнатной температуре.

Хроматографическая камера должна быть защищена от действия света, если предполагается, что исследуемые соединения могут быть светочувствительными. В любом случае камеру защищают от прямых солнечных лучей, чтобы на пластинке не образовались области повышенной температуры и не нарушалось правильное перемещение подвижной фазы.

Вертикальное элюирование. Если нет других указаний в частной статье, хроматографическое разделение выполняют восходящим способом в насыщенной атмосфере. Предпочтительно использовать такие подвижные фазы (системы), которые обеспечивают величины Rf в пределах от 0,3 до 0,7.

Методика. Наносят объем раствора, указанный в частной статье, в виде компактного пятна диаметром не более 4 мм либо в виде полосы (длиной от 5—10 и высотой от 1 до 2 мм). Для нанесения используют микропипетку, микрошприц или калиброванный капилляр. Пятно должно находиться на расстоянии около 1,5 см от нижнего края и отстоять не менее чем на 2 см от вертикальной стороны пластинки. Если на одной пластинке получают несколько хроматограмм, пятна следует располагать на расстоянии не менее 1,5 см друг от друга на линии старта, параллельной нижнему краю бумаги или пластинки. Когда растворитель испарится, пластинку помещают в камеру, стараясь установить ее как можно точнее в вертикальном положении; стартовые точки должны находиться выше уровня подвижной фазы. Камеру закрывают и выдерживают при постоянной температуре. Дают подвижной фазе подняться на предписанное расстояние, обычно на 10—15 см, вынимают пластинку, отмечают положение фронта растворителя, высушивают и обнаруживают пятна способом, указанным в частной статье.

Горизонтальное элюирование. Растворы анализируемых веществ наносят на хроматографическую пластинку. После испарения растворителей из нанесенных проб в желоб хроматографической камеры вводят с помощью шприца или пипетки достаточное количество подвижной фазы, помещают пластинку в камеру горизонтально и подсоединяют устройство для подачи подвижной фазы в соответствии с инструкцией производителя. Если указано

вчастной статье, пластинку элюируют, начиная одновременно с двух концов. Камеру закрывают и проводят хроматографирование при температуре от 20 до 25 °С. После того как подвижная фаза пройдет расстояние, указанное

вчастной статье, пластинку вынимают, сушат и обнаруживают пятна указанным способом.

Исследование и интерпретация хроматограмм. Хроматограммы изучают визуально в дневном и УФ-свете. Отмечают границы и окраску пятен. Измеряют и записывают расстояние от линии старта до верхней границы каждого пятна. Если указано в частной статье, то опрыскивают хроматограмму соответствующим реактивом. Основное пятно на хроматограмме, полученной для испытуемого раствора, сравнивают визуально с соответствующим пятном на хроматограмме, полученной для раствора стандартного образца, сравнивая

окраску (флюоресценцию в УФ-свете), размер и величину удерживания (Rf ) обоих пятен.

Проверка чувствительности. Чувствительность считается удовлетворительной, если пятно или полоса четко обнаруживается на хроматограмме, полученной с наиболее разбавленным раствором сравнения.

Проверка пригодности хроматографической системы. Хроматографическая система считается пригодной, если:

—на хроматограмме раствора сравнения, используемого для проверки пригодности хроматографической системы, четко выделяются пятна указанных в частной статье веществ;

—величина Rf основного пятна на хроматограмме испытуемого раствора должна быть около величины, указанной в частной статье;

—на хроматограмме раствора сравнения, используемого для проверки чувствительности хроматографической системы, пятно вещества должно быть видно четко.

Биологический анализ

Биологическую стандартизацию применяют в тех случаях, когда действующие вещества в исследуемом лекарственном сырье и препаратах не могут быть точно определены количественно химическими и физико-хи- мическими методами.

Например, для определения качества лекарственного сырья, содержащего сердечные гликозиды, пользуются методом биологической стандартизации. Сила действия препарата определяется на животных и выражается в единицах действия в 1 г сырья. Биологический анализ проводят в фармакологических лабораториях. Эта тема изучается в курсе фармакологии.

Люминесцентный анализ

Флюоресцентный метод основан на наблюдении флюоресценции (свечения) исследуемых веществ. Метод широко применяется в фармации, так как флюоресцирующие вещества часто встречаются среди лекарственных препаратов и в лекарственном сырье растительного происхождения.

Яркой флюоресценцией обладает витамин B2 (рибофлавин). Его нейтральные растворы в воде и спирте флюоресцируют желто-зеленым светом. Установлено, что флюоресцируют многие алкалоиды в твердом состоянии, например алкалоиды тропанового ряда: гиосциамин — флюоресцирует краснолиловым светом, скополамин — синим. Алкалоид стрихнин дает сине-зеленую флюоресценцию, берберин — золотисто-желтую, флюоресцируют и алкалоиды крестовников. Яркая флюоресценция характерна для антраценпроизводных, содержащихся в коре крушины, ревене, конском щавеле, марене красильной, для флавоноидов, кумаринов и некоторых других органических и неорганических соединений. В тех случаях, когда вещества лекарственных растений не люминесцируют, их обрабатывают проявляющими реактивами.

ТЕМА

1Определение подлинности лекарственного растительного сырья

Макроскопический анализ ЛРС

С помощью макроскопического анализа определяют подлинность лекарственного растительного сырья и некоторые показатели его доброкачественности.

Подготовка образца к анализу. Свежее сырье исследуют без предварительной обработки. Высушенное сырье (мелкие и кожистые листья, плоды, семена, кору и подземные органы) раскладывают на клеенке или темной бумаге для рассматривания невооруженным глазом, с помощью лупы (×6—10) или стереомикроскопа.

Сочные плоды, изменившие форму во время сушки, тонкие листья, цветки, смятые части растения (фрагменты стеблей с листьями и цветками) предварительно размягчают в количестве 2—5 штук во влажной камере или путем погружения на 5—10 мин в горячую воду.

Размягченное сырье раскладывают на стекле, клеенке или гладкой темной бумаге и тщательно распрямляют. Цветки исследуют вначале в цельном виде, а затем препарируют для рассмотрения внутреннего строения. В плодах изучают околоплодник и семена.

Внешний вид определяют визуально в сравнении со стандартным образцом или описанием в АНД. Последовательность органолептической характеристики ЛРС изложена в схемах (приложение 1, с. 432).

Размеры. Для крупных объектов (от 3 см и более) проводят 10—15 измерений миллиметровой линейкой. Мелкие объекты (размером до 3 см) раскладывают на миллиметровой бумаге, производят 20—30 измерений и рассчитывают среднее значение. Размер шаровидных семян определяют просеиванием через сито с округлыми отверстиями.

Цвет сырья определяют при дневном освещении. Отмечают цвет сырья на поверхности органа (для листьев — с обеих сторон), а также на изломе или разрезе сырья (корни, корневища, кора).

Запах определяют, растирая сырье между пальцами или в ступке. Иногда в АНД дается указание смочить измельченное сырье горячей водой для усиления запаха.

Вкус свежего и сухого сырья определяют непосредственной дегустацией (не проглатывая) или пробуют вкус 10 %-ного отвара.

NB! Вкус сырья ядовитых растений не определяют!

Дополнительно к внешнему осмотру нередко проводят простейшие качественные химические реакции на сухом сырье (на наличие крахмала, инулина, лигнина, слизи, гликозидов и др.), которые способствуют идентификации и выявлению доброкачественности ЛРС.

Качественные реакции проводят на сухом сырье, с порошком или соскобом, но чаще с извлечением из сырья. Качественные реакции будут проводиться на лабораторных занятиях, посвященных изучению отдельных классов природных соединений.

После макроскопического изучения и качественных реакций делают заключение о соответствии исследуемого образца наименованию, под которым он поступил на анализ, т.е. подтверждают подлинность сырья.

Работа в лаборатории

Задание. Проведите макроскопической анализ различных морфо логических групп ЛРС в соответствии с требованиями ГФ ХI, используя структур но логические схемы. Опишите ЛРС на основании сравнения с описанием в АНД и сформулируйте заключение о его подлинности.

1. Листья — Folia (ГФ ХI, вып.1, с. 252)

Листья как лекарственное растительное сырье представляют собой высушенные или свежие вполне развитые листья или отдельные листочки сложного листа с черешком, черешочками или без них.

Проведите макроскопический анализ образца листьев по схеме 7 (приложе ние 1) и установите подлинность сырья в сравнении с описанием ГФ ХI. Офор мите протокол по предложенному образцу.

ОБРАЗЕЦ ОФОРМЛЕНИЯ ПРОТОКОЛА

Для анализа поступили листья мать-и-мачехи — Folia Farfarae

Заключение: по внешнему виду анализируемые листья соответствуют описанию внешних признаков листьев мать-и-мачехи — Folia Farfarae;

ЛР мать-и-мачеха — Tussilago farfara L., сем. астровых (сложноцветных) —

Asteraceae (Compositae).

2. Цветки — Flores (ГФ ХI, вып. 1, с. 257)

Цветки как лекарственное растительное сырье представляют собой высушенные цветки, соцветия или их части, собранные в начале цвете-

ния или в фазу бутонизации. В мировой практике соцветия выделяют в отдельную морфологическую группу сырья — «Inflorescencia».

Проведите макроскопический анализ образца цветков или соцветий по схе ме 8 (приложение 1) и установите подлинность сырья в сравнении с описанием ГФ ХI. Запишите в лабораторном журнале основные диагностические признаки исследуемых цветков по образцу, сделайте заключение.

3. Плоды — Fructus (ГФ ХI, вып. 1, с. 258—261)

Плоды как лекарственное сырье представляют собой зрелые, высушенные или свежие плоды, соплодия и их части. Плод состоит из околоплодника (перикарпия) и семян.

4. Семена — Semina (ГФ ХI, вып. 1, с. 258—261)

Семена как лекарственное сырье представляют собой зрелые цельные семена и отдельные семядоли.

Проведите макроскопический анализ образца плодов или семян по схеме 9 (приложение 1) и установите подлинность сырья в сравнении с описанием ГФ ХI. Запишите в лабораторном журнале основные диагностические признаки иссле дуемых плодов (или семян) по образцу, сделайте заключение.

5. Травы — Herbae (ГФ ХI, вып. 1, с. 256)

Трава как лекарственное сырье представляет собой высушенные или свежие надземные части травянистых растений, собранные во время цветения, бутонизации или плодоношения. Сырье состоит из стеблей с листьями и цветками, отчасти с бутонами и незрелыми плодами. У одних растений собирают только верхушки определенной длины, у других — всю надземную часть. В редких случаях — надземную часть вместе с корнями.

Проведите макроскопический анализ образца травы по схеме 10 (приложе ние 1) и установите подлинность сырья в сравнении с описанием ГФ ХI. Запиши те в лабораторном журнале основные диагностические признаки исследуемой травы по образцу, сделайте заключение.

6. Кора — Cortex (ГФ ХI, вып. 1, с. 261)

Кора как лекарственное сырье представляет собой наружную, расположенную к периферии от камбия, часть стволов, ветвей и корней деревьев и кустарников. Кору, как правило, заготавливают весной в период сокодвижения и высушивают.

Проведите макроскопический анализ образца коры по схеме11 (приложе ние 1) и установите подлинность сырья в сравнении с описанием ГФ ХI. Запиши те в лабораторном журнале основные диагностические признаки исследуемой коры по образцу, сделайте заключение.

7. Корни, корневища, клубни, луковицы, клубнелуковицы — Radices, Rhizomata, Tubera, Bulbi, Bulbotubera (ГФ ХI, вып. 1, с. 263)

Корни, корневища, клубни, луковицы, клубнелуковицы как лекарственное сырье представляют собой высушенные, реже свежие, подземные органы многолетних травянистых растений, собранные осенью или ранней весной, очищенные или отмытые от земли, освобожденные от отмерших частей, остатков стеблей и листьев. Крупные подземные органы перед сушкой разрезают на части (вдоль или поперек).

По указанию преподавателя проведите макроскопический анализ одного из образцов вышеперечисленных групп сырья по схеме 12 (приложение 1) и устано вите подлинность сырья в сравнении с описанием ГФ ХI. Запишите в лаборатор ном журнале основные диагностические признаки исследуемого образца, сде лайте заключение.